溫度影響下Anammox-DAMO 系統(tǒng)N2O 產(chǎn)消機(jī)制及調(diào)控

韓夢茹,樓菊青,徐 帆(浙江工商大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,浙江 杭州 310018)

反硝化厭氧甲烷氧化(DAMO)過程可以在厭氧條件下同步實現(xiàn)脫氮和CH4減排.該過程是一種獨(dú)特的反硝化反應(yīng),當(dāng)硝酸鹽或亞硝酸鹽作為電子受體被還原為N2的同時, CH4作為唯一電子供體被氧化為CO2[1].研究表明,DAMO 過程對海洋沉積物中CH4的消耗減排占據(jù)了主導(dǎo)地位,且在濕地[2]、河流[3]、深水湖泊[4]等自然生境以及農(nóng)業(yè)土壤和廢水中均存在,該過程在全球碳氮循環(huán)的過程中起關(guān)鍵作用.DAMO 微生物最早在淡水沉積物培養(yǎng)物中富集而得,起主導(dǎo)作用的功能微生物可以分為兩大類:NC10 門細(xì)菌的 Candidatus ‘Methylomirabilis oxyfera’(M. oxyfera)[5]和隸屬于 ANME(anaerobic methanotrophic archaea,厭氧甲烷氧化古菌)中的一個簇ANME-2d 的Candidatus ‘Methanoperedens nitroreducens’(M. nitroreducens)[6].其中,DAMO 古菌通常被認(rèn)為只能將硝酸鹽(NO3-)還原為亞硝酸鹽(NO2-),因此需要與其他微生物協(xié)同作用以達(dá)到理想的脫氮效果.目前的研究表明,DAMO 古菌可以與DAMO 細(xì)菌協(xié)同進(jìn)一步將NO2-還原為N2[7];同時,也已有研究發(fā)現(xiàn)在污水處理廠中DAMO 微生物與厭氧氨氧化(Anammox)細(xì)菌共存現(xiàn)象[8],因此可以共培養(yǎng)DAMO古菌與Anammox 細(xì)菌形成耦合系統(tǒng),通過Anammox細(xì)菌進(jìn)一步利用DAMO 古菌產(chǎn)生的NO2-作為電子受體?污水中的NH4+作為電子供體產(chǎn)生N2,從而實現(xiàn)總氮的高效去除和溫室氣體的減量排放[9].

將硝酸鹽型-DAMO與厭氧氨氧化聯(lián)合應(yīng)用,能夠在兩類優(yōu)勢菌種的協(xié)同作用下將各種形式的氮轉(zhuǎn)化為N2,同時實現(xiàn)總氮去除和CH4減排[10].然而,在對Anammox-DAMO 耦合系統(tǒng)的研究過程中檢測到了N2O,這說明并不是所有的氮都能轉(zhuǎn)化為N2被去除,而是在脫氮過程中生成了N2O 這一中間產(chǎn)物.迄今為止的研究結(jié)果沒有證據(jù)表明厭氧氨氧化細(xì)菌在正常代謝過程中會產(chǎn)生N2O[11-13].N2O 作為反硝化過程的中間產(chǎn)物,一般認(rèn)為在DAMO 過程不會出現(xiàn),這是因為DAMO 微生物的代謝途徑特殊,DAMO 細(xì)菌利用NO 歧化酶將NO 轉(zhuǎn)化為N2和O2,產(chǎn)生的O2再對CH4進(jìn)行氧化,略過了中間體N2O的生成[14].雖然DAMO 微生物中存在編碼N2O 生成及降解的基因,但相關(guān)研究的實驗結(jié)果表明DAMO系統(tǒng)中有少量N2O 的產(chǎn)生,然而降解N2O 的基因卻未能表達(dá)[15].目前關(guān)于廢水處理過程中N2O 產(chǎn)生的研究大多集中在傳統(tǒng)反硝化工藝,鮮少有人將研究聚焦于DAMO、Anammox 等新型脫氮技術(shù).

溫度變化會影響與N2O 產(chǎn)消相關(guān)的微生物及酶的活性,從而引起N2O 積累量的波動.有研究者利用A/O SBR 反應(yīng)器探究N2O 隨溫度變化的產(chǎn)消情況,發(fā)現(xiàn)在15℃的低溫條件下N2O 排放量比25℃時增加了1.9 倍[16].Anammox 與DAMO 耦合脫氮過程中N 代謝途徑較為復(fù)雜,不同溫度影響下該系統(tǒng)N2O 的產(chǎn)消規(guī)律如何變化還有待探究.目前關(guān)于污水脫氮工藝中N2O 排放的研究多集中在中低溫條件,然而在某些特定的氣候條件下高溫也會顯著影響廢水處理效果.本文以Anammox-DAMO 系統(tǒng)為研究對象,探究中、高溫影響下該系統(tǒng)的性能與N2O產(chǎn)消變化規(guī)律,通過分子生物學(xué)手段及動力學(xué)機(jī)制探明N2O 產(chǎn)消的代謝途徑,并提出N2O 減排策略.

1 材料與方法

1.1 試驗裝置

批次試驗使用內(nèi)徑7.0cm、高14.0cm,有效容積為250mL 的厭氧子反應(yīng)器(圖1);連續(xù)試驗使用內(nèi)徑16cm、高30cm、容積為3.5L 的厭氧母反應(yīng)器[17].反應(yīng)器所有取樣口均設(shè)有閥門,閥門關(guān)閉時,反應(yīng)器呈全封閉狀態(tài),維持反應(yīng)器內(nèi)厭氧狀態(tài),整個反應(yīng)過程中使用磁力攪拌器進(jìn)行連續(xù)攪拌,保證反應(yīng)器內(nèi)泥水混合均勻.

圖1 試驗裝置Fig.1 Test device diagram

1.2 接種污泥與營養(yǎng)液

試驗系統(tǒng)為以Anammox 菌和DAMO 古菌為優(yōu)勢菌種的Anammox-DAMO 系統(tǒng),以西湖底泥?杭州西溪河底泥與農(nóng)田水稻土壤的混合污泥為接種物,在厭氧條件下供給CH4?NO3-和 NH4+,試驗期間系統(tǒng)運(yùn)行穩(wěn)定.

營養(yǎng)液新鮮配制,使用前氮吹30min 以排除O2,組成如下:KH2PO40.05g/L;CaCl2·2H2O 0.3g/L;MgSO4·7H2O 0.2g/L;NaHCO31.05g/L;微量元素含量為1.25mL/L.微量元素包括(g/L):15 EDTA,0.43 ZnSO4·7H2O,0.24 CoCl2·6H2O,0.99 MnCl2·4H2O,0.25 CuSO4,0.22(NH4)6MoO24·4H2O,0.19 NiCl2·6H2O,0.067 SeO4,0.014 H3BO3, 0.05 Na2WO4·2H2O[18].營養(yǎng)液以去離子水為溶劑配制.

1.3 試驗方法

1.3.1 批次試驗 為了研究溫度對系統(tǒng)的短期影響,并建立溫度影響下N2O 產(chǎn)消動力學(xué)模型,進(jìn)行為期10d 的批次試驗.從母反應(yīng)器中各取 200mL 泥水混合液注入?yún)捬踝臃磻?yīng)器中,各子反應(yīng)器的 NO3-和NH4+起始濃度為 20mg/L,CH4濃度為 80mg/L,pH=7.0,試驗溫度分別設(shè)置為20, 25, 30, 35, 40℃,每組設(shè) 3 個平行.試驗期間,每 24h 取氣樣3.0mL,水樣3.0mL,經(jīng) 0.22μm 微孔濾膜過濾后測定NO3--N?NO2--N 及NH4+-N 濃度,同時監(jiān)測系統(tǒng)中CH4含量以及N2O 濃度變化.

1.3.2 連續(xù)試驗 基于批次試驗結(jié)果,篩選出反應(yīng)效率最優(yōu)以及N2O 積累量最多的兩組具有代表性的溫度條件進(jìn)行連續(xù)試驗,以揭示溫度對Anammox-DAMO 系統(tǒng)的長期影響.以DAMO 微生物倍增周期25d 為一個實驗周期進(jìn)行3 個周期實驗,保持各系統(tǒng)pH 值為7.0～7.2.每48h 取各反應(yīng)器水樣5.0mL,氣樣4.0mL,利用紫外分光光度計和氣相色譜儀分別測定NO3--N、NO2--N、NH4+-N、CH4、N2O的含量.以7d 為一個加藥周期,每7d 補(bǔ)充一次NO3-、NO2-、CH4.在試驗前中后期分別取泥水混合物30mL,熱提法提取EPS 提取液后測量含蛋白質(zhì)(PNs)和多糖(PSs)的胞外聚合物(EPSs)的組成以及濃度變化.在連續(xù)試驗前、中、后期分別取5mL 污泥樣品進(jìn)行高通量測序分析.

1.4 分析方法

NO3--N、NO2--N 和NH4+-N 濃度使用雙束紫外-可見分光光度計(TU1901)按照標(biāo)準(zhǔn)方法測量.使用氣相色譜儀(GC2030,島津)測量頂空N2O 含量以及CH4含量[19].采用pH 計(梅特勒FG2)監(jiān)測反應(yīng)器內(nèi)pH 值的變化.采用熱提法分離EPS[20].PNs 和PSs的測定方法分別為福林酚試劑法和蒽酮法[21].通過Usearch 軟件和Gold 數(shù)據(jù)庫將剩余序列聚集到操作分類單元(OTU)中.利用E.Z.N.A. ?土壤DNA 試劑盒(Omega Bio-tek,美國)進(jìn)行樣品DNA 抽提進(jìn)行后續(xù)宏基因組測序.Illumina NovaSeq 測序平臺用于宏基因組測序[22].

1.5 動力學(xué)模型

采用酶動力學(xué)方程[23]模擬NO3-、NH4+的還原以及N2O 的產(chǎn)生和還原,如式(1)所示.

式中: RER為酶活性函數(shù); Vmax,R為相應(yīng)還原酶反應(yīng)的最大比合成/活化速率,d-1; KE,i為酶誘導(dǎo)的半飽和常數(shù),mg/L; KI,R為相應(yīng)還原酶抑制系數(shù),mg/L; Ci為底物的水相濃度,mg/L; R 為還原酶(即Nar、Nir、Nos); i 為相應(yīng)底物(即NO3-、NH4+、N2O); CT為溫度變化因素.

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度對Anammox-DAMO 系統(tǒng)性能及N2O 產(chǎn)消的影響

2.1.1 溫度對Anammox-DAMO 系統(tǒng)性能的影響根據(jù)厭氧氨氧化微生物和DAMO 微生物的最適生長溫度條件[24-25],選擇20～40℃進(jìn)行短期試驗,對試驗結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析.從圖2 可見,NO3-、NH4+、CH4的降解速率均隨溫度的升高先增大后減小,而N2O 的濃度峰值整體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢.系統(tǒng)在溫度為40℃時,N2O 的濃度峰值達(dá)到最大.對溫度影響下的批次實驗結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析,發(fā)現(xiàn)40℃溫度條件對N2O 排放量的影響最大,另外對各環(huán)境因素進(jìn)行正交實驗,結(jié)果顯示30℃為該系統(tǒng)脫氮性能最優(yōu)的溫度條件,因此將30℃作為對照組,40℃作為實驗組進(jìn)行長期試驗研究,以探明不同溫度條件下Anammox-DAMO 系統(tǒng)性能及N2O 產(chǎn)消規(guī)律.

圖2 短期試驗溫度對Anammox-DAMO 系統(tǒng)污染物降解及N2O 峰值影響Fig.2 Effect of temperature on contaminant degradation and peak concentration of N2O in the Anammox-DAMO system in a short-term test

圖3(a)和圖3(b)表明, Anammox-DAMO系統(tǒng)在40℃高溫條件下的脫氮性能要低于30℃,但隨著時間的推移,R2 系統(tǒng)的脫氮性能較前期有提升,這說明該體系可以逐漸適應(yīng)高溫的脅迫,這主要?dú)w因于微生物會在極端環(huán)境下產(chǎn)生特殊的蛋白質(zhì)和酶來幫助細(xì)胞抵御脅迫.有研究表明[26],瞬時高溫沖擊會對Anammox 菌的活性產(chǎn)生抑制作用,但長期運(yùn)行下系統(tǒng)的性能逐漸恢復(fù),這說明Anammox 菌具有緩解高溫抑制的內(nèi)部機(jī)制.R2 系統(tǒng)受到高溫的影響,在反應(yīng)過程中出現(xiàn)了亞硝酸鹽的積累,平均積累濃度為(1.43±0.47) mg/L.從圖3(c)可知,R2 系統(tǒng)中的硝酸鹽、氨氮、CH4降解速率均低于R1 系統(tǒng),說明高溫對系統(tǒng)中微生物活性產(chǎn)生了抑制作用,影響了其正常代謝.有研究表明,Anammox 活性(SAA)會隨著溫度的升高呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢,溫度對Anammox 菌群蛋白質(zhì)變化情況的影響也說明了Anammox 菌的活性在高溫下受到抑制[27].有研究探究了溫度對Anammox-DAMO 共培養(yǎng)系統(tǒng)的影響,結(jié)果表明溫度對耦合系統(tǒng)的影響同樣呈先上升后下降的趨勢,在高溫下微生物活性降低[28-30].

圖3 長期試驗溫度對Anammox-DAMO 系統(tǒng)中污染物降解影響Fig.3 Effect of temperature on contaminant degradation in the Anammox-DAMO system in a long-term test

在兩個系統(tǒng)的長期運(yùn)行過程中均檢測到了硝酸鹽異化還原為銨(DNRA)反應(yīng),DNRA 是一個特殊的生物反應(yīng)過程,使用亞硝酸鹽作為中間物將硝酸鹽還原成銨[31-32].在R1 系統(tǒng)中,硝酸鹽降解速率為0.08mmol/(L·d),氨氮降解速率為 0.05mmol/(L·d),CH4降解速率為0.04mmol/(L·d),CH4降解速率與硝酸鹽降解速率實際比值(1:2.00)與DNRA 反應(yīng)的理論比值(1:2.10)[33]相符,說明在R1 系統(tǒng)中同時存在DAMO、Anammmox、DNRA 反應(yīng).R2 系統(tǒng)中硝酸鹽降解速率為 0.06mmol/(L·d),氨氮降解速率為0.04mmol/(L·d),CH4降解速率為0.03mmol/(L·d),也觀察到了相同的結(jié)果,證明了DAMO、Anammmox、DNRA 反應(yīng)的共存.

2.1.2 溫度對Anammox-DAMO 系統(tǒng)N2O 產(chǎn)消的影響 由圖4 可知,2 個系統(tǒng)均觀察到了明顯的N2O產(chǎn)消,且R2 系統(tǒng)中N2O 的總體累積量大于R1 系統(tǒng),其中R1 系統(tǒng) N2O 平均峰值濃度為(4.86±0.30)mg/L,R2 系統(tǒng)為(6.85±0.59) mg/L.

相比于R1 系統(tǒng),R2 系統(tǒng)產(chǎn)生了更多的N2O,研究表明,在N-DAMO系統(tǒng)中,nrfA的轉(zhuǎn)錄水平隨亞硝酸鹽濃度的增加而顯著上調(diào)[34],推測在R2 系統(tǒng)中DAMO 古菌為了應(yīng)對亞硝酸鹽的脅迫加劇了DNRA 反應(yīng)的發(fā)生.在高濃度亞硝酸鹽影響下DNRA 過程會生成NO,出于對NO 的解毒作用,DNRA將NO轉(zhuǎn)化為N2O[34].Pereira[35]在研究操作條件對厭氧氨氧化系統(tǒng)N2O 產(chǎn)生的影響過程中發(fā)現(xiàn)亞硝酸鹽是N2O 生成和積累的關(guān)鍵,這主要?dú)w因于AOB 中由細(xì)胞色素P460(CytL)催化的厭氧羥胺(NH2OH)解毒途徑[36].Ding 等[37]也發(fā)現(xiàn)N2O 釋放率與亞硝酸鹽濃度呈正相關(guān),這是因為亞硝酸鹽和N2O 會競爭電子,當(dāng)用于亞硝酸鹽還原的電子通量高于用于N2O 還原的電子通量時,N2O 就會積累.同時,在亞硝酸鹽和硝酸鹽共存的情況下,亞硝酸鹽和硝酸鹽還原酶之間對電子供體的競爭也可能導(dǎo)致N2O 的不完全還原[38].另外,由于受到高溫影響,Anammmox 細(xì)菌活性受到抑制,易造成中間產(chǎn)物NO 的積累,為了防止NO 對微生物造成毒害作用,Anammox 細(xì)菌將NO 轉(zhuǎn)化為N2O[39],因此在R2 系統(tǒng)中產(chǎn)生更多的N2O.

2.2 溫度對Anammox-DAMO 系統(tǒng)N2O 產(chǎn)消過程中EPS 的影響

2.2.1 溫度對Anammox-DAMO 系統(tǒng)EPS 變化的影響 EPS 是一種高分子量聚合物,主要由多糖(PS)和蛋白質(zhì)(PN)組成,可用作保護(hù)層,以減弱惡劣環(huán)境對微生物的脅迫[40].此外,EPS 在微生物的生物膜形成?粒化和穩(wěn)定性中起重要作用[41].由圖5 可知,兩個系統(tǒng)中PN 含量的變化占主導(dǎo)地位,PS 含量整體變化幅度并不明顯,PN 含量隨著時間的推移先升高后降低,這是由于該體系在試驗前期需要通過增加PN含量來維持穩(wěn)定性.與R1系統(tǒng)不同,在R2系統(tǒng)中,PN含量在中、后期都較初期有更大的增加幅度.

圖5 Anammox-DAMO 系統(tǒng)中EPS 含量變化Fig.5 Changes in EPS content in the Anammox-DAMO system

總體而言,R2 系統(tǒng)在中后期PN 和PS 的含量都高于R1系統(tǒng),隨著溫度的增加,蛋白質(zhì)和多糖溶解并從污泥中釋放出來.R2 系統(tǒng)中PN 的量要比R1 系統(tǒng)顯著高很多(P<0.05),這是由于高溫脅迫下導(dǎo)致R2系統(tǒng)產(chǎn)生更多的PN 以適應(yīng)環(huán)境條件.在整個過程中,各組PN 均高于PS,這與其他研究相似[40,42].結(jié)果表明,R2系統(tǒng)中期的EPS與初期對比起來有所增加,PS含量穩(wěn)定在4.9mg/L, PN 含量由6.6 增加到11.3mg/L,可見,相較于PS,高溫沖擊對PN 的影響程度更大,這主要?dú)w因于微生物對惡劣環(huán)境的自我保護(hù)機(jī)制.作為影響細(xì)胞表面電荷和疏水性的一個因素,較高的PN 提高了Anammox-DAMO 系統(tǒng)中微生物的粘附性,并減輕了溫度沖擊對Anammox-DAMO 系統(tǒng)微生物的損傷[43].

R2 系統(tǒng)在高溫脅迫下產(chǎn)生更多的EPS,導(dǎo)致N2O 擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的傳質(zhì)阻力增加,N2O 還原酶的作用時間縮短使得N2O 排放量升高,這與Sabba等[44]的研究結(jié)果一致.

2.2.2 溫度對Anammox-DAMO 系統(tǒng)可溶性蛋白影響 圖6(a)和6(b)為初期(0d)的三維熒光圖,發(fā)現(xiàn)發(fā)射峰位于300～350nm 處,激發(fā)峰位于250～300nm處,通過與其他研究中熒光組分的激發(fā)和發(fā)射最大值位置進(jìn)行比較,該范圍內(nèi)顯示熒光激發(fā)峰的物質(zhì)為蛋白質(zhì)[45-47],其中激發(fā)峰在250～340nm,發(fā)射峰在280～380nm 處主要包含物為酪氨酸和色氨酸[52].激發(fā)峰在220～340nm,發(fā)射峰在380～520nm 處主要包含物為腐殖酸[47-50].根據(jù)實驗結(jié)果可知初期實驗測得的主要物質(zhì)是酪氨酸/色氨酸.

圖6 溫度對Anammox-DAMO 系統(tǒng)可溶性蛋白影響Fig.6 Effect of temperature on soluble proteins in the Anammox-DAMO system

從圖6(c)中可知,R1 系統(tǒng)三維熒光發(fā)射峰位于300～400nm 處,激發(fā)峰位于250～350nm 處,主要物質(zhì)為酪氨酸/色氨酸?微生物代謝物以及多糖.圖6(d)顯示R2 系統(tǒng)三維熒光發(fā)射峰位于300～450nm 處,激發(fā)峰位于200～350nm 處,主要物質(zhì)為酪氨酸/色氨酸、微生物代謝物、多糖以及富里酸.由圖中可得出EPS 中蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度明顯大于多糖?腐殖酸,說明系統(tǒng)中微生物更多的產(chǎn)生蛋白質(zhì)來適應(yīng)溫度變化對其影響.且R2 系統(tǒng)中期的熒光信號要明顯強(qiáng)于初期,并且強(qiáng)于同時期的R1 系統(tǒng)的熒光信號,表明高溫會對反應(yīng)器中的微生物活動產(chǎn)生影響,從而干擾有機(jī)物的分泌,產(chǎn)生更多的酪氨酸/色氨酸.有研究表明色氨酸類和酪氨酸類蛋白質(zhì)物質(zhì)與N2O 的排放量呈顯著正相關(guān)關(guān)系[51-52],因此R2 系統(tǒng)中更高的N2O 產(chǎn)生量可歸因于更多酪氨酸/色氨酸的生成.

從圖6(e)可知R1 系統(tǒng)三維熒光發(fā)射峰位于300～400nm 處,激發(fā)峰位于200～350nm 處,主要物質(zhì)為酪氨酸/色氨酸?微生物代謝物以及多糖.圖6(f)顯示R2 系統(tǒng)三維熒光發(fā)射峰位于300～400nm 處,激發(fā)峰位于250～350nm 處,主要物質(zhì)為酪氨酸/色氨酸?微生物代謝物?多糖.R2 系統(tǒng)末期的熒光信號與中期相比逐漸減弱,逐漸恢復(fù)到初期水平,并與R1 系統(tǒng)的熒光信號無顯著性差異,表明R2 中的微生物逐漸適應(yīng)高溫環(huán)境,這與系統(tǒng)性能的惡化與恢復(fù)趨勢一致.

2.3 溫度影響下Anammox-DAMO 系統(tǒng)N2O 產(chǎn)消的生物學(xué)機(jī)制

2.3.1 溫度對Anammox-DAMO 系統(tǒng)微生物群落變化的影響 如圖7(a)所示,R1 和R2 的優(yōu)勢菌門均為Proteobacteria,且分別占比33%和40%,它是厭氧氨氧化系統(tǒng)常見的一大門類,且有研究表明Proteobacteria 大多數(shù)是反硝化細(xì)菌, 并且Proteobacteria 中的大部分菌可以參與甲烷氧化過程,普遍存在于污水處理廠脫氮除磷工藝中[53].第二優(yōu)勢菌門是Chloroflexi,分別占比14%和17%,它的作用是在細(xì)胞生長過程中降解有機(jī)分子或分泌可溶性化合物.在溫度的影響下,R2 系統(tǒng)中的Firmicutes、Chloroflexi、Bacteroidetes 和Euryarchaeota 等嗜熱微生物豐度上升.相反在高溫脅迫下Actinobacteria和Ignavibacteriae 的豐度相比R1 有所下降,說明高溫環(huán)境不利于其生存.

圖7 微生物相對豐度分布Fig.7 Relative abundance distribution of microorganisms

圖7(b)顯示2 個系統(tǒng)中均發(fā)現(xiàn)了芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonad)、食酸菌屬(Acidovorax)、陶厄氏菌屬(Thauera)、甲基單胞菌屬(Methylomonas)、Methanoperedens nitroreducens、叢毛單胞菌屬(Comamonadaceae)、特呂珀菌屬(Truepera) 、 Kuenenia 、 甲 烷 微 菌 屬(Methylomicrobium).Acidovorax 是常見的反硝化菌,Thauera 是自養(yǎng)型反硝化細(xì)菌[54-56],相比于R1 系統(tǒng),這兩種菌屬豐度在R2 系統(tǒng)中均有所下降,表明高溫環(huán)境會抑制其生長.Tanikawa 等[57]認(rèn)為Acidovorax和Thauera 是反硝化過程中主要的N2O 還原劑,Zhao等[58]在Thauera 中檢測到了大部分N2O 還原酶編碼基因,證明了Thauera 在N2O 還原過程中的巨大貢獻(xiàn),R2系統(tǒng)中Thauera豐度的下降是N2O積累量更多的原因.另外,有研究證明Bacillus 可能在N2O 排放方面發(fā)揮巨大作用[34],本文在R2 系統(tǒng)中檢測到了該屬更高的豐度,這也是導(dǎo)致N2O 排放量更高的重要原因.Methylomonas 中存在亞硝酸鹽還原酶,其在R2 系統(tǒng)中的豐度明顯低于R1 系統(tǒng),導(dǎo)致R2 系統(tǒng)亞硝酸鹽大量積累.Methanoperedens nitroreducens 已知為進(jìn)行硝酸鹽驅(qū)動的厭氧甲烷氧化的n-DAMO 古菌,在R1系統(tǒng)中的占比為23.22%,在R2 系統(tǒng)中的占比為16.40%,由此可見高溫抑制了DAMO 古菌的生長,造成脫氮速率下降.Ca.Kuenenia 和Ca. Brocadia 與脫氮直接相關(guān),是常見的Anammox 細(xì)菌,在R1 系統(tǒng)中兩者的占比分別為17.64%和12.47%,在R2 系統(tǒng)中兩者的占比分別為19.01%和16.65%,可以看出Anammox兩個菌屬在R2 中占比升高.這可能是因為DNRA 反應(yīng)產(chǎn)生的銨促進(jìn)了Anammox 微生物的生長.在兩個系統(tǒng)中均未檢測到能夠進(jìn)行DNRA 反應(yīng)的典型微生物,因此推測DAMO 古菌利用甲烷厭氧氧化產(chǎn)生的電子發(fā)生了DNRA 反應(yīng).

2.3.2 溫度對Anammox-DAMO 系統(tǒng)微生物功能基因豐度變化影響 反硝化過程主要由4 種酶催化,即硝酸鹽還原酶(narGHI/napAB)、亞硝酸鹽還原酶(nirK/nirS)、NO 還原酶(norBC)和 N2O 還原酶(nosZ).nrfA 是DNRA 的分子標(biāo)志物[59],由圖8 可見,其在R2 系統(tǒng)中相對豐度較高,對高溫條件表現(xiàn)出明顯的偏好性,Lai 等[60]將溫度從10℃提升到40℃時,nrfA 基因豐度增加,DNRA 反應(yīng)過程增強(qiáng),說明DNRA 反應(yīng)與nrfA 基因豐度呈顯著正相關(guān).對于硝酸還原酶基因,相較于R1 系統(tǒng),R2 系統(tǒng)中的napAB轉(zhuǎn)錄明顯上調(diào),顯示了對DNRA 的主要貢獻(xiàn)(硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽),然而narGHI 的表達(dá)水平與R1系統(tǒng)幾乎一致,表明對部分DNRA 的貢獻(xiàn)較小.對于亞硝酸還原酶基因,nirSK 在R2 系統(tǒng)中的相對豐度低于R1 系統(tǒng),減弱了R2 系統(tǒng)對亞硝酸鹽還原能力進(jìn)而導(dǎo)致亞硝酸鹽積累,這主要?dú)w因于高溫會顯著降低nirK 基因的豐度[61].另外,在R2 系統(tǒng)中,NO 還原酶基因(norB)相對豐度更高,而N2O 還原酶基因(nosZ)相對豐度較低,說明高溫條件抑制了nosZ 酶的生成,進(jìn)而阻礙了N2O 被還原.hdh 和hzs 是參與Anammox 反應(yīng)的酶,其中hzs 在R2 中的相對豐度高于R1 系統(tǒng),且與nrfA 的變化呈正相關(guān)關(guān)系,表明DNRA 反應(yīng)產(chǎn)生的銨為Anammox 提供了底物,從而促進(jìn)Anammox 過程的發(fā)生.

圖8 不同溫度下氮代謝和碳代謝功能基因豐度Fig.8 Nitrogen and carbon metabolism functional gene abundance at different temperatures

在R2 系統(tǒng)中,Anammox 基因豐度高,但脫氮性能卻比R1 差.這種現(xiàn)象可以通過不利的溫度和FNA對轉(zhuǎn)錄、翻譯和酶活性的抑制來解釋[62].以亞硝酸鹽還原酶與N2O 還原酶的比值(Σnir/nos)作為N2O 產(chǎn)生潛力的指標(biāo),其中Σnir/nos是由nir基因(nirS+ nirK)之和除以nos 基因測定的[63].結(jié)果表明R2 系統(tǒng)中Σnir/nosZ(1.95)高于R1 系統(tǒng)(1.49),說明Anammox-DAMO 系統(tǒng)在高溫脅迫下更易積累N2O.

2.4 溫度影響下Anammox-DAMO 系統(tǒng)動力學(xué)機(jī)制及N2O 減排調(diào)控策略

2.4.1 溫度影響下Anammox-DAMO 系統(tǒng)動力學(xué)機(jī)制 如圖9 及表1、2、3 所示, NO3-、NH4+和N2O 酶動力學(xué)方程中Vmax均隨著溫度的升高先增大后減小,在35℃時最大,40℃時最小,意味著硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、N2O 還原酶均在 35℃時擁有最大比合成/活化速率,酶活性最強(qiáng).KI,R為對應(yīng)還原酶的抑制系數(shù),3 種酶動力學(xué)方程的 KI,R隨溫度的升高先降低后升高,同樣在35 ℃時最大, 40℃時最小,表明35℃的溫度條件對3 種酶的抑制作用最小. 3 種酶動力學(xué)方程的半飽和常數(shù)KE,i隨著溫度的升高先減少后增加,在35℃時最小, 40℃時最大.

表1 不同溫度下NO3-降解酶動力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of NO3- degrading enzymes at different temperatures

表2 不同溫度下NH4+降解酶動力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of NH4+ degrading enzymes at different temperatures

表3 不同溫度下N2O 消耗酶動力學(xué)參數(shù)Table 3 Kinetic parameters of N2O consuming enzymes at different temperatures

圖9 酶動力學(xué)擬合曲線Fig.9 Enzyme kinetics fitting curve

硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、N2O 還原酶的活性均隨著溫度的升高呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢,且在35℃時活性達(dá)到最大,意味著在此溫度下Anammox-DAMO 系統(tǒng)的脫氮性能最好,N2O 還原效果最好,能夠?qū)崿F(xiàn)最大程度減少N2O 排放量.低于或高于35℃的溫度條件都會對酶的活性產(chǎn)生不利影響,造成系統(tǒng)性能的惡化以及N2O 的積累,擬合結(jié)果印證了短期試驗結(jié)果.Hu 等[16]利用實驗室規(guī)模的缺氧/好氧間歇式反應(yīng)器探究了溫度對N2O 排放的影響,結(jié)果表明在10～35℃的溫度條件下,N2O 排放量隨溫度的升高而降低,該系統(tǒng)主要是通過溫度變化影響硝化和反硝化的總體過程速率來影響N2O 的排放,本研究在該溫度范圍的基礎(chǔ)上繼續(xù)擴(kuò)大溫度范圍,發(fā)現(xiàn)在20～40℃的范圍內(nèi),系統(tǒng)在35℃時出現(xiàn)N2O 排放低谷.此外,Qian 等[64]在TDD-Anammox 耦合工藝中發(fā)現(xiàn)35 ℃時系統(tǒng) N2O 排放量最少,這主要?dú)w因于Anammox 微生物(其特征是不產(chǎn)生N2O)在此溫度下發(fā)揮最大作用,而本研究酶動力學(xué)擬合結(jié)果證明了參與Anammox 過程的亞硝酸鹽還原酶在35℃下活性最大,與其實驗結(jié)果相符.

綜上所述,動力學(xué)模型可以很好地預(yù)測系統(tǒng)在不同溫度下N2O 排放情況,根據(jù)酶動力學(xué)擬合結(jié)果推測出N2O 排放量最少的溫度條件為35℃,在此溫度下該系統(tǒng)可以最大程度地實現(xiàn)N2O 減排.

2.4.2 Anammox-DAMO 系統(tǒng)代謝途徑及N2O 調(diào)控策略 根據(jù)檢測到的功能菌和基因,通過比對KEGG 數(shù)據(jù)庫的注釋對溫度影響下 Anammox-DAMO 系統(tǒng)特殊氮代謝途徑進(jìn)行分析(圖10).

圖10 Anammox-DAMO 系統(tǒng)特殊氮代謝途徑Fig.10 Special nitrogen metabolism pathways in the Anammox-DAMO system

在Anammox-DAMO 系統(tǒng)中,除已被證實的Anammox-DAMO 氮代謝基因,還檢測到了與DNRA 反應(yīng)相關(guān)的nrfA 基因,且在高溫脅迫下其豐度顯著增加.研究表明DAMO 古菌有編碼nrfA 的基因,因此具有發(fā)生DNRA 反應(yīng)的潛力.高溫抑制了Anammox-DAMO 系統(tǒng)中nir 酶的活性,造成亞硝酸鹽積累,基于nrfA 的解毒機(jī)制,此時nrfA 會將NO2-還原為NO,nrfA 與活性位點(diǎn)血紅素c 基團(tuán)A 結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)將NO 轉(zhuǎn)化為N2O[65].在本研究中還檢測到了與N2O 產(chǎn)消相關(guān)的norB、norC 和nosZ 基因.有研究表明,Anammox 細(xì)菌會生成中間產(chǎn)物NO,norB 和norC 基因可能會對外部亞硝化應(yīng)激做出快速反應(yīng),為了將NO 維持在毒性水平以下會把NO 轉(zhuǎn)化為N2O[39].高溫影響下,Anammox 細(xì)菌產(chǎn)生的NO 促進(jìn)了norBC 基因豐度增加,進(jìn)而將更多的NO 轉(zhuǎn)化為N2O.與此同時,Anammox-DAMO 系統(tǒng)中的nosZ 基因豐度降低,說明高溫抑制了N2O 還原酶的生成,導(dǎo)致無法及時將產(chǎn)生的N2O 還原,造成N2O 凈排放量升高.綜上所述,N2O 產(chǎn)生和消耗途徑可作如下解釋: Anammox-DAMO 系統(tǒng)中檢測到的N2O 由DNRA 反應(yīng)及Anammox 細(xì)菌對NO 解毒作用產(chǎn)生,而N2O 的消耗大部分由編碼nosZ 基因的微生物完成.

基于Anammox-DAMO 系統(tǒng)中N2O 特殊的產(chǎn)消代謝途徑,本研究發(fā)現(xiàn)高濃度亞硝酸鹽脅迫是導(dǎo)致Anammox-DAMO 系統(tǒng)N2O 積累的主要原因.高溫通過影響系統(tǒng)氮代謝過程中的關(guān)鍵功能基因酶的活性,導(dǎo)致亞硝酸鹽濃度升高,進(jìn)而觸發(fā)DNRA 反應(yīng)及Anammox 細(xì)菌的解毒作用.反硝化過程中4 個還原步驟之間的電子競爭以及不同還原酶的活性決定了N2O 的積累程度,本研究中,對系統(tǒng)性能不利的高溫條件會顯著降低N2O 還原酶的活性,導(dǎo)致N2O 的凈排放量升高.因此,盡可能控制系統(tǒng)在運(yùn)行過程中維持在中溫條件,豐富具有較強(qiáng)N2O 還原能力的微生物群,可以促進(jìn)N2O 的還原.在后續(xù)研究中,還需要優(yōu)化pH 值、C/N、DO、FNA 等其他操作條件,避免運(yùn)行過程中亞硝酸鹽的積累,并研究不同操作條件下N2O 還原酶的活性,以最大限度地減少廢水處理中N2O 的產(chǎn)生.

3 結(jié)論

3.1 高溫顯著降低了Anammox-DAMO 系統(tǒng)的脫氮性能,且在高溫脅迫下系統(tǒng)中亞硝酸鹽積累進(jìn)而導(dǎo)致N2O 的凈排放量升高,根據(jù)甲烷與硝酸鹽降解速率比值可知該系統(tǒng)在長期運(yùn)行過程中還存在DNRA 反應(yīng).

3.2 Anammox-DAMO 系統(tǒng)中微生物在高溫脅迫下產(chǎn)生更多的蛋白質(zhì)以緩解惡劣環(huán)境造成的損傷,三維熒光光譜結(jié)果顯示其主要為色氨酸類和酪氨酸類蛋白質(zhì)物質(zhì),該類物質(zhì)的分泌與N2O 的排放量呈顯著正相關(guān).

3.3 高通量測序結(jié)果表明,在高溫影響下系統(tǒng)中與N2O 還原相關(guān)的Acidovorax 和Thauera 屬豐度降低,而與N2O 產(chǎn)生相關(guān)的Bacillus 屬豐度則上升.宏基因測序結(jié)果表明高溫降低了nirSK 豐度,造成亞硝酸鹽積累,此外在高溫條件下norB 豐度增加而nosZ 豐度減少,加速了N2O 生成的同時抑制了其還原,導(dǎo)致N2O 積累.

3.4 在不同溫度下對Anammox-DAMO 系統(tǒng)進(jìn)行酶動力學(xué)擬合,發(fā)現(xiàn)低溫和高溫均會增加N2O 的凈排放量,而在35℃時可以最大程度地實現(xiàn)N2O 減排.