懸移質(zhì)泥沙-微囊藻毒素復(fù)合體對(duì)大型溞的毒性效應(yīng)

馮琴霜,黃 維,何 強(qiáng),李 宏(重慶大學(xué)三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400045)

泥沙是水生生態(tài)系統(tǒng)中一種重要的環(huán)境介質(zhì),能為污染物從水相到固相與水體到生物體等多種途徑的遷移充當(dāng)載體.在水庫(kù)泄水期時(shí),河流沉積物表層輕質(zhì)細(xì)顆粒泥沙在水流裹挾作用下進(jìn)入水環(huán)境,演變成為懸移質(zhì)泥沙(SPM).相較于其他類(lèi)型泥沙而言,SPM 具有更大的比表面積,能為水環(huán)境中污染物的附著提供更多的吸附位點(diǎn),進(jìn)而影響水體中污染物的遷移轉(zhuǎn)化[1].

微囊藻毒素(MCs)是由產(chǎn)毒微囊藻合成并釋放到水生環(huán)境中的一種有毒物質(zhì)[2-3].當(dāng)藻細(xì)胞受到脅迫或衰亡而發(fā)生破裂時(shí),細(xì)胞內(nèi)的MCs 會(huì)進(jìn)入水生態(tài)環(huán)境中,并通過(guò)皮膚接觸或者食物鏈富集等方式進(jìn)入水生生物或人體內(nèi),從而對(duì)水生生物及人體健康造成傷害[4-7].占水體中MCs總濃度46%～99.8%的異構(gòu)體MC-LR[8]是最普遍、分布最廣、毒性最強(qiáng)的一種異構(gòu)體[9].研究發(fā)現(xiàn),MC-LR 對(duì)大型溞的48h 半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)為13.46mg/L[10],且MC-LR 暴露造成大型溞能量損傷,其中7d 齡大型溞毒素生物轉(zhuǎn)化能力更強(qiáng),而3d 齡大型溞抗氧化應(yīng)激能力更強(qiáng)[11].

研究表明,水體中超過(guò)81%的MCs 可通過(guò)吸附作用去除[12-13].而SPM 所具有的粒徑小、比表面積大、重量輕等特點(diǎn)使其成為了一種很好的污染物載體.研究發(fā)現(xiàn)河流中的泥沙對(duì)環(huán)境中的有機(jī)物具有很強(qiáng)的吸附親和力,是環(huán)境中污染物重要的匯[14],且懸浮顆粒物的大小會(huì)影響大型溞的攝食[15].目前鮮有研究評(píng)估SPM吸附MC-LR所得到的復(fù)合體的生態(tài)毒性效應(yīng).

本研究通過(guò)吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)制備了不同MCLR 吸附量的SPM-MC-LR 復(fù)合體,并對(duì)水生態(tài)毒理模式生物大型溞進(jìn)行24 和48h 的暴露實(shí)驗(yàn),從大型溞的固定率、復(fù)合體在大型溞腸道內(nèi)的累積情況以及抗氧化酶活性的角度,解析復(fù)合體對(duì)大型溞生理特性的影響,以期為評(píng)價(jià)環(huán)境中SPM-MC-LR 復(fù)合體的生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

SPM 均取自于三峽庫(kù)區(qū)長(zhǎng)江支流御臨河,其d50=6.79μm, d90=35.4μm.MC-LR 標(biāo)準(zhǔn)品和大型溞(Daphnia magna)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所,其中大型溞在恒溫光照培養(yǎng)箱中以溫度(20±1)℃、光暗時(shí)間比16:8 的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行培養(yǎng),并且每天用濃縮斜生柵藻(Scenedesmus obliquus,密度約為5×105cells/mL)進(jìn)行飼喂.MC-LR 在滅菌水體中幾乎不存在降解,在自然水體中降解的半衰期為0.44～22d[16-18].整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的所有化學(xué)藥品均為分析純,所有使用的水均為超純水.

1.2 SPM 對(duì)MC-LR 的吸附

1.2.1 吸附動(dòng)力學(xué) 稱(chēng)取 0.04g SPM 于裝有100mL 1000μg/L MC-LR 溶液、添加有200mg/L 的NaN3(用于抑制微生物的生長(zhǎng))的遮光錐形瓶中,置于恒溫振蕩箱中(25℃,150r/min).分別在反應(yīng)0.5,1,2,4,12,24,36,48,60,72h 時(shí)間點(diǎn)取樣2mL 并過(guò)濾,采用高效液相色譜檢測(cè)MC-LR 的濃度變化,計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸附量,擬合吸附動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn),確定MC-LR在SPM 上的吸附平衡時(shí)間.

1.2.2 吸附等溫線(xiàn) 稱(chēng)取0.008g SPM 于MC-LR濃度分別為0,200,400,600,800,1000,1200,1500,1800和2000μg/L 且添加有200mg/L 的NaN3的遮光錐形瓶中,置于恒溫振蕩箱中(25℃,150r/min)反應(yīng)36h.過(guò)濾后測(cè)定濾液MC-LR 濃度,計(jì)算每種MC-LR 濃度對(duì)應(yīng)的吸附量,擬合確定最佳吸附等溫模型.

1.2.3 SPM-MC-LR 復(fù)合體的制備 泥沙濃度超過(guò)400mg/L 時(shí)會(huì)對(duì)藻類(lèi)的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用[19],本研究團(tuán)隊(duì)的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)表明三峽庫(kù)區(qū)支流-御臨河泥沙濃度在泄水期可達(dá)40～500mg/L.此外全球水體胞外MCs 平均濃度可達(dá)230.19μg/L[6].為了探究在環(huán)境濃度條件下SPM 吸附MC-LR后的復(fù)合體對(duì)水生態(tài)毒理模式生物大型溞的毒性作用,以初始濃度為160μg/L 的MC-LR 和400mg/L 的SPM 進(jìn)行復(fù)合體的制備.根據(jù)SPM 吸附MC-LR 的吸附動(dòng)力學(xué)過(guò)程,分別在第 0.5,2,6,12,24,48h 進(jìn)行取樣,經(jīng)8000r/min 離心10min,取上清液過(guò)濾后測(cè)定MC-LR濃度,用于計(jì)算SPM 上所吸附的MC-LR 的量.將所得的復(fù)合體經(jīng)冷凍干燥后于干燥箱中保存,用于后續(xù)毒理實(shí)驗(yàn).

1.3 SPM-MC-LR 復(fù)合體對(duì)大型溞的暴露實(shí)驗(yàn)

將復(fù)合體制備的吸附動(dòng)力學(xué)不同時(shí)間取樣得到的復(fù)合體,即分別對(duì)應(yīng)吸附初期(0.5h)、吸附中期(2h)、吸附后期(6h)以及吸附平衡(48h)4 個(gè)不同吸附階段的 SPM-MC-LR(31.51,52.52,73.52 和 94.53μg/g)添加至含有40mL 實(shí)驗(yàn)液的100mL 燒杯中,其中SPM 濃度為400mg/L,同時(shí)設(shè)置不添加SPM 和MC-LR 的空白對(duì)照組以及只添加SPM(即MC-LR含量為0μg/g)的處理組,并準(zhǔn)確計(jì)數(shù)放入20 只7d 的大型溞,4 個(gè)燒杯為一組,便于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大型溞存活率的計(jì)數(shù),每組實(shí)驗(yàn)3 組平行.實(shí)驗(yàn)前對(duì)大型溞進(jìn)行6h 饑餓處理,實(shí)驗(yàn)期間不喂食,其余實(shí)驗(yàn)條件與飼養(yǎng)時(shí)一致.在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,為了讓復(fù)合體始終保持懸浮狀態(tài),每隔5h 用玻璃棒輕輕攪動(dòng)一次反應(yīng)液[20].

在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到24 和48h 時(shí),利用光學(xué)顯微鏡和手動(dòng)計(jì)數(shù)器對(duì)各處理組中的大型溞存活數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì).輕輕搖動(dòng)燒杯,若受試大型溞在15s 之內(nèi)不能游動(dòng),則認(rèn)定其為受抑制的個(gè)體.統(tǒng)計(jì)各個(gè)處理組的固定率,并計(jì)算相應(yīng)的EC50.在實(shí)驗(yàn)初始以及實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到第24,48h 時(shí),從各個(gè)處理組中隨機(jī)選取3 只大型溞,用0.9%的生理鹽水洗去表面附著殘留的復(fù)合體,置于載玻片上于體視顯微鏡下觀(guān)察各處理組中大型溞攝食復(fù)合體情況.暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),用浮游生物網(wǎng)收集大型溞,同時(shí)棄去死亡個(gè)體,用除氯自來(lái)水將大型溞沖洗1 次,接著用去離子水沖洗1 次,最后用0.9%的生理鹽水沖洗2 次,去除大型溞體表泥沙,并在濾紙上晾干,然后轉(zhuǎn)移到2mL 離心管中,于分析天平上稱(chēng)重.經(jīng)液氮冷凍后將離心管中的大型溞全部轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器中,并以1g: 9mL 的比例添加0.9%的生理鹽水,置于0℃冰-水混合水浴中充分研磨.勻漿結(jié)束后將勻漿液全部收集至離心管中,并在10000r/min、4℃下離心10min,收集上清液于-80℃冰箱保存直至分析[21].本實(shí)驗(yàn)中酶活性測(cè)定采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒,按照說(shuō)明操作測(cè)定各處理組中SOD、CAT、GST 活性和MDA以及組織中總蛋白質(zhì)含量,最后用總蛋白濃度進(jìn)行歸一化處理.

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 軟件進(jìn)行處理,圖中數(shù)據(jù)呈現(xiàn)方式為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”,采用IBM SPSS Statistics 26 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,采用單因素方差分析(One-way ANOVA)來(lái)檢驗(yàn)各組間的顯著性差異,當(dāng)P<0.05 時(shí)表明實(shí)驗(yàn)樣本之間具有顯著性差異,并采用Origin 2023 學(xué)生版軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 SPM 對(duì)MC-LR 的吸附模型擬合

2.1.1 吸附動(dòng)力學(xué) 如圖1(a)和表1 所示,在反應(yīng)初期的0～4h 內(nèi),SPM 上MC-LR 吸附量增加得較為迅速,隨后吸附量增加速率逐漸放緩,并在開(kāi)始反應(yīng)后的第36h 達(dá)到吸附平衡.

表1 SPM 吸附MC-LR 動(dòng)力學(xué)模型擬合參數(shù)Table 1 Parameters of kinetic adsorption model for MC-LR adsorption by SPM

表2 SPM 吸附MC-LR 等溫吸附模型擬合參數(shù)Table 2 Parameters of isothermal adsorption model for MC-LR adsorption by SPM

圖1 SPM 吸附MC-LR 的動(dòng)力學(xué)模型擬合和等溫模型擬合Fig.1 Fitting of kinetic model and isothermal model for MC-LR adsorption by SPM

擬一級(jí)和擬二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型擬合的R2均大于0.95,說(shuō)明這2 種模型都能很好地?cái)M合該吸附動(dòng)力學(xué)過(guò)程.SPM 吸附MC-LR 更符合擬二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型,即該吸附過(guò)程是多個(gè)吸附階段共同作用的結(jié)果[22],擬合的最大飽和吸附量為1583μg/g,也更接近實(shí)驗(yàn)測(cè)定值.這表明MC-LR 主要是通過(guò)如絡(luò)合作用、氫鍵作用、共用電子對(duì)等化學(xué)作用力吸附在SPM 上[23].該結(jié)果與Maghsoudi 等[14]和Liu 等[24]進(jìn)行的沉積物、泥沙吸附MCs 的吸附動(dòng)力學(xué)過(guò)程擬合結(jié)果一致.

2.1.2 吸附等溫線(xiàn) 如圖 1(b)和表 2 所示,Langmuir、Freundlich、Temkin 這3 個(gè)模型擬合的相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.95,表明這3 種模型都能很好地?cái)M合SPM 吸附MC-LR 的過(guò)程.Freundlich 模型擬合參數(shù)的相關(guān)系數(shù)(R2)略大于其他2 種模型,這表明MC-LR 在SPM 上的吸附過(guò)程更符合Freundlich 模型,也就是說(shuō)SPM 吸附MC-LR 是一種以化學(xué)吸附為主導(dǎo)的多分子層吸附過(guò)程,該研究結(jié)果與Mohamed 等[25]進(jìn)行的沉積物吸附MCs 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.且1/n 介于0～1 之間,表明MC-LR 在SPM 上的吸附較為容易進(jìn)行.通過(guò)Langmuir 等溫吸附參數(shù)可知,該過(guò)程中SPM 對(duì)MC-LR 的最大吸附量可達(dá)1720μg/g.

2.2 大型溞固定率的響應(yīng)

毒理實(shí)驗(yàn)中,固定率是最直觀(guān)地反映測(cè)定物濃度影響被試生物的指標(biāo).如圖2 所示,在暴露實(shí)驗(yàn)期間,空白對(duì)照組中大型溞48h 固定率為4%,小于5%,表明利用本批次大型溞所進(jìn)行的暴露實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是合理的[26].同時(shí),在SPM組中,經(jīng)過(guò)24h暴露后,大型溞的固定率為8.44%,略高于空白對(duì)照組,這表明SPM 可能對(duì)大型溞存在輕微毒性或者通過(guò)影響大型溞的活動(dòng)使大型溞被固定.當(dāng)暴露實(shí)驗(yàn)進(jìn)行

暴露24h 時(shí),MC-LR 劑量為31.51,52.52,73.52和94.53μg/g 的4 個(gè)處理組中大型溞的抑制率均存在顯著差異(P<0.05),且抑制率隨著復(fù)合體上MC-LR 含量的增加而增加;當(dāng)暴露實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到第48h 時(shí),MC-LR 劑量為31.51,52.52μg/g 的2 個(gè)處理組中大型溞固定率差異更加明顯,但MC-LR 劑量為73.52 和94.53μg/g 的2 個(gè)處理組中大型溞固定率差異不顯著(P>0.05),分別為84.44%和93.77%.在這2個(gè)MC-LR 劑量濃度下,幾乎所有大型溞的活動(dòng)都受到了抑制,甚至已經(jīng)嚴(yán)重影響到大型溞的生理機(jī)能.此外,大型溞的24 和48h 的EC50分別為94.06 和44.37μg/g.

2.3 大型溞體內(nèi)SPM-MC-LR 復(fù)合體的生物累積

如圖3 所示,空白對(duì)照組中,實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)經(jīng)過(guò)饑餓處理后的大型溞腸道內(nèi)僅有少量柵藻殘留,暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),僅在腸道末端有少量未排出的殘留物.在MC-LR 劑量為0 和31.51μg/g 的2 個(gè)處理組中,經(jīng)過(guò)24 和48h 的暴露后,大型溞的腸道內(nèi)充滿(mǎn)了復(fù)合體顆粒物且分布較為均勻,這可能與大型溞的腸道蠕動(dòng)有關(guān),在經(jīng)過(guò)48h 暴露實(shí)驗(yàn)處理的大型溞的觸角上還附有少量復(fù)合體顆粒物.而在MC-LR 劑量為52.52,73.52,94.53μg/g 的3 個(gè)較高劑量處理組中,經(jīng)過(guò)24h 暴露實(shí)驗(yàn)處理過(guò)后的大型溞腸道內(nèi)也均勻布滿(mǎn)復(fù)合體顆粒物,且其觸角上沒(méi)有出現(xiàn)明顯的復(fù)合體顆粒物附著;但在經(jīng)過(guò)48h 暴露實(shí)驗(yàn)處理后,大型溞體表及觸角上顆粒附著物明顯增多,且在MC-LR 劑量為73.52 和94.53μg/g 的2 個(gè)高劑量處理組中的大型溞腸道內(nèi)還出現(xiàn)了復(fù)合體顆粒物在前段腸阻塞現(xiàn)象,這可能是因?yàn)楦邼舛葟?fù)合體顆粒物使大型溞生理活性受到抑制,大型溞腸道蠕動(dòng)頻率降低,無(wú)法將復(fù)合體顆粒物排出體外.

圖3 初始,24 和48h 后不同處理組中SPM-MC-LR 復(fù)合體顆粒物在大型溞腸道累積情況Fig.3 Accumulation of complex particulate matter of SPMMC-LR in the intestines of Daphnia magna after 0, 24 and 48h exposure in different treatment groups

2.4 大型溞體內(nèi)酶活性的響應(yīng)

當(dāng)大型溞暴露在不同劑量的復(fù)合體顆粒物當(dāng)中時(shí),可能會(huì)破壞大型溞體內(nèi)的生物氧化劑與抗氧化劑比例的平衡,導(dǎo)致活性氧(ROS)水平升高,從而對(duì)細(xì)胞造成損傷[27].丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物,是評(píng)價(jià)自由基引起嚴(yán)重氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷的指標(biāo).由于氧化應(yīng)激是對(duì)應(yīng)激因素的第一反應(yīng),細(xì)胞最初啟動(dòng)抗氧化防御和解毒過(guò)程.超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)在抗氧化防御系統(tǒng)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用,谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)主要參與細(xì)胞解毒過(guò)程.

MDA 是生物體發(fā)生脂質(zhì)氧化的終產(chǎn)物,通過(guò)測(cè)定生物體內(nèi)MDA 的含量,可反映出生物體脂質(zhì)氧化的程度,從而間接反映生物體內(nèi)細(xì)胞損傷的程度[28].由圖4(a)可知,與對(duì)照組相比,在經(jīng)過(guò)24h 暴露處理后,MC-LR 劑量為0μg/g 處理組中MDA 含量稍高于空白對(duì)照組,且存在顯著差異(P<0.05);但在經(jīng)過(guò)48h暴露處理后,0μg/g處理組中MDA含量明顯低于對(duì)照組,說(shuō)明大型溞吞食SPM 顆粒能夠稍微減緩由于饑餓而產(chǎn)生的氧化損傷.同時(shí),在經(jīng)過(guò)48h 暴露處理后,5 個(gè)處理組中的MDA 含量呈正向劑量依賴(lài),且各處理組中MDA 含量存在顯著差異(P<0.05).

CAT 的主要功能是將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O 和O2以減少其對(duì)機(jī)體的傷害;一般情況下,發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí),生物體內(nèi)的SOD 和CAT 的變化趨勢(shì)同步[29].如圖4(c)所示,在經(jīng)過(guò)24 和48h 暴露處理后,各個(gè)處理組中CAT 活性變化趨勢(shì)與SOD 完全一致,且酶活性變化均與復(fù)合體顆粒物上MC-LR 的劑量呈正相關(guān),這表明生物體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí),可通過(guò)SOD 和CAT 的共同作用來(lái)減少機(jī)體內(nèi)活性氧自由基對(duì)于機(jī)體的氧化損傷程度.在MC-LR 劑量為73.52 和94.53μg/g 這2 個(gè)高劑量處理組中,經(jīng)過(guò)48h 暴露處理后的SOD 和CAT 活性相較于24h 時(shí)均有降低(SOD 和CAT 分別降低了17.66%、20.96%和5.84%、15.45%),這可能是大型溞體內(nèi)的活性氧自由基過(guò)高,造成部分細(xì)胞直接失活,從而導(dǎo)致大型溞抵抗氧化應(yīng)激的能力減弱.Cui等[30]將大型溞急性暴露于農(nóng)藥氟苯二胺中,也觀(guān)察到類(lèi)似的抗氧化酶活性變化.

GST 是一種多功能酶,其主要作用是代謝脂質(zhì)過(guò)氧化物以及參與催化谷胱甘肽(GSH)與異種生物和細(xì)胞毒醛的結(jié)合,能夠?qū)C-LR 轉(zhuǎn)化為具有更強(qiáng)水溶性以及更好排泄的谷胱甘肽絡(luò)合物(GSH).有研究證實(shí)GST 活性隨暴露污染物濃度的增加而升高[11,31-32].如圖4(d)所示,在經(jīng)過(guò)24h 暴露處理后,各處理組中的GST 活性相較于對(duì)照組均有不同程度的升高(分別增加了0.8029 倍、1.634 倍、3.251 倍、5.432 倍和5.887 倍)并存在顯著差異(P<0.05),且GST 活性隨著復(fù)合體顆粒物上MC-LR 劑量的增加而升高.經(jīng)過(guò)48h 暴露處理后,各處理組中的GST 活性較對(duì)照組仍有不同程度的增加,并且依舊呈現(xiàn)出正向劑量依賴(lài)性,但在MC-LR 劑量為73.52 和94.53μg/g 的2 個(gè)處理組中GST 活性不存在顯著差異(P>0.05).綜合來(lái)看,GST 活性呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性增加.

3 討論

3.1 SPM-MC-LR 復(fù)合體對(duì)大型溞的固定率呈正向劑量和時(shí)間依賴(lài)性

比較各處理組中24h 和48h 大型溞的固定率可以發(fā)現(xiàn),在MC-LR 劑量為52.52,73.52,94.53μg/g 這3個(gè)處理組中,相較于24h大型溞的固定率,48h時(shí)大型溞的固定率增加幅度較大,分別增加了1.56 倍、1.09倍和0.79 倍,且24h 的EC50相比于48h 增加了1.12倍,這表明高濃度復(fù)合體顆粒物對(duì)大型溞的毒性作用不僅表現(xiàn)出正向劑量依賴(lài)性,同時(shí)還表現(xiàn)出正向時(shí)間依賴(lài)性(圖5 路徑④).

大型溞作為一種非選擇性濾食性浮游動(dòng)物,可以無(wú)選擇性地?cái)z取小于70μm的小顆粒物質(zhì)[33],本研究所用SPM 幾乎都能通過(guò)大型溞攝食行為進(jìn)入到腸道內(nèi).SPM 所具有的小粒徑、高比表面積等特性為MC-LR 的吸附提供了充足的吸附位點(diǎn),MC-LR以吸附在SPM 上的方式進(jìn)入大型溞的腸道內(nèi),并能在大型溞體內(nèi)消化液的作用下被解吸出來(lái),相較于MC-LR 溶液,經(jīng)顆粒物負(fù)載后MC-LR 在大型溞體內(nèi)的生物累積明顯增加[34-35];其他研究也表明,當(dāng)納米二氧化鈦顆粒存在時(shí),鎘等重金屬在金魚(yú)和大型溞體內(nèi)的生物累積量明顯增加[36-37].高劑量復(fù)合體顆粒物上所吸附的MC-LR 量更大,解吸出來(lái)的MC-LR 對(duì)大型溞產(chǎn)生的生物毒性也更強(qiáng).因此,在梯度劑量復(fù)合體顆粒物暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),其對(duì)大型溞的固定率呈現(xiàn)正向的劑量、時(shí)間依賴(lài)性.值得注意的是,MC-LR 劑量為94.53μg/g 處理組(若MC-LR全部解吸,體系中MC-LR 的濃度可達(dá)37.81μg/L)中,大型溞48h 固定率高達(dá)93.77%,與Wan 等[10]的研究中25mg/L MC-LR 單獨(dú)暴露對(duì)應(yīng)的固定率相近,而且該研究中48h的EC50(13.46mg/L)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于本研究(若全部解吸,體系中MC-LR 濃度為17.75μg/L),表明SPM 可以大幅度增強(qiáng)MC-LR 對(duì)大型溞的毒性.類(lèi)似的研究指出懸浮顆粒物存在時(shí),同一濃度下菲對(duì)大型溞的固定率可以提高1.6～2.7 倍[35].

3.2 SPM-MC-LR 復(fù)合體影響大型溞的游泳行為和腸道蠕動(dòng)功能

微納米塑料可通過(guò)靜電相互作用等粘附于大型溞體表和觸角上,從而導(dǎo)致大型溞被固定下來(lái)甚至造成物理?yè)p傷[38-39].本研究中也發(fā)現(xiàn),復(fù)合體顆粒物會(huì)在大型溞的體表和第二觸角上粘附(圖3),第二觸角是大型溞運(yùn)動(dòng)的重要器官,運(yùn)動(dòng)受阻也可能是大型溞被固定的原因之一.從復(fù)合體顆粒物中解吸出來(lái)的MC-LR 對(duì)大型溞所產(chǎn)生的神經(jīng)毒性也會(huì)使得其游動(dòng)速度大大降低,從而更有利于顆粒物在觸角上的附著,進(jìn)而對(duì)大型溞的游泳行為產(chǎn)生負(fù)面影響,最終對(duì)其生存造成威脅[40-41].

研究表明,微納米顆粒容易在大型溞的胸足部和消化道內(nèi)累積[38,42],嚴(yán)重時(shí)還可能出現(xiàn)腸道阻塞現(xiàn)象[43].本實(shí)驗(yàn)中MC-LR 劑量為52.52,73.52 和94.53 μg/g 的3 個(gè)高劑量處理組中,暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),出現(xiàn)了復(fù)合體顆粒物在大型溞腸道前端堆積的現(xiàn)象,這可能是因?yàn)閺?fù)合體顆粒物上解吸出來(lái)的MC-LR 所產(chǎn)生的毒性作用使得大型溞腸道蠕動(dòng)功能減弱甚至喪失,大型溞不能通過(guò)腸道蠕動(dòng)將復(fù)合體排出體外,反向增加了復(fù)合體顆粒物在腸道內(nèi)的解吸時(shí)間,從而加重了復(fù)合體顆粒物對(duì)大型溞的毒性作用(圖3).當(dāng)大型溞攝食微塑料后,規(guī)則的微塑料比不規(guī)則的微塑料更容易排出體外,對(duì)大型溞的毒性作用也更弱[44].SPM 不規(guī)則的形狀也增加了復(fù)合體顆粒物在腸道內(nèi)的接觸時(shí)間.但在微納米塑料對(duì)大型溞的暴露實(shí)驗(yàn)中,大型溞所表現(xiàn)的一切現(xiàn)象均是因微納米塑料對(duì)大型溞產(chǎn)生了毒性作用.在本研究當(dāng)中,SPM 對(duì)大型溞幾乎沒(méi)有毒性作用,僅作為一種污染物載體;但吸附在SPM 上的MC-LR 通過(guò)大型溞攝食SPM 而進(jìn)入其腸道內(nèi),在消化液的作用下解吸出來(lái),從而對(duì)大型溞產(chǎn)生毒性作用.

3.3 大型溞在SPM-MC-LR 復(fù)合體作用下產(chǎn)生氧化應(yīng)激

當(dāng)大型溞體內(nèi)出現(xiàn)脅迫引起氧化應(yīng)激時(shí),體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)可通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化酶活性來(lái)維持機(jī)體的正常運(yùn)轉(zhuǎn).MDA 含量的上升表明大型溞體內(nèi)出現(xiàn)的氧化應(yīng)激程度已經(jīng)超出了抗氧化酶調(diào)節(jié)的閾值,從而導(dǎo)致大型溞體內(nèi)細(xì)胞出現(xiàn)脂質(zhì)過(guò)氧化(圖5路徑①)[45],這可能會(huì)導(dǎo)致大型溞的死亡(圖4(a)).

SOD-CAT 系統(tǒng)是機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)抗氧化系統(tǒng)的第一道防線(xiàn),SOD-CAT 這2 種酶活性增加能夠有效清除氧化應(yīng)激過(guò)程中產(chǎn)生的和H2O2等活性氧自由基,從而減輕其對(duì)機(jī)體的氧化損傷[34].因此,在經(jīng)過(guò)24 和48h 的梯度劑量復(fù)合體顆粒物暴露處理后,各處理組中的SOD 和CAT 酶活性均有不同程度的升高(圖4(b)和(c)),表明大型溞攝食復(fù)合體顆粒物后,導(dǎo)致體內(nèi)出現(xiàn)氧化應(yīng)激.但在MC-LR 劑量為73.52 和94.53 μg/g 的2 個(gè)處理組中,48h 暴露結(jié)束后,大型溞體內(nèi)的SOD 和CAT 酶活性較24h 分別降低了21.44%、26.51%和6.2%、18.27%,結(jié)合圖2各組中固定率的變化情況來(lái)看,這2 個(gè)處理組中的大型溞可能出現(xiàn)了氧化應(yīng)激的程度過(guò)高的現(xiàn)象,導(dǎo)致SOD 和CAT 抗氧化酶的活性被抑制(圖5 路徑②)[46].對(duì)照組中SOD 和CAT 活性升高可能是由饑餓引起的ROS 活性上升,Bu 等[47]已經(jīng)證實(shí)了短期禁食會(huì)使得魚(yú)體內(nèi)的ROS 和MDA 含量明顯增加.暴露結(jié)束時(shí),0 μg/g 處理組中SOD 和CAT 酶活性稍有降低,表明吞食SPM 顆粒能夠?yàn)榇笮蜏械纳嫣峁┮欢ǖ臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì),這在一定程度上減輕饑餓帶來(lái)的氧化損傷(圖4(b)和(c)).Zhang 等[48]的研究證實(shí)了這一點(diǎn),該研究將大型溞暴露在含400mg/L 的天然懸浮顆粒物(d50=38.42 μm)溶液中,即使7d 不喂食,大型溞仍舊十分活躍,即懸浮顆粒物可能能為大型溞的生存提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì).

GST 是抗氧化系統(tǒng)的第二道防線(xiàn),主要負(fù)責(zé)MC-LR 的生物轉(zhuǎn)化以及脂質(zhì)過(guò)氧化物的代謝[11,49],GST 活性的升高則表明機(jī)體內(nèi)發(fā)生的氧化應(yīng)激靠第一道防線(xiàn)已經(jīng)不能調(diào)節(jié)[34].在經(jīng)過(guò)24 和48h 暴露處理后,5 個(gè)梯度劑量復(fù)合體顆粒物處理組中,GST活性變化呈正向劑量和時(shí)間依賴(lài)(圖4(d)).Ortiz 等[11]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)MC-LR 濃度(>50μg/L)過(guò)高時(shí),大型溞體內(nèi)的GST 活性會(huì)降低,即大型溞對(duì)MC-LR 的解毒功能會(huì)受到抑制.本研究中GST 活性并沒(méi)有下降,表明從復(fù)合體顆粒物中解吸出來(lái)的MC-LR 還沒(méi)有達(dá)到抑制大型溞生物解毒能力的濃度(圖5 路徑③).同時(shí),GST 活性呈現(xiàn)出的正向劑量、時(shí)間依賴(lài)性也表明在暴露實(shí)驗(yàn)的整個(gè)過(guò)程中,所產(chǎn)生的氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)都必須靠?jī)傻婪谰€(xiàn)的共同作用.此外,研究表明7d 齡大型溞經(jīng)過(guò)10μg/L MC-LR 的48h 暴露后,GST活性相較于對(duì)照組增加不到1 倍[11],低于本研究中MC-LR 劑量為31.51μg/g 處理組(若MC-LR 全部解吸,體系中MC-LR 的濃度可達(dá)12.60μg/L)的GST 活性增量(1.5 倍),表明SPM-MC-LR 復(fù)合體的毒性強(qiáng)于游離的MC-LR.

本研究中,由MC-LR 在大型溞體內(nèi)所引起的氧化應(yīng)激、毒性作用和顆粒物附著在體表及觸角上對(duì)于大型溞行動(dòng)限制的共同作用使得大型溞被固定下來(lái)(圖5 路徑⑤).但在SPM 濃度一致的條件下,綜合5 個(gè)梯度劑量復(fù)合體顆粒物處理中大型溞的固定率來(lái)看,從復(fù)合體顆粒物中解吸出來(lái)的MC-LR 誘導(dǎo)發(fā)生的氧化應(yīng)激和產(chǎn)生的毒性作用才是導(dǎo)致高固定率出現(xiàn)的主因(圖5).

4 結(jié)論

4.1 SPM吸附MC-LR的平衡時(shí)間為36h,擬合最大吸附量為1720μg/g.該吸附過(guò)程更符合擬二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型和Freundlich 等溫吸附模型,是一種較為容易發(fā)生的以化學(xué)吸附為主導(dǎo)的多分子層吸附.

4.2 MDA 含量、SOD 和CAT 活性以及GST 活性均呈正向劑量和時(shí)間依賴(lài),但當(dāng)復(fù)合體濃度較高時(shí)(MC-LR 劑量為73.52 和94.53μg/g),大型溞組織內(nèi)氧化應(yīng)激程度過(guò)高會(huì)抑制SOD 和CAT 活性.

4.3 SPM-MC-LR 復(fù)合體能夠在大型溞體內(nèi)引起氧化應(yīng)激、產(chǎn)生毒性以及在大型溞體表和觸角上黏附.在上述過(guò)程作用下大型溞被固定下來(lái),且固定率呈正向劑量和時(shí)間依賴(lài).

4.4 SPM 幾乎不會(huì)對(duì)大型溞產(chǎn)生毒性作用,但是其作為污染物載體,吸附MC-LR 后可能產(chǎn)生相比于游離MC-LR 更為明顯的毒性.