CXCL14 在慢性危重癥模型小鼠心功能損傷中的作用

周詩涵 曾龍歡 徐漢喬 趙 東 鄭永科

近年來生命支持水平不斷提高，越來越多的危重患者得以度過疾病急性期，但仍有部分患者難以完全恢復(fù)，病情進展至慢性狀態(tài)，需要長期重癥監(jiān)護治療，稱為慢性危重癥（chronic critical illness，CCI），其特點是存在持續(xù)性炎性反應(yīng)、免疫抑制和分解代謝狀態(tài)[1-2]。CCI 不僅死亡率高、預(yù)后不佳，還占用大量醫(yī)療資源，造成了嚴重的家庭和社會負擔[3-6]。心功能損傷是導(dǎo)致CCI 及其不良預(yù)后的重要原因[7]。臨床研究表明，CCI 中心力衰竭的發(fā)生率約為62.7%，而一年期死亡率可達18.1%[8-9]。因此，針對CCI 心功能損傷開展相關(guān)研究，對改善CCI 患者預(yù)后十分重要。CXC 趨化因子配體14（CXCL14）為CXC 趨化因子家族中ELR 亞家族中的一員，能反映巨噬細胞浸潤，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)，在骨骼肌損傷和心肌梗死中都有重要作用[10-12]。但是，CXCL14 在CCI 心功能損傷中的作用尚不明確。因此，本研究在既往研究的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建CCI 動物模型，探討CXCL14 在CCI 心功能損傷中的作用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 選用8～10 周齡雄性野生型C57BL/6 小鼠共24 只，體質(zhì)量450～600 g，所有動物購自浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2022-0004。各組小鼠均于溫度（25±2）℃、濕度40%～70%的SPF 房內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進行實驗，飼養(yǎng)期間允許小鼠自由攝食飲水，通過腹腔注射過量戊巴比妥鈉麻醉安樂死。本研究由浙江大學實驗動物福利倫理審查委員會批準（編號：17475），并按照《實驗動物護理和使用指南》進行。

1.2 試 劑 重組CXCL14（批號ab50043）、多克隆抗CXCL14 抗體（批號ab217307）、人CXCL14 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號ab213771）購自abcam 公司；大鼠 腦鈉素（BNP）ELISA 試劑 盒（Elabscience 公司，批號E-EL-R0126c）；蘇木素伊紅染色（HE）試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號20220324）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（中國碧云天公司，批號P0012）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（杭州賢至生物有限公司，AB-P-R 001，1∶1000）；α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）（美國Affinity Biosciences公司，AF1032，1∶1000）；Ⅲ型膠原蛋白（CollagenⅢ）（美國Affinity Biosciences 公司，AF5457，1∶1000）。

1.3 主要儀器 MyLab X5 VET 獸醫(yī)超聲波檢查儀（意大利Esaote 公司）；M1324R 微量高速冷凍離心機（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；HR40-Ⅱ-A2 型醫(yī)用凈化工作臺（青島海爾特種電器有限公司）；WES 全自動蛋白定量分析儀（美國Protein Simple 公司）；DFC 7000T 型倒置顯微鏡（德國Leica 公司）；Tissue-Tearor 手持式勻漿機（中國凈信公司）。

2 實驗方法

2.1 CCI 模型建立及分組 按隨機數(shù)字表法將24只小鼠分成假手術(shù)組、CCI 組、CCI+CXCL14 組和CCI+Anti-CXCL14 組，每 組6 只。CCI 組、CCI+CXCL14 組和CCI+Anti-CXCL14 組小鼠予腹膜內(nèi)注射4%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）麻醉，行盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)，術(shù)后皮下注射生理鹽水（10 mL/kg）進行液體復(fù)蘇，一次性口服撲熱息痛（100 mg/kg）。假手術(shù)組小鼠腹膜內(nèi)注射4%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）麻醉，腹部切口暴露，但不結(jié)扎和穿刺，隨后縫合腹腔。按分組情況，CCI 組小鼠予磷酸緩沖鹽溶液（PBS）2 μL 心內(nèi)注入；CCI+CXCL14 組小鼠予重組CXCL14 1 μg 心內(nèi)注入；CCI+Anti-CXCL14 組小鼠予多克隆抗CXCL14抗體1 μg 心內(nèi)注入。所有小鼠可以自由飲水和進食，觀察10 d，若出現(xiàn)明顯的慢性膿毒癥表現(xiàn)：肌肉萎縮、毛發(fā)豎立、過度興奮、結(jié)膜出血、肝微膿腫、脾大和腹水混濁（腹水和血培養(yǎng)物為大腸桿菌）等，提示造模成功。

2.2 超聲心動圖評估心功能 采用獸醫(yī)超聲波檢查儀，S3116 探頭，20 MHz 頻率檢測。麻醉后，用脫毛膏脫去成像目標區(qū)的毛發(fā)，涂抹耦合劑后將探頭置于動物體表進行圖像采集。測量各組小鼠左心室射血分數(shù)（LVEF）。

2.3 測定BNP 水平 經(jīng)尾靜脈采血1.5 mL，以轉(zhuǎn)速3000 r/min，離心半徑10 cm，離心15 min，取上清液，按試劑盒說明進行ELISA 檢測，使用BNP 條帶密度測量數(shù)據(jù)的標準化比率（fold change）計算BNP 水平的變化。

2.4 測定心肌組織CXCL14 含量 取心肌組織，用生理鹽水洗凈并充分吸干水分，以9∶1 的比例將生理鹽水與心肌組織加入離心管中，用眼科小剪刀將心肌組織剪成小碎片，采用組織勻漿機制成10%心肌組織勻漿液，按ELISA 試劑盒說明檢測心肌組織CXCL14 含量。

2.5 HE 染色觀察心肌組織 取小鼠心肌組織，經(jīng)甲醛固定、脫水、透明處理后，進行石蠟包埋處理。蠟塊通過病理切片機切成5 μm 厚切片。切片入Mayer氏蘇木素染液染色5 min，流水沖洗。切片入1%的鹽酸乙醇分化5 s，流水沖洗返藍。伊紅染色1 min，根據(jù)染色情況，流水沖洗。切片脫水后，中性樹膠封片，鏡檢。

2.6 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）檢測 組織經(jīng)RIPA裂解液裂解后，使用BCA 蛋白定量試劑盒完成蛋白濃度檢測。等濃度的蛋白樣本通過SDS-PAGE 分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。然后使用含5%脫脂奶粉的TBST 浸泡PVDF 膜，室溫搖床封閉2 h。封閉液稀釋相應(yīng)的一抗（GAPDH，1∶1000；α-SMA，1∶1000；CollagenⅢ，1∶1000），并將PVDF 膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃孵育過夜。PVDF 膜經(jīng)TBST 充分洗滌后，浸泡至封閉液稀釋的HRP 標記二抗孵育液，37 ℃搖床孵育2 h。然后將ECL 試劑盒中的工作液滴加于PVDF 膜上，使用掃描儀完成膠片掃描，并使用BandScan 軟件分析膠片灰度值。

2.7 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用Prism9.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組小鼠心功能指標比較 與假手術(shù)組小鼠比較，CCI 組小鼠LVEF 顯著降低，BNP 水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與CCI 組比較，CXCL14 重組蛋白處理可進一步降低CCI 模型小鼠LVEF（P＜0.05），并且升高BNP 水平（P＜0.01）；CXCL14 抗體處理可抑制CCI 模型小鼠LVEF 降低（P＜0.01），抑制BNP 水平升高（P＜0.01）。見表1。

表1 各組小鼠心功能指標比較（±s）

表1 各組小鼠心功能指標比較（±s）

注：CCI 為慢性危重癥；CXCL14 為CXC 趨化因子配體14；Anti-CXCL14 為CXC 趨化因子配體14 抗體；LVEF 為左心室射血分數(shù)；BNP 為腦鈉素；與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與CCI 組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

組別假手術(shù)組CCI 組CCI+CXCL14 組CCI+Anti-CXCL14 組鼠數(shù)6666 LVEF（%）74.31±2.16 59.17±3.35a 50.97±3.52b 69.29±2.08c BNP（fold change）6.07±0.45 11.27±0.50a 14.73±0.74c 8.77±0.40c

3.2 各組小鼠心肌組織HE 染色 與假手術(shù)組比較，CCI 模型小鼠心肌細胞體積增大，心肌纖維排列散亂，且部分細胞出現(xiàn)細胞質(zhì)空泡化。與CCI 組比較，CXCL14 重組蛋白可進一步增加CCI 模型小鼠心肌細胞體積增大以及細胞質(zhì)空泡化，心肌纖維排列散亂加重，CXCL14 抗體注射處理則可抑制CCI 模型小鼠心肌細胞體積增大及細胞質(zhì)空泡化，改善心肌纖維排列散亂的情況。見圖1。

圖1 各組小鼠心肌組織HE 染色（×200）

3.3 各組小鼠心肌組織CXCL14 表達水平比較 與假手術(shù)組小鼠比較，CCI 組小鼠心肌組織CXCL14 含量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與CCI 組比較，CXCL14 重組蛋白可進一步增加CXCL14 含量，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），CXCL14 抗體注射處理可降低心肌組織CXCL14 含量，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠心肌組織CXCL14 表達水平比較（ng/mg protein，±s）

表2 各組小鼠心肌組織CXCL14 表達水平比較（ng/mg protein，±s）

注：CCI 為慢性危重癥；CXCL14 為CXC 趨化因子配體14；Anti-CXCL14 為CXC 趨化因子配體14 抗體；與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與CCI 組比較，bP＜0.01

組別假手術(shù)組CCI 組CCI+CXCL14 組CCI+Anti-CXCL14 組鼠數(shù)6666 CXCL14 0.40±0.03 0.55±0.02a 0.75±0.05b 0.54±0.05

3.4 各組小鼠心肌組織α-SMA、CollagenⅢ表達水平比較 與假手術(shù)組比較，CCI 組小鼠心肌組織α-SMA 和CollagenⅢ表達增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與CCI 組比較，CXCL14 重組蛋白可進一步升高心肌纖維化相關(guān)蛋白α-SMA，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），CollagenⅢ表達水平略有升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；CXCL14 抗體注射處理則可抑制CCI 模型小鼠心肌組織α-SMA 和CollagenⅢ表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖2 和表3～4。

圖2 各組小鼠心肌組織α-SMA、CollagenⅢ表達水平比較

表3 假手術(shù)組、CCI 組、CCI+CXCL14 組小鼠心肌組織α-SMA 和CollagenⅢ相對表達水平比較（±s）

表3 假手術(shù)組、CCI 組、CCI+CXCL14 組小鼠心肌組織α-SMA 和CollagenⅢ相對表達水平比較（±s）

注：CCI 為慢性危重癥；CXCL14 為CXC 趨化因子配體14；α-SMA 為α-平滑肌肌動蛋白；CollagenⅢ為Ⅲ型膠原蛋白；與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與CCI 組比較，bP＜0.05

組別假手術(shù)組CCI 組CCI+CXCL14 組鼠數(shù)666 α-SMA 0.31±0.05 0.66±0.02a 0.79±0.05b CollagenⅢ0.40±0.04 0.64±0.04a 0.75±0.06

表4 假手術(shù)組、CCI 組、CCI+anti-CXCL14 組小鼠心肌組織α-SMA 和CollagenⅢ相對表達水平比較（±s）

表4 假手術(shù)組、CCI 組、CCI+anti-CXCL14 組小鼠心肌組織α-SMA 和CollagenⅢ相對表達水平比較（±s）

注：CCI 為慢性危重癥；Anti-CXCL14 為CXC 趨化因子配體14 抗體；α-SMA 為α-平滑肌肌動蛋白；CollagenⅢ為Ⅲ型膠原蛋白；與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與CCI 組比較，bP＜0.01

組別假手術(shù)組CCI 組CCI+Anti-CXCL14 組鼠數(shù)666 α-SMA 0.40±0.02 0.77±0.04a 0.61±0.03b CollagenⅢ0.35±0.03 0.80±0.05a 0.57±0.04b

4 討 論

導(dǎo)致CCI 的因素很多，除了呼吸、營養(yǎng)等因素外，心功能損傷也不能忽視。有研究發(fā)現(xiàn)，即使經(jīng)過抗生素治療，膿毒癥帶來的心肌損傷仍然會導(dǎo)致心肌重構(gòu)，造成心功能損傷，是CCI 發(fā)生的重要原因[13]。本研究通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，CCI 動物模型組BNP 升高、LVEF 降低，說明CCI 模型小鼠存在心功能損傷，與既往臨床研究結(jié)果一致?？赡艿臋C制是CCI 大多伴有膿毒血癥，感染引起的全身炎癥反應(yīng)導(dǎo)致心肌細胞對腎上腺素反應(yīng)遲鈍，收縮蛋白對鈣離子轉(zhuǎn)運水平下降，使得心臟舒張和收縮功能降低，進而損傷心功能[14]。因此，針對心功能損傷開展相關(guān)研究有利于改善CCI 的預(yù)后。

作為趨化因子家族中的一員，CXCL14 主要表達于一些免疫細胞，可趨化樹突狀細胞及自然殺傷細胞等的募集，參與介導(dǎo)炎癥免疫反應(yīng)[15-16]。已有研究表明，CXCL14 與心肌梗死、感染性疾病有關(guān)[12，17]，但是CXCL14 在CCI 心功能損傷中的作用鮮有報道。本研究發(fā)現(xiàn)，CCI 模型小鼠心肌組織CXCL14 含量顯著高于假手術(shù)組，與BNP 和LVEF 的變化趨勢一致，并且伴有心肌細胞體積增大、排列紊亂以及細胞質(zhì)空泡化。此外，心肌纖維化相關(guān)的心肌α-SMA 和CollagenⅢ蛋白表達亦顯著增加。提示CXCL14 可能通過促進心肌纖維化造成心功能損傷。CXCL14 作為趨化因子，可以觸發(fā)炎癥細胞發(fā)生遷移而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[18]。Schories 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，心功能損傷患者CXCL14 表達水平高于正常心功能患者。另一項動物研究也表明，CXCL14 表達下調(diào)能夠恢復(fù)受損的心肌細胞增殖，最終改善心臟功能，在一定程度上均證實了我們的結(jié)論[20]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CCI 模型小鼠中存在心功能損傷，可能與CXCL14 上調(diào)誘導(dǎo)心肌纖維化相關(guān)，提示CXCL14 可能在CCI 心功能損傷中發(fā)揮重要作用。然而，CXCL14 在心功能損傷中的具體調(diào)控機制以及在CCI 中的臨床價值尚不明確，有待進一步研究。