基于PI3K/AKT 通路探討何氏補(bǔ)腎厚膜方改善大鼠薄型子宮內(nèi)膜的作用機(jī)制

徐新亞 陳碧霞 吳曉婷

薄型子宮內(nèi)膜（thin endometrium，TE）是近年來生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，是影響輔助生殖技術(shù)（ART）臨床妊娠結(jié)局的關(guān)鍵因素[1]。2019 年加拿大生育和男科學(xué)會(huì)（CFAS）指南規(guī)定，人絨毛膜促性腺激素給藥當(dāng)天子宮內(nèi)膜厚度＜8 mm，冷凍移植周期子宮內(nèi)膜厚度＜7 mm 代表TE[2]。TE 的發(fā)病與炎癥、醫(yī)源性操作等有關(guān)，然而相關(guān)機(jī)制尚不清楚。研究表明，除了子宮內(nèi)膜厚度的差異外，TE 患者還患有血管發(fā)育不良，導(dǎo)致子宮動(dòng)脈血流阻力顯著增加，從而抑制子宮內(nèi)膜容受性[3]。何氏補(bǔ)腎厚膜方（Heshi Bushen Houmo Prescription，HBHP）是何氏婦科多年經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，臨床應(yīng)用可以改善缺血后子宮內(nèi)膜血流、增加內(nèi)膜厚度。然而，目前關(guān)于HBHP 的作用機(jī)制缺乏相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。磷脂酰肌醇激酶（phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信號(hào)通路激活是血管生成的調(diào)節(jié)中心[4]。研究證實(shí)，PI3K/AKT 信號(hào)通路抑制血管生成障礙導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性降低與TE 不孕癥的發(fā)生有關(guān)[5]。因此，本研究基于PI3K/AKT 信號(hào)傳導(dǎo)通路探究HBHP治療TE 的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物 48 只SPF 級(jí)雌性SD 大鼠（6～8 周，180～220 g）購自上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)營部[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0006]。動(dòng)物飼養(yǎng)在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2021-0012]。本實(shí)驗(yàn)遵循浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的相關(guān)管理和規(guī)定。

1.2 藥物與試劑 HBHP 方藥組成：紫河車3 g，鹿角片、仙靈脾各10 g，菟絲子20 g，覆盆子15 g，枸杞子12 g，熟地10 g，當(dāng)歸15 g，川芎、炒白芍、赤芍、香附各10 g，黃芪15 g，由本院中藥房提供（杭州華東中藥飲片有限公司，批號(hào)20200628），用蒸餾水浸泡藥物0.5 h，煮沸0.5 h 取濾液，煮兩次合并濾液，用濾液沖泡紫河車粉，攪拌使充分溶解，再次過濾，取濾液滅菌后放入4 ℃冰箱冷藏備用。阿司匹林腸溶片（25 mg/片，辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)B20013021）。蘇木精試劑盒（美國賽默飛世爾科技公司，貨號(hào)7211），伊紅試劑盒（美國賽默飛世爾科技公司，貨號(hào)7111）；磷酸化AKT（p-AKT）抗體試劑盒（美國Immunoway 公司，批號(hào)YT0185）、AKT 抗體試劑盒（美國Immunoway公司，批號(hào)YP0006）和PIK3 抗體試劑盒（美國Immu-noway 公司，批號(hào)YM0127）；超敏酶標(biāo)山羊抗小鼠IgG 聚合物（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)2251D0509）；DAB（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)232010317）；柱式法通用型RNA 提取試劑盒（日本Takara 公司，批號(hào)AK20985A）；預(yù)混型定量用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara 公司，批號(hào)AK22355A）；TB Green Premix Ex TaqTM熒光染料（日本 Takara 公司， 批號(hào)AK3112BA）。引物由上海生工合成。

1.3 主要儀器 顯微鏡（尼康，型號(hào)ECLIPSE 80i）；掃描儀（日本濱松，NanoZoomer 2.0RS）；JJ2000 型電子天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）；AR1140 高精密電子分析天平（美國奧豪斯電子分析天平）。

1.4 動(dòng)物分組與造模、給藥 48 只SD 雌性大鼠飼養(yǎng)在溫度20～25 ℃、濕度45%～55%，12 h 循環(huán)照明的環(huán)境中，自由攝食飲水。適應(yīng)1 周后按體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、陽性組和HBHP 組，每組12只。除對(duì)照組外，其他組參照文獻(xiàn)方法在發(fā)情期對(duì)大鼠右側(cè)子宮建立TE 模型[6]。運(yùn)用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹部常規(guī)消毒后，在下腹部距腹中線右側(cè)5 mm 處做一個(gè)垂直切口（1～2 cm）。暴露腹腔后，將右側(cè)子宮輕輕拉出。用兩個(gè)止血夾封閉子宮、卵巢和近端陰道之間的連接處。用1 mL 注射器將約0.3 mL 95%乙醇從卵巢遠(yuǎn)端緩慢注入子宮腔。5 min 后，移除子宮內(nèi)乙醇，并移除夾鉗。然后，用無菌鹽水沖洗子宮腔2～3 次，并逐層關(guān)閉腹腔。術(shù)后給大鼠保溫，蘇醒后放回動(dòng)物室。對(duì)照組大鼠采用相同的手術(shù)方式，只暴露子宮但未對(duì)子宮進(jìn)行任何處理。

按照60 kg 成人與大鼠等效劑量比率為1∶6，計(jì)算出大鼠灌胃劑量。HBHP 組予HBHP 10 g/（kg·d），按1 mL/100 g 灌胃。陽性組接受小劑量阿司匹林腸溶片0.5 mg/（kg·d），按1 mL/100 g 灌胃；對(duì)照組及模型組每日灌服生理鹽水1 mL/100 g。各組大鼠連續(xù)灌胃15 d 后，通過腹腔注射過量戊巴比妥鈉麻醉安樂死，稱大鼠體質(zhì)量，取出子宮。

1.5 子宮濕重測(cè)量 用高精密電子天平秤大鼠子宮的質(zhì)量，即子宮濕重。子宮臟器指數(shù)=子宮濕重/大鼠體質(zhì)量×100%。

1.6 蘇木精-伊紅染色 石蠟包埋切片（3 μm）用二甲苯（20 min，2 次）、100%乙醇（5 min，2 次）和95%乙醇（5 min，2 次）進(jìn)行脫蠟。HE 染色后，切片通過逐漸增加的乙醇梯度脫水，并用二甲苯透明。最后，用中性脂固定載玻片，在顯微鏡下觀察腺體。使用NDP圖像處理軟件（2.7.52 版本）計(jì)算每單位面積的子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量。從每個(gè)切片中隨機(jī)選擇5 個(gè)視野用于計(jì)數(shù)子宮內(nèi)膜腺體的數(shù)量。對(duì)每個(gè)切片進(jìn)行3 次計(jì)數(shù)以獲得平均值。此外，使用NDP 圖像處理軟件（2.7.52 版本）測(cè)量子宮內(nèi)膜厚度。隨機(jī)選擇一個(gè)子宮樣本的3 個(gè)切片進(jìn)行觀察。在每個(gè)切片的3、6、9 和12 點(diǎn)鐘位置測(cè)量子宮內(nèi)膜厚度，計(jì)算4 次測(cè)量的平均值作為一個(gè)切片的平均子宮內(nèi)膜厚度。然后將3個(gè)切片的平均子宮內(nèi)膜厚度作為特定組中一個(gè)樣品的最終子宮內(nèi)膜厚度。

1.7 免疫組織化學(xué)染色 內(nèi)源過氧化物酶的活性用甲醇中的3%過氧化氫（H2O2）淬滅15 min。在預(yù)熱的0.05%檸檬酸鈉緩沖液中進(jìn)行15 min 的抗原修復(fù)，然后用10%正常山羊血清封閉。載玻片在初級(jí)抗體[小鼠抗大鼠PIK3 單克隆抗體（1∶200 稀釋）、小鼠抗大鼠AKT 單克隆抗體（1∶500 稀釋）、小鼠抗大鼠p-AKT 單克隆抗體（1∶500 稀釋）]中孵育過夜。將切片與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的第二抗體[超敏酶標(biāo)山羊抗小鼠IgG 聚合物（1∶5000 稀釋）]在室溫孵育2 h。最后，切片用蘇木精和DAB（3，3′-二氨基聯(lián)苯胺）并用中性脂覆蓋，在顯微鏡下觀察載玻片。使用Image Pro Plus 6.0 軟件計(jì)算不同組中p-AKT、AKT和PIK3 的表達(dá)。

1.8 逆轉(zhuǎn)錄-定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription -quantitative real -time polymerase chain reaction，RT-qPCR） 使用柱式法通用型RNA 提取試劑盒從各組大鼠子宮組織中提取總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒將RNA 轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后采用快速TB Green Premix Ex TaqTM和CFX384 多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行RT-qPCR 分析。PCR 反應(yīng)條件設(shè)定為：在95 ℃循環(huán)30 s 后，進(jìn)行38 個(gè)PCR 循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括變性步驟（95 ℃，5 s）和退火步驟（65 ℃，30 s）。相對(duì)mRNA 表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為β-actin，用2-ΔΔCT法計(jì)算。引物序列：AKT：5′-TATATCTTCAAGCCGTCCTTG-3′（正向）和5′-TTGTTCTATCTTTTTGGTCTGC-3′（反向）；PI3K：5′-TGAGCATGAACTTCTGAAAAACG-3′（正向）和5′-CTCTTTGATCTGGTTCATGAGGT-3′（反向）；β-actin：5′-TATCGGCAATGAGCGGTTCC-3′（正向）和5′-AGCACTGTTGGCATAGAGG-3′（反向）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般觀察 實(shí)驗(yàn)過程中，模型組、陽性組、HBHP 組各有1 只大鼠死亡，其余大鼠處于良好的生活狀態(tài)，各組間沒有表現(xiàn)出明顯的差異。用藥后未出現(xiàn)明顯的藥物不良反應(yīng)或其他不適。

2.2 各組大鼠子宮組織學(xué)分析 大鼠子宮的組織學(xué)分析顯示，對(duì)照組大鼠子宮腔形態(tài)完整，間質(zhì)中腺體和血管分布正常。模型組大鼠宮腔較大，子宮壁整層變薄呈波狀，結(jié)構(gòu)不完整，腺體少，毛細(xì)血管稀疏。HBHP 組和陽性組顯示子宮內(nèi)膜厚度略厚，主要是完整的腺上皮細(xì)胞和管腔上皮細(xì)胞，連續(xù)的子宮內(nèi)膜，腺體數(shù)量增加，毛細(xì)血管數(shù)量增多，排列整齊。與對(duì)照組比較，模型組的子宮濕重、子宮臟器指數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度和腺體數(shù)量顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，HBHP 組和陽性組子宮濕重、子宮臟器指數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度和腺體數(shù)量均明顯增加（P＜0.05），HBHP 組較陽性組增加更明顯（P＜0.05）。見圖1 和表1。

表1 各組大鼠子宮濕重、子宮臟器指數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度和腺體數(shù)量比較（±s）

表1 各組大鼠子宮濕重、子宮臟器指數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度和腺體數(shù)量比較（±s）

注：HBHP 為何氏補(bǔ)腎厚膜方；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽性組比較，cP＜0.05

組別對(duì)照組模型組HBHP 組陽性組F 值P 值鼠數(shù)12 11 11 11子宮濕重（g）0.80±0.06 0.42±0.05a 0.75±0.06bc 0.68±0.08b 7.123＜0.001子宮臟器指數(shù)（%）0.30±0.03 0.16±0.02a 0.26±0.02bc 0.24±0.03b 5.831＜0.001子宮內(nèi)膜厚度（μm）526.08±23.21 357.34±14.35a 476.74±21.42bc 438.18±22.39b 4.772＜0.001腺體數(shù)量19.08±1.31 8.09±1.57a 16.09±1.34bc 13.91±1.45b 8.754＜0.001

2.3 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織PI3K、AKT 及p-AKT蛋白表達(dá)比較 免疫組化分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組子宮內(nèi)膜組織PI3K、AKT 及p-AKT 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）。與模型組比較，HBHP 組和陽性組子宮內(nèi)膜組織PI3K、AKT 及p-AKT 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），陽性組與HBHP 組無顯著差異（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠子宮內(nèi)膜PI3K、AKT 及p-AKT 蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠子宮內(nèi)膜PI3K、AKT 及p-AKT 蛋白表達(dá)比較（±s）

注：HBHP 為何氏補(bǔ)腎厚膜方；AKT 為蛋白激酶B；p-AKT 為磷酸化AKT；PI3K 為磷脂酰肌醇激酶；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別對(duì)照組模型組HBHP 組陽性組F 值P 值鼠數(shù)12 11 11 11 AKT 蛋白0.71±0.11 0.21±0.01a 0.57±0.03b 0.43±0.05b 5.232 0.002 p-AKT 蛋白0.88±0.06 0.37±0.02a 0.71±0.04b 0.54±0.03b 6.111＜0.001 PI3K 蛋白0.42±0.02 0.15±0.01a 0.33±0.03b 0.28±0.02b 4.462 0.012

圖1 各組大鼠子宮的組織學(xué)分析（HE 染色，×20）

注：A 為對(duì)照組；B 為模型組；C 為HBHP 組；D 為陽性組；HBHP 為何氏補(bǔ)腎厚膜方

2.4 各組大鼠子宮內(nèi)膜AKT、PI3K mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜AKT、PI3K mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，HBHP 組和陽性組子宮內(nèi)膜AKT、PI3K mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），陽性組與HBHP 組比較無顯著差異（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠子宮內(nèi)膜AKT、PI3K mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表3 各組大鼠子宮內(nèi)膜AKT、PI3K mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：HBHP 為何氏補(bǔ)腎厚膜方；AKT 為蛋白激酶B；PI3K 為磷脂酰肌醇激酶；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別對(duì)照組模型組HBHP 組陽性組F 值P 值鼠數(shù)12 11 11 11 AKT mRNA 1.02±0.23 0.42±0.20a 0.97±0.33b 0.86±0.30b 11.612＜0.001 PI3K mRNA 1.06±0.35 0.58±0.22a 0.98±0.55b 0.87±0.33b 3.363 0.028

3 討 論

本研究成功建立了95%乙醇誘導(dǎo)的TE 模型大鼠，通過HE 染色觀察子宮內(nèi)膜的厚度和形態(tài)，表明TE 模型大鼠建立成功。光鏡檢查顯示，經(jīng)95%乙醇灌注的模型組子宮內(nèi)膜明顯薄于對(duì)照組；HBHP 治療后，子宮內(nèi)膜厚度增加，腺體數(shù)量增加。因此，我們推斷HBHP 改善TE 可能與促進(jìn)子宮內(nèi)膜腺上皮的生長和修復(fù)有關(guān)。

子宮內(nèi)膜中PI3K/AKT 通路的表達(dá)受雌激素和孕激素的調(diào)節(jié)，可以將子宮內(nèi)膜從薄而致密轉(zhuǎn)變?yōu)楹穸该鱗7]。與女性激素結(jié)合，PI3K/AKT 通路可以在子宮內(nèi)膜的增殖、分泌和脫落中發(fā)揮作用。月經(jīng)期PI3K/AKT 通路的低表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜脫落有關(guān)，而分泌期PI3K/AKT 通路的高表達(dá)水平促進(jìn)新血管形成和血管通透性，有助于修復(fù)子宮內(nèi)膜和胚胎植入[8]。McCoski 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT 通路在綿羊子宮內(nèi)膜的整個(gè)著床窗口期均有表達(dá)，認(rèn)為PI3K/AKT通路可能有助于子宮內(nèi)膜容受性。本研究中PCR 和免疫組化結(jié)果顯示，模型組PI3K/AKT 通路表達(dá)明顯低于對(duì)照組正常子宮內(nèi)膜。然而，在進(jìn)行HBHP 治療后，PI3K/AKT 通路的表達(dá)顯著增加。因此，HBHP 可通過增加PI3K/AKT 通路的表達(dá)促進(jìn)血管生成和局部血供，從而改善子宮內(nèi)膜厚度和容受性。

中醫(yī)學(xué)沒有TE 的病名，根據(jù)其臨床癥狀，可將其歸屬于“不孕”“月經(jīng)過少”“閉經(jīng)”等范疇。腎主生殖，腎精虧虛，精血無以滋養(yǎng)胞宮，而致子宮內(nèi)膜變薄。HBHP 是何氏婦科多年經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，方中紫河車為血肉有情之品，生精益血，溫補(bǔ)腎陽，溫和而滋養(yǎng)力強(qiáng)；鹿角片、仙靈脾溫補(bǔ)腎陽，菟絲子、覆盆子、枸杞子、熟地、炒白芍補(bǔ)益肝腎，養(yǎng)血生精，當(dāng)歸、川芎、赤芍活血，香附理氣；黃芪為補(bǔ)中升陽之要藥，張錫純謂其補(bǔ)益之功能生肌肉。全方補(bǔ)中有散，動(dòng)靜結(jié)合，溫潤并行，具有補(bǔ)腎、填精、活血、養(yǎng)血功效，諸藥合用，不僅可以增加子宮內(nèi)膜厚度，還可以改善缺血后子宮內(nèi)膜血流，從而增加受精卵著床機(jī)會(huì)。

綜上，目前的研究證實(shí)HBHP 可通過增強(qiáng)PI3K/AKT 通路來改善TE 模型大鼠的子宮內(nèi)膜厚度和容受性，但是我們發(fā)現(xiàn)，HBHP 組與陽性組比較，PI3K/AKT 通路表達(dá)無明顯差異的情況下，在增加子宮內(nèi)膜厚度和腺體數(shù)量上優(yōu)于陽性組，因此推斷可能存在其他的信號(hào)通路。在未來的研究中，我們擬構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的綜合策略來鑒定參與HBHP 對(duì)TE 有益作用的潛在活性成分和分子機(jī)制，并通過體外網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)建立關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通道[10]。