補(bǔ)腎活血方調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad 信號(hào)通路治療宮腔粘連臨床研究

張敏敏 劉淑華

宮腔粘連是指因?qū)m腔操作、宮腔感染、生殖器結(jié)核等因素引起子宮內(nèi)膜基底層受損，致宮腔子宮內(nèi)膜纖維化，引起宮腔部分或完全封閉的疾病[1-2]。隨著婦科手術(shù)宮腔操作增加，性生活活躍等，宮腔粘連的發(fā)病率逐年升高，宮腔鏡手術(shù)雖已普遍應(yīng)用于宮腔粘連的治療，但其治愈率和妊娠率仍不令人滿意，有文獻(xiàn)報(bào)道雖然諸多醫(yī)者術(shù)后采用了各種防止宮腔粘連再?gòu)?fù)發(fā)及保護(hù)內(nèi)膜的方法，但宮腔粘連術(shù)后復(fù)發(fā)率仍居高不下，對(duì)于重度宮腔粘連復(fù)發(fā)率可高達(dá)20%～62.5%[3]。由于宮腔粘連嚴(yán)重影響生育期女性的生殖健康，故其發(fā)病機(jī)制及有效的治療方法成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的新方向。本研究擬檢測(cè)宮腔粘連患者增殖期子宮內(nèi)膜中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-betal，TGF-β1）及受體調(diào)節(jié)型Smad2、3（receptor-regulated Smads，Smad2/3）蛋白表達(dá)水平，探討其與宮腔粘連形成的關(guān)系，同時(shí)闡述中醫(yī)藥治療在宮腔粘連中的有效性，為今后臨床治療提供思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019 年9 月至2022 年9 月在杭州市中醫(yī)院住院行宮腔鏡治療的腎虛血瘀型宮腔粘連患者80 例，按隨機(jī)單盲法分為對(duì)照組（40 例）、實(shí)驗(yàn)組（40 例）。本研究獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批號(hào)：2020KY013）。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 宮腔粘連診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《婦科內(nèi)鏡學(xué)》（第二版）[4]、2015 年《宮腔粘連臨床診療中國(guó)專家共識(shí)》[5]的相關(guān)內(nèi)容制定：（1）有宮腔操作史或?qū)m腔感染史等；（2）臨床表現(xiàn)為經(jīng)量改變、閉經(jīng)、周期性下腹痛、繼發(fā)不孕、妊娠丟失等；（3）影像學(xué)檢查提示有內(nèi)膜粘連可能，如子宮內(nèi)膜菲?。?～5 mm）、內(nèi)膜線不連續(xù)或回聲不均、與既往檢查相比宮腔形態(tài)失常等；（4）宮腔鏡檢查提示宮腔粘連。中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn)：參照第十版《中醫(yī)婦科學(xué)》[6]、第九版《中醫(yī)診斷學(xué)》[7]及本院兩位主任級(jí)中醫(yī)婦科醫(yī)師共同擬定腎虛血瘀型相關(guān)內(nèi)容：主癥：月經(jīng)較前減少或點(diǎn)滴，甚或閉經(jīng)；經(jīng)色暗，伴血塊。次癥：經(jīng)行小腹刺痛或脹痛、腰膝酸軟、頭暈耳鳴、失眠健忘、夜尿頻多、口干不欲飲、面色晦暗等；舌脈：舌質(zhì)淡暗或紫暗，或有瘀斑、瘀點(diǎn)，脈沉遲或沉澀。具備以上主癥及次癥2 項(xiàng)者，結(jié)合舌脈，可診斷為腎虛血瘀證。

1.3 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合本課題西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）中醫(yī)四診符合腎虛血瘀證型；（3）閉經(jīng)者人工周期實(shí)驗(yàn)陰性；（4）符合生育期標(biāo)準(zhǔn)；（5）進(jìn)入本研究前1 個(gè)月內(nèi)未進(jìn)行同類中藥或激素治療；（6）患者對(duì)本研究知情，標(biāo)本采集均取得患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并有心腦血管、肝、腎及造血系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病者；（2）具有其他內(nèi)分泌疾病，如先天性腎上腺皮質(zhì)增生、分泌雄激素的腫瘤和庫(kù)欣綜合征、甲狀腺疾病等；（3）生殖系統(tǒng)先天性缺陷和畸形；（4）子宮內(nèi)膜惡性病變、子宮內(nèi)膜處于分泌期、生殖系統(tǒng)結(jié)核、生殖道炎癥或未按時(shí)用藥無(wú)法判斷療效或資料不全等影響療效及安全性判斷者；（5）對(duì)本課題中涉及藥物過(guò)敏者。

1.4 治療方法 排除手術(shù)禁忌后，兩組患者均于子宮內(nèi)膜增殖期（月經(jīng)干凈后3～7 d，閉經(jīng)者根據(jù)激素判斷）全麻下行宮腔鏡下宮腔粘連分解術(shù)，術(shù)中采用宮腔內(nèi)操作系統(tǒng)[由卡爾史托斯（上海）公司提供]，配備宮腔鏡微型剪刀、電視腹腔鏡及攝像系統(tǒng)、持續(xù)灌流膨?qū)m泵和電工作站。0.9%生理鹽水持續(xù)膨?qū)m，膨?qū)m壓力不超過(guò)120 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），宮腔鏡下檢查，行宮腔粘連評(píng)分，分離粘連，盡可能恢復(fù)宮腔正常解剖結(jié)構(gòu)，術(shù)后放置適合宮腔大小的宮型環(huán)1枚，術(shù)中采集少許患者子宮內(nèi)膜組織及宮腔粘連組織作為檢測(cè)標(biāo)本。

術(shù)后第2 天兩組患者均開(kāi)始予以戊酸雌二醇片（補(bǔ)佳樂(lè)，拜耳，批號(hào)432A，規(guī)格1 mg/片）口服，2 mg/次，1 天2 次，共21 d，后7 d 加服地屈孕酮片（達(dá)芙通，Abbott Healthcare Products B.V，批號(hào)364701，規(guī)格10 mg/片）10 mg/次，1 天2 次。停藥轉(zhuǎn)經(jīng)后第5 天開(kāi)始口服第二周期，同法完成第三周期。術(shù)后第2天，實(shí)驗(yàn)組在對(duì)照組基礎(chǔ)上加用補(bǔ)腎活血方，藥物組成：紫石英、熟地黃、杜仲、菟絲子、當(dāng)歸各15 g，續(xù)斷、山萸肉、桃仁、紅花各10 g，川芎6 g，赤芍、炒白芍、茯苓、丹參各10 g，雞血藤15 g，香附9 g，隨證加減（中藥制片由杭州華東中藥飲片有限公司提供，由本院中藥房統(tǒng)一煎制），非經(jīng)期服用，經(jīng)期停藥，連服3 個(gè)月。3 個(gè)月后兩組均于月經(jīng)干凈3～7 d 再次行宮腔鏡探查加取環(huán)術(shù)。

1.5 觀察指標(biāo) （1）宮腔粘連評(píng)分：參照2015 年《宮腔粘連臨床診療中國(guó)專家共識(shí)》[5]；（2）中醫(yī)證候評(píng)分：主癥：經(jīng)量正常計(jì)0 分，較前減少＜1/2 計(jì)1 分，減少＞1/2 或量點(diǎn)滴計(jì)2 分，閉經(jīng)計(jì)3 分；次癥：經(jīng)行小腹刺痛或脹痛、腰膝酸軟、頭暈耳鳴、失眠健忘、夜尿頻多、口干不欲飲、面色晦暗等符合以上1～2 條計(jì)1分，3～4 條計(jì)2 分，5～6 條計(jì)3 分，7 條以上者計(jì)4分，無(wú)計(jì)0 分；舌脈：舌暗紫或紫紅，或有瘀斑瘀點(diǎn)，脈弦澀，以上舌脈單項(xiàng)各計(jì)1 分，無(wú)計(jì)0 分。（3）子宮內(nèi)膜TGF-β1 及Smad2/3 蛋白表達(dá)：兩次手術(shù)標(biāo)本均采用甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，TGF-β1 及Smad2/3 的蛋白表達(dá)檢測(cè)采用免疫組化法顯色（兔抗人TGF-β1 及其SP 免疫組化試劑盒均購(gòu)自江蘇親科生物研究中心有限公司，批號(hào)AF1027；兔抗人Smad2/3 抗體及其SP 免疫組化試劑盒購(gòu)自愛(ài)必信生物科技有限公司，貨號(hào)abs146156），以細(xì)胞漿和細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野細(xì)胞計(jì)數(shù)均達(dá)100 個(gè)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率，無(wú)陽(yáng)性染色為0 分；陽(yáng)性染色1%～25%計(jì)為1 分；陽(yáng)性染色26%～50%計(jì)為2 分；陽(yáng)性染色51%～75%計(jì)為3 分；陽(yáng)性染色高于75%計(jì)為4分；計(jì)算5 個(gè)視野圖片平均值[8]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用IBM SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布、近似正態(tài)分布采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，呈偏態(tài)分布以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（P25，P75）］表示；計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)及百分率（%）表示。符合正態(tài)分布、近似正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，組內(nèi)治療前后比較采用配對(duì)t 檢驗(yàn)；等級(jí)數(shù)據(jù)、偏態(tài)分布的數(shù)據(jù)，組間比較采用卡方檢驗(yàn)或非參數(shù)秩合檢驗(yàn)（Mann-Whitney 檢驗(yàn)），組內(nèi)比較采用配對(duì)秩和檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Kendall 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組宮腔粘連患者一般資料比較 兩組患者年齡、宮腔操作次數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見(jiàn)表1。

表1 兩組宮腔粘連患者一般資料比較

2.2 兩組宮腔粘連患者治療前后粘連評(píng)分比較 治療前，兩組患者宮腔粘連評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，兩組粘連評(píng)分較治療前均下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組治療后粘連評(píng)分下降低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩組宮腔粘連患者治療前后宮腔粘連評(píng)分比較（分，±s）

表2 兩組宮腔粘連患者治療前后宮腔粘連評(píng)分比較（分，±s）

注：對(duì)照組采用西醫(yī)治療；實(shí)驗(yàn)組在對(duì)照組基礎(chǔ)上加用補(bǔ)腎活血方治療

組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組t 值P 值例數(shù)40 40治療前13.28±4.45 12.98±3.68 0.329 0.743治療后9.38±3.05 6.85±3.47 3.457 0.001 t 值6.466 12.570 P 值＜0.001＜0.001

2.3 兩組宮腔粘連患者治療前后中醫(yī)證候積分比較治療前，兩組中醫(yī)證候積分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，兩組中醫(yī)證候積分較治療前均下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組治療后中醫(yī)證候積分低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 兩組宮腔粘連患者治療前后中醫(yī)證候積分比較（分，±s）

表3 兩組宮腔粘連患者治療前后中醫(yī)證候積分比較（分，±s）

注：對(duì)照組采用西醫(yī)治療；實(shí)驗(yàn)組在對(duì)照組基礎(chǔ)上加用補(bǔ)腎活血方治療

組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組t 值P 值例數(shù)40 40治療前7.48±1.26 7.03±1.39 1.519 0.133治療后5.48±1.55 1.45±1.22 12.900＜0.001 t 值8.832 26.361 P 值＜0.001＜0.001

2.4 兩組宮腔粘連患者治療前后TGF-β1、Smad2/3蛋白表達(dá)評(píng)分比較 治療前，兩組患者TGF-β1、Smad3 表達(dá)評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，兩組TGF-β1 及Smad2/3 的蛋白細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)性表達(dá)較治療前均下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。治療后，實(shí)驗(yàn)組蛋白表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 兩組宮腔粘連患者治療前后TGF-β1、Smad2/3 蛋白表達(dá)評(píng)分比較［分，M（P25，P75）］

3 討 論

宮腔粘連是子宮內(nèi)膜損傷后異常修復(fù)、纖維化形成的結(jié)果，TGF-β1 是參與宮腔粘連發(fā)生的重要角色，也是目前該病機(jī)制中被研究最為廣泛的因子。有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)下調(diào)纖維化基因，可抑制宮腔粘連患者子宮內(nèi)膜中TGF-β1 的表達(dá)，從而阻斷TGF-β1的Smad 信號(hào)路徑，抑制子宮內(nèi)膜纖維化[9]。TGF-β1不斷促生細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular tatrixc，ECM），使ECM 代謝穩(wěn)態(tài)失衡，從而維持成纖維細(xì)胞活力，促使組織纖維化，增加基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）等對(duì)ECM 的降解和重塑功能，可間接減弱TGF-β1 的組織纖維化作用[10-12]。這為本研究提供了思路。

宮腔粘連可歸屬中醫(yī)學(xué)“經(jīng)水澀少”“經(jīng)閉”“經(jīng)行腹痛”“斷緒”“癥瘕”等相關(guān)范疇。李東垣曰：“經(jīng)閉不行有三，婦人脾胃久虛，形體羸弱。氣血俱衰，以致經(jīng)水?dāng)嘟^，或因勞心，心火上心?！薄妒?jì)總錄》言：“女人假血為本，以氣為用，血?dú)饣?，則澀而不行?！狈郊s之道：“氣血結(jié)逆于臟腑經(jīng)絡(luò)，而經(jīng)于是乎不調(diào)矣?！惫逝咏?jīng)血異常皆與“虛”“瘀滯”有關(guān)，當(dāng)胎產(chǎn)損傷及金刃器械損傷胞宮、胞脈、沖任、腎氣，動(dòng)搖陰陽(yáng)、封藏之本，則生殖失常。中醫(yī)認(rèn)為，宮腔粘連的病機(jī)要點(diǎn)是“虛”和“瘀滯”，沖任損害是發(fā)病病因，治宜補(bǔ)腎活血、化瘀調(diào)經(jīng)，本課題研究顯示，補(bǔ)腎活血方能夠下調(diào)纖維化關(guān)鍵啟動(dòng)因子表達(dá)，抑制子宮內(nèi)膜纖維化，同時(shí)減少炎癥，改善患者臨床癥狀。

本研究所用補(bǔ)腎活血方中重用紫石英溫腎助陽(yáng)，熟地黃益腎滋陰，陰陽(yáng)并治，合為君藥。杜仲、續(xù)斷、菟絲子、山萸肉四藥同氣相求，助君藥使腎陰得養(yǎng)，腎陽(yáng)得化。桃仁味苦，善破血行瘀，紅花味辛，可活血通經(jīng)，祛瘀止痛，二者一升一降，一散一收，活血祛瘀效增。當(dāng)歸為“血中氣藥”，川芎為“氣中血藥”，兩藥同用，潤(rùn)燥相宜，補(bǔ)而不膩，散而不耗，祛瘀生新。同時(shí)方中加入赤芍、丹參既能涼血又能散瘀，可除血分郁熱，蓋如葉天士所說(shuō)：“入血恐耗血?jiǎng)友?，直須涼血散血”。雞血藤善補(bǔ)血、活血，性活潑靈動(dòng)，又可通經(jīng)絡(luò)阻滯，如《飲片新參》言：“去瘀血，生新血，流利經(jīng)脈”。以上組方使活血化瘀效增而新血得生力強(qiáng)。佐以炒白芍養(yǎng)血和血，茯苓利水滲濕，香附調(diào)暢氣機(jī)，使氣血調(diào)達(dá)，沖任通暢，月經(jīng)得至。諸藥合用，共奏補(bǔ)腎活血之效。

本研究中，兩組患者治療后中醫(yī)證候積分較治療前均下降，且治療后實(shí)驗(yàn)組中醫(yī)證候積分明顯低于對(duì)照組，說(shuō)明補(bǔ)腎活血方聯(lián)合雌孕激素人工周期治療效果優(yōu)于單用西藥治療，能更好地改善此類患者的臨床癥狀。這與本方劑中藥物有雌激素樣作用及抗氧化、抗炎、改善循環(huán)等作用有關(guān)，與臨床相關(guān)研究相符[13-20]。兩組患者治療后宮腔粘連評(píng)分較治療前均下降，說(shuō)明宮腔粘連分解術(shù)輔以適當(dāng)?shù)乃幬?、機(jī)械干預(yù)，對(duì)內(nèi)膜纖維化、粘連等有改善作用；這與臨床現(xiàn)有治療方案契合[21]。治療后實(shí)驗(yàn)組宮腔粘連積分明顯低于對(duì)照組，證明補(bǔ)腎活血方聯(lián)合雌孕激素人工周期治療能夠更有效地降低宮腔粘連程度，預(yù)防宮腔粘連復(fù)發(fā)。這與本研究中當(dāng)歸、川芎、桃仁等藥物有逆轉(zhuǎn)纖維化進(jìn)程或抗纖維化作用等有關(guān)[22-23]。經(jīng)Kendall 檢驗(yàn)，本研究中子宮內(nèi)膜TGF-β1 水平與Smad 的關(guān)聯(lián)性存在著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)合本課題實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明，TGF-β1 水平、Smad2/3 蛋白表達(dá)水平與宮腔粘連程度呈正比，此與臨床諸研究[9-11]相符。治療后實(shí)驗(yàn)組蛋白表達(dá)評(píng)分明顯低于對(duì)照組，說(shuō)明針對(duì)本研究中腎虛血瘀型宮腔粘連患者，加用補(bǔ)腎活血方可幫助下調(diào)TGF-β1、Smad2/3 蛋白表達(dá)，抑制纖維化，與臨床報(bào)道相符[13-14，24]。綜上可知，補(bǔ)腎活血方能夠下調(diào)纖維化關(guān)鍵啟動(dòng)因子表達(dá)，抑制子宮內(nèi)膜纖維化，同時(shí)減少炎癥，改善患者臨床癥狀。

目前臨床對(duì)宮腔粘連研究已很廣泛，但缺乏統(tǒng)一有效的指南性方案，且其發(fā)病機(jī)制尚待進(jìn)一步闡明，中醫(yī)藥治療是西醫(yī)治療宮腔粘連以外的一種優(yōu)選補(bǔ)充方案，中西醫(yī)并治可以更好地緩解宮腔粘連相關(guān)臨床癥狀，降低術(shù)后再粘連，值得臨床深入研究和推廣。