裙帶菜多糖羧甲基化修飾及降血糖活性

李燦，張慧慧，劉會平，張欣，馬笑笑，王兵，劉盈，張曉晶

（天津科技大學 食品科學與工程學院，天津 300457）

近年來，糖尿病的發(fā)病率急劇增加，其中約90%患者被診斷為Ⅱ型糖尿病，成為全球威脅人類健康的第三大常見疾病[1]。目前用于糖尿病治療的降糖藥物都有一些副作用，如引起心血管疾病、胃腸道問題等，可能會對身體產(chǎn)生嚴重影響[2-3]。海藻一直被認為是生物活性多糖的天然來源，具有降血糖、抗血栓、抗病毒、抗炎等作用，近幾年已逐漸成為研究熱點[4-5]。裙帶菜是一種生長在溫暖海灣中的可食用海藻，具有優(yōu)良的食用和藥用價值。裙帶菜以其優(yōu)越的營養(yǎng)價值和豐富的活性成分被廣泛熟知，褐藻糖膠是裙帶菜中重要的活性成分之一[6]。

通過化學改性開發(fā)新型多糖衍生物是一個研究熱點，如羧甲基化被認為是引入官能團和提高多糖生物活性的有效手段，該反應(yīng)的主要優(yōu)點是易于加工，化學試劑成本低，產(chǎn)物無毒[7]。劉貴珍等[8]對羅漢果多糖的羧甲基化修飾條件進行優(yōu)化并研究其體外降血糖能力，發(fā)現(xiàn)羧甲基化羅漢果多糖對α-淀粉酶的抑制作用有所增強。李雪暉等[9]對南瓜多糖的羧甲基化修飾條件進行優(yōu)化并研究其體外降血糖能力，發(fā)現(xiàn)羧甲基化南瓜多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用有所增強。目前，關(guān)于裙帶菜的羧甲基化修飾方面的研究鮮見報道。田數(shù)等[10]通過提取裙帶菜多糖并對其進行羧甲基化修飾和抗氧化活性研究，但并未對多糖的修飾工藝進行優(yōu)化。

為優(yōu)化裙帶菜多糖的羧甲基化修飾條件，本研究通過紅外光譜掃描、熱重分析、X-射線衍射試驗對兩種多糖進行初步結(jié)構(gòu)表征，并以兩種多糖對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用來評估裙帶菜多糖及羧甲基化產(chǎn)物的體外降血糖活性，以期為開發(fā)潛在的天然口服降糖劑或功能性食品提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

裙帶菜葉片：大連龍海勝水產(chǎn)有限公司。纖維素DE-52、Sephadex G-100：瑞達恒輝公司；500 Da 透析袋、葡萄糖標準品、牛血清白蛋白、二硝基水楊酸酯（dinitrosalycilate，DNS）、總酚檢測試劑盒、阿卡波糖、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）、α-淀粉酶（豬胰腺，5 U/mg）、α-葡萄糖苷酶（7.5 U/mg）：北京索萊寶科技有限公司；異丙醇、氯乙酸、冰醋酸、氫氧化鈉、乙醇酸、乙酸銨、變色酸：天津市江天化工技術(shù)股份有限公司；可溶性淀粉、4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl β-D-glucopyranoside，pNPG）：上海源葉生物科技有限公司；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光譜儀（UV-2550PC）：日本島津儀器有限公司；多功能酶標儀（Synergy HTX）：美國伯騰儀器有限公司；熱重分析儀（Q50）：美國TA 儀器（沃特世有限責任公司）；傅里葉紅外光譜儀（IS50）：美國尼高利儀器有限公司；X-射線衍射儀（日本Rigaku Ultima IV）：廣州智匯科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖純化

先前試驗通過CaCl2溶液提取裙帶菜褐藻糖膠后逐級沉淀得到4 組多糖樣品（UPP-45、UPP-55、UPP-65、UPP-75），其中UPP-65 組分降血糖效果較好[11]。采用DEAE-52 纖維素柱和Sephadex G-100 柱進一步純化UPP-65 組分。將UPP-65 溶液（10 mg/mL）上樣到DEAE-52 纖維素柱（1.6 cm×40 cm）上，并用超純水和系列濃度梯度的NaCl 溶液（0.1、0.3、0.5、0.7 mol/L）以1.6 mL/min 的流速逐步洗脫。采用苯酚-硫酸法檢測餾分中的多糖含量，由于超純水洗脫液中的總糖含量較高，因此對超純水洗脫液再進一步純化。將超純水洗脫液濃縮，然后冷凍干燥，以10 mg/mL 的濃度在Sephadex G-100 色譜柱上樣，洗脫液為超純水，條件為0.6 mL/min，4 mL/管，得到洗脫曲線，收集最高管獲得純化多糖并命名為UPP（Undariapinnatifidapolysaccharide）。

1.3.2 基本化學組成測定

以葡萄糖為標準品，采用苯酚-硫酸法測定UPP的總糖含量[12]。以半乳糖醛酸為標準品，采用間羥基聯(lián)苯法測定糖醛酸含量[13]。以牛血清白蛋白為標準品，采用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量[14]。以葡萄糖為標準品，采用3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖含量[15]。通過總酚檢測試劑盒測定總酚含量[16]。

1.3.3 紫外全波長掃描

將多糖樣品配制成1 mg/mL 的溶液，對照組為蒸餾水，在190～500 nm 范圍內(nèi)進行紫外光譜掃描。

1.3.4 羧甲基衍生物的制備

UPP 的羧甲基化基于Yu 等[17]的方法進行修改，將UPP（200 mg）與異丙醇（20 mL）混合攪拌30 min 后加入一定濃度的NaOH 溶液（10 mL），在室溫下攪拌1.5 h。然后加入一定量的異丙醇和氯乙酸溶液，在一定溫度下攪拌3 h。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH 值至中性，并在500 Da 透析袋中用蒸餾水透析72 h，旋蒸濃縮后冷凍干燥，得到CM-UPP。

1.3.5 羧甲基化取代度（degree of carboxymethylation substitution，DS）的測定

裙帶菜多糖的羧甲基化取代度測定基于Shi 等[18]的方法進行修改，吸取不同體積的乙醇酸對照品和CM-UPP（均為1 mg/mL）至具塞試管（25 mL）內(nèi)，加入NaOH 溶液（0.25 mol/L）補足至1 mL，然后各加入0.1% 變色酸溶液（5 mL）和濃硫酸（1 mL），水浴加熱0.5 h 后冷卻至室溫，滴加30%乙酸銨溶液，使各具塞試管內(nèi)溶液至刻度，在570 nm 處測定吸光度值。DS（Y）的計算公式如下。

式中：Y為羧甲基化修飾取代度；m為每克羧甲基糖樣品中相當于乙醇酸的量，g；162 為多糖的失水葡萄糖單元的摩爾質(zhì)量，g/mol；76 為乙醇酸摩爾質(zhì)量，g/mol；80 為CH2COONa 取代后每單位的凈增加量，g/mol。

1.3.6 單因素試驗

1.3.6.1 氯乙酸濃度對取代度的影響

稱取200 mg UPP 與20 mL 異丙醇混合攪拌30 min，加入10 mL 20%的NaOH 溶液在室溫下攪拌1.5 h。加入4 mL 異丙醇作為溶劑，然后再加入6 mL 氯乙酸溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mol/L），65 ℃攪拌3 h，得到羧甲基化多糖后測定取代度，確定最佳氯乙酸濃度。

1.3.6.2 反應(yīng)溫度對取代度的影響

稱取200 mg UPP 與20 mL 異丙醇混合攪拌30 min，加入10 mL 20% 的NaOH 溶液在室溫下攪拌1.5 h。加入4 mL 異丙醇作為溶劑，然后再加入6 mL 1.5 mol/L 氯乙酸溶液，在一定反應(yīng)溫度（45、55、65、75、85 ℃）下攪拌3 h，得到羧甲基化多糖后測定取代度，確定最佳反應(yīng)溫度。

1.3.6.3 NaOH 濃度對取代度的影響

稱取200 mg UPP 與20 mL 異丙醇混合攪拌30 min，加入10 mL 一定濃度（15%、20%、25%、30%、35%）的NaOH 溶液，在室溫下攪拌1.5 h。加入4 mL異丙醇作為溶劑，然后再加入6 mL 1.5 mol/L 氯乙酸溶液，65 ℃攪拌3 h，得到羧甲基化多糖后測定取代度，確定最佳NaOH 濃度。

1.3.7 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Box-Behnken 原理設(shè)計取代度優(yōu)化試驗，考察氯乙酸濃度、反應(yīng)溫度、NaOH濃度對羧甲基化取代度的影響，確定多糖的最佳提取條件。試驗因素和水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗各因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.3.8 傅里葉紅外光譜分析

稱取多糖樣品（1.0 mg）和干燥的KBr 粉末（150.0 mg），充分研磨、壓為薄片，置于傅里葉紅外光譜儀中，在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)掃描16 次，分辨率為4 cm-1[19]。

1.3.9 熱重分析

稱取5.0 mg 多糖粉末，將樣品置于熱重分析儀的氧化鋁坩堝中，以N2為載氣，流速為20 mL/min，設(shè)置初始溫度和結(jié)束溫度分別為25 ℃和600 ℃，以10 ℃/min的速度進行加熱測試。

1.3.10 X-射線衍射分析

分別取50 mg UPP 和CM-UPP 樣品，將表面壓平后置于X-射線衍射儀的檢測板上進行X 射線掃描，掃描條件：2θ，變化范圍5°～90°，速度2°/min。

1.3.11 體外降血糖活性試驗

1.3.11.1 α-淀粉酶的抑制活性測定

根據(jù)Xu 等[20]的方法測定UPP 和CM-UPP 對α-淀粉酶的抑制活性。以阿卡波糖為陽性對照，用25 μL不同濃度梯度的多糖溶液與α-淀粉酶溶液（25 μL，40 U/mL）混勻，37 ℃孵育10 min 后，加入1% 的可溶性淀粉溶液（25 μL，0.1 mol/L PBS 溶液配制），混勻置于99 ℃的水浴鍋，反應(yīng)15 min 后迅速冷卻至室溫，立即與50 μL DNS 溶液反應(yīng)，置于95 ℃的水浴鍋水浴5 min 顯色后，冰水浴迅速冷卻，加入750μL 蒸餾水，于540 nm 處測定吸光度。α-淀粉酶抑制率（Y1，%）計算公式如下。

式中：A1表示樣液反應(yīng)后吸光度；A2表示α-淀粉酶替換為PBS 溶液后重復實驗的吸光度；A0表示樣液替換為PBS 溶液后重復實驗的吸光度。

1.3.11.2 α-葡萄糖苷酶的抑制活性測定

根據(jù)Chen 等[21]的方法測定多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。以阿卡波糖為陽性對照，用150μL 不同濃度梯度的多糖溶液與α-葡萄糖苷酶溶液（50 μL，0.8 U/mL）混勻，37 ℃孵育10 min。加入pNPG 溶液（100 μL，0.9375 mmol/L），37 ℃反應(yīng)20 min 后加入Na2CO3溶液（500μL，1 mol/L）停止反應(yīng)，于405 nm 處測定吸光度。α-葡萄糖苷酶抑制率（Y2，%）計算公式如下。

式中：A1為反應(yīng)溶液的吸光度；A2表示α-葡萄糖苷酶替換為PBS 后重復試驗的吸光度；A0表示樣液替換為PBS 后重復實驗的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有測定指標均作3 次平行處理，利用SPSS16.0軟件對數(shù)據(jù)統(tǒng)計學進行處理，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示。使用Origin2018 和Graphpad Prism 8 對圖表制作與處理。

2 結(jié)果分析

2.1 多糖分離純化

UPP-65 的DEAE-52 纖維素柱和Sephadex G-100柱層析洗脫曲線如圖1 所示。

圖1 UPP-65 洗脫曲線圖Fig.1 Elution curve of UPP-65

由圖1 可知，主要得到1 個洗脫峰。收集、濃縮、凍干這一組分多糖，并通過Sephadex G-100 葡聚糖凝膠過濾柱進一步純化，收集最高管，凍干后得到純多糖（UPP）用于后續(xù)羧甲基化試驗。

2.2 基本組成成分分析

UPP 的基本組成成分結(jié)果如表2 所示。

表2 UPP 基本化學成分測定結(jié)果Table 2 Results ofbasic chemicalcomposition determination of UPP%

由表2 可知，純化后的多糖組分總糖含量較高且無還原糖存在，總糖含量為（93.94±0.47）%。蛋白質(zhì)含量和總酚含量均低，分別為（0.97±0.26）%和（0.03±0.01）%，表明多糖含雜質(zhì)較少。UPP 的糖醛酸含量較低，為（1.90±0.31）%，表明純化后的多糖為中性多糖。

2.3 紫外光譜分析

UPP 的紫外光譜掃描如圖2 所示。

圖2 UPP 的紫外光譜掃描Fig.2 Ultraviolet spectrum analysis of UPP

由圖2 可知，多糖溶液在260 nm 和280 nm 處均無明顯的吸收峰，表明UPP 不含或含有少量的核酸和蛋白質(zhì)，這一結(jié)果與UPP 化學成分測定的蛋白質(zhì)含量較少的結(jié)果相一致。

2.4 單因素試驗結(jié)果分析

2.4.1 氯乙酸濃度對羧甲基化取代度的影響

氯乙酸濃度對羧甲基化取代度的影響見圖3。

圖3 氯乙酸濃度對羧甲基化取代度的影響Fig.3 Effect of chloroacetic acid concentration on carboxymethylation substitution

由圖3 可知，當氯乙酸濃度小于1.5 mol/L 時，隨著氯乙酸濃度的增加，取代度逐漸增加，但濃度達到1.5 mol/L 后，取代度逐漸下降。在堿性的環(huán)境中，多糖的羥基會被去質(zhì)子化暴露出孤電子對，更容易與氯乙酸發(fā)生取代反應(yīng)，但過量的氯乙酸會直接破壞堿性環(huán)境，不利于取代反應(yīng)的進行，且過量的氯乙酸會與氫氧化鈉生成乙醇酸鈉導致取代度降低[22]。因此選擇氯乙酸濃度為1.5 mol/L 左右進行響應(yīng)面試驗設(shè)計。

2.4.2 反應(yīng)溫度對羧甲基化取代度的影響

反應(yīng)溫度對羧甲基化取代度的影響見圖4。

圖4 反應(yīng)溫度對羧甲基化取代度的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on carboxymethylation substitution

由圖4 可知，適當?shù)姆磻?yīng)溫度有利于提高CMUPP 的取代度，當反應(yīng)溫度低于65 ℃時，取代度隨反應(yīng)溫度升高而升高，在65 ℃時取代度最高，之后逐漸下降。這是因為低溫很難加速氯乙酸鈉與羥基的反應(yīng)，也很難加速羧甲基的形成[23]。但溫度過高，取代度反而會降低，其原因可能是反應(yīng)溫度升高會減小空間反應(yīng)，不利于醇氧化物的形成[24]。因此選擇反應(yīng)溫度為65 ℃左右進行響應(yīng)面試驗設(shè)計。

2.4.3 NaOH 濃度對羧甲基化取代度的影響

NaOH 濃度對羧甲基化取代度的影響見圖5。

圖5 NaOH 濃度對羧甲基化取代度的影響Fig.5 Effect of NaOH concentration on carboxymethylation substitution

由圖5 可知，NaOH 濃度為15%～35% 時，多糖的取代度先增大后減小，NaOH 濃度為20%時，取代度最大。這是因為羧甲基化反應(yīng)本質(zhì)為親核取代反應(yīng)，NaOH 濃度過低時，多糖羥基的去質(zhì)子化程度低，親核性較弱。氫氧化鈉濃度過高時，過量的氫氧化鈉與氯乙酸接觸的機會也增多，可能發(fā)生副反應(yīng)，不利于取代度反應(yīng)的進行[25]。因此選擇NaOH 濃度為20% 左右進行響應(yīng)面試驗設(shè)計。

2.5 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.5.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用Desin-Expert10.0 采用響應(yīng)面法進一步優(yōu)化UPP 羧甲基化的反應(yīng)條件。試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計Table 3 Design of response surface test

利用Design-Expert 10.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到二階多項式回歸方程為Y=0.89-0.020A+0.017B+8.25×10-3C-0.021AB-0.03AC+0.034BC-0.16A2-0.15B2-0.084C2。

2.5.2 方差分析和二次多項回歸方程擬合

對模型進行方差分析，結(jié)果見表4。

表4 方差分析Table 4 Variance analysis

由表4 可知，模型F值為912.89，P＜0.000 1，表明回歸模型極顯著且模型擬合度良好。相關(guān)系數(shù)R2和校正決定系數(shù)R2Adj分別為0.999 1 和0.998 1，表示此模型能較好預(yù)測羧甲基化取代度，試驗結(jié)果與分析結(jié)果差異較小，具有較高的可信度。由F值可知，3 個因素對羧甲基化取代度的影響程度為A＞B＞C，即氯乙酸濃度＞反應(yīng)溫度＞NaOH 濃度。

2.5.3 響應(yīng)面和等高線分析

各因素交互作用的響應(yīng)面如圖6 所示。

圖6 各因素交互作用對取代度影響的響應(yīng)面Fig.6 Response surface plots of effects of interaction among various factors on degree of substitution

由圖6 可知，響應(yīng)面的開口均向下，曲面呈中間凸四周凹的形狀，說明曲面有最高點，即存在最優(yōu)條件，這也表明3 個因素兩兩之間均有交互作用。響應(yīng)面圖可以直觀反映出各因素對羧甲基化取代度的影響，曲面越陡，影響越大。響應(yīng)面曲面在底部的投影圖中氯乙酸濃度與NaOH 濃度、NaOH 濃度與反應(yīng)溫度之間的二維等高線圖均為橢圓形，表明因素之間交互作用極顯著，而氯乙酸濃度與反應(yīng)溫度之間的二維等高線圖近似圓形，表明氯乙酸濃度與反應(yīng)溫度交互作用的顯著性低于另外兩組因素的交互作用，與表4 中的方差分析結(jié)果一致。

2.5.4 驗證試驗結(jié)果分析

根據(jù)響應(yīng)面試驗得出羧甲基化取代度最優(yōu)條件為氯乙酸濃度1.462 mol/L、反應(yīng)溫度65.682 ℃、NaOH 濃度20.383%，此時羧甲基化取代度為0.888。在實際試驗過程中將條件修正為氯乙酸濃度1.46 mol/L、反應(yīng)溫度65 ℃、NaOH 濃度20%，利用修正條件重復3 次對UPP 羧甲基化修飾，得到羧甲基化取代度為0.887。實際得率與預(yù)測得率相差較小，說明用此模型預(yù)測羧甲基化取代度可行。

2.6 紅外光譜掃描分析

UPP 和CM-UPP 的傅里葉紅外光譜分析見圖7。

圖7 UPP 和CM-UPP 的紅外光譜圖Fig.7 Infrared spectra of UPP and CM-UPP

由圖7 可知，UPP 中3 405.78 cm-1出現(xiàn)了O—H 伸縮振動；2 928.37、1 432.32 cm-1兩處分別出現(xiàn)了C—H伸縮振動和C—H 彎曲振動；1 640.55 cm-1出現(xiàn)了C O伸縮振動，以上為多糖的特征吸收峰[26]。1 200～1 000 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰由C—O—C 糖苷環(huán)的振動產(chǎn)生，表明UPP 中含有吡喃糖。

引入-CH2COOH 后，CM-UPP 中除含有以上多糖的基本特征峰外，在1 730.51 cm-1處增加了新的吸收峰，表明糖醛酸含量增加[16]。并且1 604.99 cm-1處的C O 伸縮振動以及1 419.98 cm-1處的C—H 彎曲振動幅度均有加強，表明UPP 羧甲基化成功[27]。

2.7 熱重分析（thermo-gravimetric analysis，TGA）

UPP 和CM-UPP 的TGA 曲線見圖8。

圖8 UPP 和CM-UPP 的TGA 曲線Fig.8 TGA curves of UPP and CM-UPP

由圖8 可知，UPP 和CM-UPP 均有3 個不同的失重階段。第一階段在100 ℃以下，可能由于多糖游離和結(jié)合水的蒸發(fā)，UPP 和CM-UPP 的初始質(zhì)量損失率分別為6.29% 和9.99%[28]。第二階段在200～400 ℃之間，出現(xiàn)了明顯的質(zhì)量損失，歸因于多糖的熱分解及生物聚合物結(jié)構(gòu)的分解，UPP 和CM-UPP 的失重率分別為59.26% 和56.83%[29]。第三階段在450～600 ℃之間，剩余多糖緩慢碳化，最終轉(zhuǎn)化為灰分和無機成分。與UPP 相比，CM-UPP 在第二階段損失質(zhì)量少，說明CM-UPP 具有更強的熱穩(wěn)定性，這一結(jié)果可能與CMUPP 比UPP 糖醛酸高有關(guān)[30]。

2.8 X-射線衍射（X-ray diffraction，XRD）試驗

X 射線衍射是研究多糖結(jié)構(gòu)的重要技術(shù)，可用于分析材料晶體結(jié)構(gòu)的一種方法[31]。XRD 中晶體結(jié)構(gòu)顯示為尖銳的窄衍射峰，而無定型結(jié)構(gòu)顯示為寬峰[16]。UPP 和CM-UPP 的XRD 結(jié)果見圖9。

圖9 UPP 和CM-UPP 的XRD 圖Fig.9 XRD diagram of UPP and CM-UPP

由圖9 可知，在5°～80°（2θ）范圍內(nèi)，UPP 和CMUPP 在21°左右均出現(xiàn)1 個衍射峰，這是主要的結(jié)晶反射區(qū)，譜圖中無尖峰出現(xiàn)，這表明兩種多糖無結(jié)晶現(xiàn)象，是一種無定型結(jié)構(gòu)。該結(jié)果與丁素蕓等[32]的研究結(jié)果相似。兩者衍射峰寬窄程度不同，CM-UPP 衍射峰的寬度和強度均高于UPP，表明羧甲基化修飾可能會破壞多糖內(nèi)部的晶體結(jié)構(gòu)[33]。

2.9 體外降血糖活性分析

2.9.1 UPP 和CM-UPP 對α-淀粉酶的抑制

以阿卡波糖為陽性對照，通過測定兩種多糖對α-淀粉酶活性的抑制作用來研究其體外降血糖作用。UPP 和CM-UPP 對α-淀粉酶的抑制作用見圖10。

圖10 UPP 和CM-UPP 對α-淀粉酶的抑制作用Fig.10 Inhibitory effect of UPP and CM-UPP on α-amylase

由圖10 可知，UPP、CM-UPP 均對α-淀粉酶有抑制作用，抑制程度都低于阿卡波糖。兩種多糖對α-淀粉酶的抑制無劑量依賴關(guān)系，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，此現(xiàn)象與陳舒桐等[34]研究結(jié)果相似。UPP 在0.25 mg/mL 時達到最高抑制率，抑制率為69.01%。CM-UPP 在0.125 mg/mL 時達到最高抑制率，抑制率為76.82%。CM-UPP 的抑制率較高表明羧甲基化修飾增強多糖的α-淀粉酶抑制能力。引入-CH2COOH 后，裙帶菜多糖的酸性糖增多，可能會增強羧甲基化裙帶菜多糖對α-淀粉酶的抑制作用，此現(xiàn)象與Chen 等[35]研究結(jié)果相似。

2.9.2 UPP 和CM-UPP 對α-葡萄糖苷酶的抑制

以阿卡波糖為陽性對照，通過測定兩種多糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用來研究其體外降血糖作用。UPP 和CM-UPP 對α-葡萄糖苷酶的抑制作用見圖11。

圖11 UPP 和CM-UPP 對α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.11 Inhibitory effect of UPP and CM-UPP on α-glucosidase

由圖11 可知，UPP、CM-UPP 均對α-葡萄糖苷酶有抑制作用，抑制程度均低于阿卡波糖。UPP 和CM-UPP 對α-葡萄糖苷酶的抑制呈濃度依賴關(guān)系，隨著多糖濃度的增加，兩種多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率逐漸升高。阿卡波糖、UPP、CM-UPP 的IC50值分別為0.002、3.467、0.503 mg/mL，CM-UPP 的IC50值低于UPP，可以看出羧甲基化修飾增強了多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，其原因可能是由于裙帶菜多糖中引入了-CH2COOH 后，其電負性和水溶性有所改變，所以增強了羧甲基化裙帶菜多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用[9]。

3 結(jié)論

通過DEAE-52 纖維素柱和Sephadex G-100 柱層析對分級醇沉組分UPP-65 進行純化，獲得中性多糖UPP。通過對UPP 的基本化學組成分析可知，UPP 不含有還原糖，其總糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)、總酚含量分別為（93.94±0.47）%、（1.90±0.31）%、（0.97±0.26）%、（0.03±0.01）%。利用響應(yīng)曲面法對UPP 的羧甲基化修飾進行最佳工藝優(yōu)化：氯乙酸濃度為1.46 mol/L、反應(yīng)溫度為65 ℃、NaOH 濃度20%，此時羧甲基化取代度為0.887。

采用紅外光譜掃描、熱重和X-射線衍射對兩種多糖進行初步結(jié)構(gòu)表征。由紅外光譜分析可知，UPP 和CM-UPP 都具有多糖的基本特征峰，并且UPP 羧甲基化修飾成功。由熱重分析結(jié)果可知，CM-UPP 比UPP具有更強的熱穩(wěn)定性。由X-射線衍射試驗可知，兩種多糖均無結(jié)晶現(xiàn)象，為無定型結(jié)構(gòu)。

體外降血糖試驗表明UPP 和CM-UPP 均對α-淀粉酶活性和α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，但都低于阿卡波糖的抑制作用。兩種多糖對α-淀粉酶的抑制呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，UPP 在0.25 mg/mL 時達到最高抑制率，抑制率為69.01%，CM-UPP 在0.125 mg/mL 時達到最高抑制率，抑制率為76.82%；兩種多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制均呈劑量依賴關(guān)系，UPP 和CM-UPP 的IC50值分別為3.467 mg/mL 和0.503 mg/mL。與UPP 相比，CM-UPP 抑制率更好，表明羧甲基化修飾能夠增強裙帶菜多糖的體外降血糖活性，為裙帶菜多糖的應(yīng)用研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。