連翹苷通過非calpain 途徑升高ABCA1 表達抑制動脈粥樣硬化斑塊形成

何志迪 金笑平 朱星蓉 王 恩 王 鳳 吳 剛 徐逸雯

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是缺血性腦卒中、心肌梗死、缺血性心肌病等心血管疾病發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)的最常見病因和病理基礎(chǔ)[1]。大多數(shù)缺血性事件發(fā)生的病因是由于AS 易損斑塊破裂和內(nèi)皮糜爛，動脈表面的完整性被破壞而引發(fā)血栓形成[2-3]。脂質(zhì)沉積是AS 的重要病理基礎(chǔ)，膽固醇逆轉(zhuǎn)運可將組織中過量的膽固醇轉(zhuǎn)運到肝臟，經(jīng)過糞便清除，減少脂質(zhì)在血管壁的沉積，高密度脂蛋白膽固醇（HDLC）濃度和其含有的游離膽固醇的酯化是膽固醇逆轉(zhuǎn)運和預(yù)防動脈粥樣硬化性心血管疾病的核心[4]。在膽固醇逆轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中，過量的膽固醇通過ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）綁定到載脂蛋白A1 上從而啟動膽固醇逆轉(zhuǎn)運[5]。連翹苷是連翹的重要有效活性成分之一，具有抗炎抑菌、抗氧化、抗感染等藥理作用[6]。研究顯示，連翹苷可以減輕高葡萄糖誘導(dǎo)的脂質(zhì)積累[7]，也可以通過自噬緩解小鼠酒精性脂肪肝的發(fā)生[8]。本研究旨在探討連翹苷是否通過調(diào)節(jié)ABCA1 發(fā)揮作用，并研究其影響ABCA1 的具體機制。

1 實驗材料

1.1 細(xì)胞株與試劑 THP-1 細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）。連翹苷標(biāo)準(zhǔn)品購自GLPBIO 公司（批號GC38421，提取于連翹，純度＞98.5%）；維多利亞藍彈力纖維染色液試劑盒、Masson 三色染液試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司（批號G1596、G1340）；ABCA1 抗 體、ATP 結(jié) 合 盒 轉(zhuǎn) 運 蛋 白G1（ABCG1）抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司（批號ab66217、ab52617、ab9484）；過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）抗體、肝臟X 受體α（LXRα）抗體、鈣激活中性蛋白酶（calpain）抗體均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司（批號16643-1-AP、14351-1-AP、11472-1-AP）；鈣蛋白酶抑制蛋白（calpastatin）抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司（批號bs-6701R）；Mayer蘇木素染色液、伊紅染液購自大連美侖生物技術(shù)有限公司（批號MB9897-3、MA0164）；HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）測試盒均購自南京建成生物工程研究所（批號A112-1-1、A113-1-1、A110-1-1、A111-1-1）；氧化低密度脂蛋白購自杭州納秋生物科技有限公司（批號S24879-2m）；小鼠超敏C-反應(yīng)蛋白（hs-CRP）、纖維蛋白原酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒均購自江萊生物（批號JL10346、JL20600）；葡萄糖氧化酶法測定試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司（批號E1010）。

1.2 動 物 健康雄性APOE-/-小鼠25 只，體質(zhì)量約30 g，4～6 周齡，北京華阜康生物科技股份有限公司提供[許可證：SCXK（京）2019-0008]。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫20～22 ℃，濕度45%～60%。本研究得到溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺州醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（審批號：tzy-2020199）。

1.3 主要儀器 低溫離心機（型號：5424R，美國賽默飛公司）；酶標(biāo)儀（型號：Multiskan FC，上海美谷分子儀器有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（型號：FORMA3111，美國賽默飛公司）；微型振蕩器（型號：HK 96-3，江蘇金坭棠華儀器公司）；純水供應(yīng)系統(tǒng)（型號：Direct8，法國Millipore 公司）；冰凍切片機（型號：CM1950，德國Leica 公司）；石蠟包埋機（型號：TEC5，湖北孝感闊海醫(yī)療科技有限公司）；攤片機（型號：KEDEE，德國Leica 公司）。

2 實驗方法

2.1 動脈硬化斑塊模型建立 25 只APOE 基因敲除小鼠使用隨機數(shù)字表法分為五組：（1）空白對照組：普通飼料+0.9%氯化鈉灌胃；（2）模型對照組：高脂飼料+0.9%氯化鈉灌胃；（3）連翹苷低劑量組：高脂飼料+連翹苷25 mg/（kg·d）灌胃；（4）連翹苷高劑量組：高脂飼料+連翹苷45 mg/（kg·d）灌胃；（5）阿托伐他汀組：高脂飼料+阿托伐他汀10 mg/（kg·d）灌胃。藥物干預(yù)12 周，每周檢測各組小鼠進食情況和體質(zhì)量。高脂飼料配方為16%豬油、10.5%蔗糖、1.5%膽固醇、72%普通飼料。連翹苷標(biāo)準(zhǔn)品（固體粉質(zhì)）使用DMSO 溶液配置成所需要的濃度。12 周后對小鼠進行腹腔麻醉，心臟采血，以4000 r/min、離心半徑約6 cm 離心10 min，留取血清。小鼠仰臥位固定，剪開胸骨暴露心臟，剪開右心耳放血并緩慢推注0.9%氯化鈉，直到右心耳流出的液體基本不帶血色，切取主動脈弓至髂動脈分支處的全部主動脈進行病理染色、免疫組化檢測。

2.2 血脂血糖等指標(biāo)檢測 血清樣本靜置，由-20 ℃冰箱放置4 ℃冰箱中，按照試劑盒操作要求檢測各項生化指標(biāo)，包括血糖、HDL-C、LDL-C、TG、TC、hs-CRP、纖維蛋白原水平。

2.3 易損斑塊病理學(xué)、形態(tài)學(xué)檢查 分離取出主動脈，用預(yù)冷的PBS 洗去殘血，留取約2 mm 長度主動脈迅速投入液氮中，用于制作冰凍切片，油紅O 染色。留取約2 mm 主動脈，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，進行HE 染色、Masson 染色和維多利亞藍染色。在光鏡下觀察血管壁AS 病變的組織學(xué)形態(tài)。

2.4 免疫組化檢測ABCA1、LXR-α、PPAR-γ、calpain、calpastatin 的蛋白表達 小鼠主動脈組織進行石蠟包埋后連續(xù)切片，后續(xù)進行常規(guī)脫蠟水化、抗原修復(fù)、內(nèi)源性過氧化物酶滅活、封閉、抗體孵育、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、封片等操作。PBS 代替一抗作陰性對照。有棕褐色、棕黃色著色的細(xì)胞視為陽性細(xì)胞，顯微鏡觀察并用Image J 分析。

2.5 細(xì)胞實驗 THP-1 細(xì)胞置于含100 μmol/L 佛波酯（PMA）的1640 培養(yǎng)液中培養(yǎng)72 h 后，可轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞。THP-1 源性巨噬細(xì)胞以50 μg/mL 的ox-LDL 刺激48 h 后成為泡沫細(xì)胞。分為無藥物干預(yù)的THP-1 細(xì)胞組、泡沫細(xì)胞組及連翹苷低濃度（25μmol/L）干預(yù)組、連翹苷高濃度（100 μmol/L）干預(yù)組，干預(yù)時間為24 h，提取各組細(xì)胞。采用油紅O 染色方法對泡沫細(xì)胞進行鑒定（泡沫細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量被油紅O 染成紅色的顆粒狀脂滴）。Western blot：收集各組經(jīng)過特定處理的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，測定并調(diào)整各組蛋白濃度，進行8%～12%聚丙烯酰電泳，隨后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜。室溫下，用封閉液封閉2～3 h。隨后與相關(guān)蛋白一抗4 ℃過夜孵育。用TBST 清洗3 次后，與二抗室溫下孵育1 h。再次用TBST 清洗3 次后，用ECL plus 熒光檢測試劑盒顯影。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 26.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有計量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 連翹苷對各組小鼠體質(zhì)量的影響 各組間小鼠初始體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。第12周時，模型對照組、連翹苷低劑量組小鼠體質(zhì)量大于空白對照組（P＜0.05）；連翹苷高劑量組、阿托伐他汀組體質(zhì)量小于模型對照組（P＜0.05），而與空白對照組小鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。12周內(nèi)各組小鼠間的體質(zhì)量增幅差異與終末體質(zhì)量差異相似。見表1。

表1 連翹苷對小鼠體質(zhì)量的影響（g，±s）

表1 連翹苷對小鼠體質(zhì)量的影響（g，±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型對照組比較，bP＜0.05

組別空白對照組模型對照組連翹苷低劑量組連翹苷高劑量組阿托伐他汀組鼠數(shù)55555初始體質(zhì)量20.60±0.55 20.60±0.89 20.40±0.55 21.20±1.10 20.80±0.45終末體質(zhì)量38.60±0.89 41.40±1.14a 41.20±0.84a 39.20±1.30b 39.40±0.55b體質(zhì)量增幅18.00±1.00 20.80±1.79a 20.80±1.10a 18.00±0.71b 18.60±0.55b

2.2 連翹苷對各組小鼠血液生化指標(biāo)的影響 與空白對照組比較，模型對照組小鼠LDL-C、TC、TG 水平顯著升高，HDL-C 水平顯著降低（P＜0.05）。與模型對照組比較，各給藥組小鼠LDL-C、TC、TG 水平顯著降低，HDL-C 水平顯著升高（P＜0.05）。與空白對照組比較，連翹苷高劑量組小鼠LDL-C、TC 無顯著差異（P＞0.05），阿托伐他汀組TC 無顯著差異（P＞0.05）。與空白對照組比較，模型對照組、連翹苷低劑量組血糖水平顯著升高（P＜0.05），連翹苷高劑量組和阿托伐他汀組無差異（P＞0.05）；各組纖維蛋白原水平較空白對照組均顯著升高（P＜0.05）；除連翹苷高劑量組外，其余三組hs-CRP 水平較空白對照組顯著升高（P＜0.05）。見表2。

表2 連翹苷對小鼠血液生化指標(biāo)的影響（±s）

表2 連翹苷對小鼠血液生化指標(biāo)的影響（±s）

注：HDL-C 為高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C 為低密度脂蛋白膽固醇；TC 為總膽固醇；TG 為三酰甘油；hs-CRP 為超敏C-反應(yīng)蛋白；與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型對照組比較，bP＜0.05；與阿托伐他汀組比較，cP＜0.05

組別空白對照組模型對照組連翹苷低劑量組連翹苷高劑量組阿托伐他汀組例數(shù)55555 HDL-C（mmol/L）5.99±0.46 1.33±0.14a 2.23±0.19abc 3.15±0.27abc 4.27±0.54ab LDL-C（mmol/L）5.34±0.88 16.09±2.08a 10.15±1.30ab 7.10±1.10b 8.25±1.38ab TC（mmol/L）41.85±1.64 65.57±7.47a 47.31±3.38b 44.10±3.38b 44.55±3.29b TG（mmol/L）4.25±0.26 15.03±1.20a 8.50±0.73abc 6.03±0.66ab 6.06±0.49ab血糖（mmol/L）4.21±0.15 5.74±0.22a 5.09±0.23a 4.38±0.08b 4.41±0.14b纖維蛋白原（μg/mL）9.58±1.57 56.11±2.28a 29.11±1.19ab 19.67±2.27ab 14.24±1.08ab hs-CRP（ng/mL）3.32±0.93 17.51±4.39a 12.79±1.35ab 6.65±0.87b 11.28±1.71ab

2.3 連翹苷對各組小鼠主動脈組織病理形態(tài)的影響在模型對照組小鼠中可見動脈壁內(nèi)膜增厚，粥樣硬化斑塊和膽固醇結(jié)晶、鈣化。連翹苷低劑量組小鼠動脈壁層次尚清晰?？瞻讓φ战M、連翹苷高劑量組和阿托伐他汀組小鼠主動脈管壁層次清晰，內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整，未見粥樣硬化斑塊、膽固醇結(jié)晶或鈣化。在油紅O 染色中，模型對照組小鼠動脈粥樣硬化斑塊面積增加，連翹苷各組和阿托伐他汀組均抑制了過量膽固醇沉積，防止了斑塊進展。在Masson 染色和維多利亞藍染色中可見空白對照組小鼠動脈管壁厚度均勻，血管平滑肌細(xì)胞整齊，周圍膠原纖維結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核大小正常；模型對照組血管平滑肌細(xì)胞排列紊亂，膠原分解增多，管壁變薄，斑塊易損性增加；與模型對照組比較，連翹苷各組和阿托伐他汀組血管平滑肌細(xì)胞膠原纖維分解減少，斑塊穩(wěn)定性增加。見圖1。

圖1 APOE-/-小鼠主動脈血管染色結(jié)果（×40）

2.4 連翹苷對各組小鼠主動脈組織ABCA1、LXRα、PPAR-γ、calpain 和calpastatin 蛋白表達的影響免疫組化結(jié)果顯示，連翹苷高劑量組ABCA1、LXR-α、PPAR-γ 蛋白表達水平高于空白對照組和模型對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。連翹苷低劑量組ABCA1 和LXR-α 表達水平高于空白對照組（P＜0.05）。各組之間calpain、calpastatin 蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2 和表3。

圖2 不同濃度連翹苷對小鼠主動脈組織ABCA1、LXR-α、PPAR-γ、calpain 和calpastatin 蛋白表達水平的影響（免疫組化，×40）

表3 各組小鼠主動脈組織免疫組化ABCA1、LXR-α、PPAR-γ、calpastatin、calpain 平均光密度值比較（±s）

注：ABCA1 為ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1；LXRα 為肝臟X 受體α；PPAR-γ 為過氧化物酶體增殖物激活受體γ；calpastatin 為鈣蛋白酶抑制蛋白；calpain 為鈣激活中性蛋白酶；與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型對照組比較，bP＜0.05；與阿托伐他汀組比較，cP＜0.05

組別空白對照組模型對照組連翹苷低劑量組連翹苷高劑量組阿托伐他汀組鼠數(shù)55555 ABCA1 0.142±0.009 0.143±0.011 0.160±0.003a 0.163±0.004abc 0.146±0.014 LXR-α 0.163±0.007 0.170±0.008 0.181±0.012a 0.215±0.031ab 0.180±0.007 PPAR-γ 0.168±0.017 0.150±0.007 0.168±0.016 0.201±0.022abc 0.161±0.004 calpastatin 0.236±0.037 0.263±0.054 0.258±0.036 0.251±0.033 0.244±0.022 calpain 0.196±0.021 0.179±0.013 0.183±0.024 0.178±0.036 0.180±0.017

2.5 不同濃度連翹苷對THP-1 源性泡沫細(xì)胞及其ABCA1 表達的影響 細(xì)胞實驗結(jié)果顯示，泡沫細(xì)胞組脂質(zhì)沉積比連翹苷組更嚴(yán)重，連翹苷有抑制泡沫細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的作用，并隨著劑量的增加而增強。連翹苷干預(yù)后，能明顯提高泡沫細(xì)胞內(nèi)ABCA1、ABCG1 蛋白的表達。見圖3。

圖3 不同濃度連翹苷對泡沫細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積（A）及膽固醇轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白表達水平（B）的影響

3 討 論

AS 是一種大、中型動脈的慢性炎癥性疾病，即動脈壁纖維脂肪病變的形成，可引起缺血性心臟病、腦梗死和周圍血管疾病等多種高發(fā)病率和致死率性疾病[9]。連翹苷是連翹中主要的多酚類化合物，近年來，連翹苷被證實具有較強的抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒和抗細(xì)菌感染等藥理作用，在治療相關(guān)疾病方面具有巨大的潛力[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型對照組相比，連翹苷可降低APOE-/-小鼠體質(zhì)量、降低LDLC、TC、TG 水平，其效果與阿托伐他汀相比無明顯差異，但是連翹苷升高HDL-C 的作用不如阿托伐他汀。此外，高劑量連翹苷還具有較好的降低血糖、纖維蛋白原及hs-CRP 水平的作用。通過主動脈病理組織染色，觀察到高劑量連翹苷可以抑制主動脈斑塊的形成，減少血管平滑肌細(xì)胞周圍膠原分解，改善動脈管壁結(jié)構(gòu)，達到穩(wěn)定易損斑塊的作用。免疫組化結(jié)果顯示，連翹苷可能是通過上調(diào)PPAR-γ、LXR-α、ABCA1 表達水平而非calpain 途徑來抑制膽固醇外流，起到抗AS 的作用。

傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，在AS 的早期階段，炎癥趨化因子刺激單核細(xì)胞使其分化成巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞通過其表面的清道夫受體吞噬氧化低密度脂蛋白，導(dǎo)致膽固醇內(nèi)流和沉積，形成泡沫細(xì)胞，這是構(gòu)成動脈粥樣硬化斑塊的基礎(chǔ)。細(xì)胞中多余的膽固醇被ATP結(jié)合盒式（ABC）轉(zhuǎn)運體ABCA1 和ABCG1 排出，并形成HDL[11]。ABCA1 是一種膜轉(zhuǎn)運體，在巨噬細(xì)胞中含量豐富，并介導(dǎo)膽固醇外流，平衡脂質(zhì)吸收和流出的速率。ABCA1 轉(zhuǎn)運蛋白的表達可以在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯后水平進行調(diào)控。在轉(zhuǎn)錄水平，ABCA1 的表達主要由肝X 受體（LXR）、類視黃醇X受體（RXR） 和過氧化物酶體增殖物活化受體（PPAR）等核受體控制[12]。PPAR-α 和γ 通過激活LXR-α 基因的轉(zhuǎn)錄間接刺激ABCA1 基因的轉(zhuǎn)錄。Fang 等[13]研究表明，連翹苷可以降低肥胖小鼠的甘油循環(huán)水平，減少肝脂肪變性，改善胰島素敏感性，減輕肥胖小鼠脂肪組織中與肥胖相關(guān)的炎癥和白細(xì)胞介素6 的產(chǎn)生，這和本研究結(jié)果有相似之處。此外，連翹苷有可能通過降低鈉氫交換蛋白1（NHE-1）的基因和蛋白表達減少機體氧化應(yīng)激，進一步降低AS 相關(guān)炎性因子，起到抗AS 的作用[14]。也有研究顯示，連翹苷可以上調(diào)乙酰化低密度脂蛋白刺激下的骨髓來源巨噬細(xì)胞PPAR-γ、ABCA1、ABCG1 及清道夫受體B1 基因表達從而促進巨噬細(xì)胞膽固醇外流[15]。本研究中，連翹苷升高PPAR-γ、LXR-α、ABCA1 的表達，有可能通過該信號通路發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

鈣蛋白酶屬于鈣依賴性半胱氨酸蛋白酶家族，與AS 和炎癥有關(guān)。在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中，calpain誘導(dǎo)ABCA1 和ABCG1 的蛋白水解降解，導(dǎo)致膽固醇流出受損和隨后的巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞形成[16]。calpain 抑制劑顯著下調(diào)清道夫受體CD36 和SR-A 的mRNA 表達，并上調(diào)主動脈和腹膜巨噬細(xì)胞中參與膽固醇外排途徑的基因（PPAR-γ、LXR-α 和ABCA1）的表達[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，連翹苷導(dǎo)致ABCA1 表達升高，但對calpain 和calpastatin 的表達無影響，表明連翹苷可能不是通過calpain 通路參與ABCA1 的調(diào)控。

然而，本研究也有一定的局限性。首先，在動物實驗部分未進一步研究連翹苷對calpain/calpastatin的影響；其次，關(guān)于連翹苷對THP-1 源性泡沫細(xì)胞的研究還不夠深入，未證實LXR-α、PPAR-γ 蛋白表達量在連翹苷干預(yù)后泡沫細(xì)胞中是否升高。

綜上所述，連翹苷可以通過非calpain 途徑上調(diào)ABCA1 水平來抑制膽固醇外流，減輕小鼠體質(zhì)量，降低LDL 表達，以此起到抗AS 的作用。