PCR 系列技術在中藥種屬及品質鑒定中的應用

王 卿，周新宇

（江蘇省無錫市中醫(yī)醫(yī)院藥學部，江蘇 無錫 214000）

中藥是傳統(tǒng)醫(yī)學的重要組成部分，它們通常由復雜的天然植物和動物組成，具有多樣的化學成分。傳統(tǒng)的中藥鑒定方法主要基于形態(tài)學﹑化學成分分析和藥效評估等傳統(tǒng)方法，但這些方法存在著一定的局限性。近年來，PCR 技術的廣泛應用為中藥鑒定提供了新的機會。PCR技術可以通過放大目標DNA 序列來檢測中藥樣品，并且具有高靈敏度﹑高特異性和高重復性等優(yōu)點。

1 PCR 技術原理

PCR 技術是一種體外DNA 擴增技術，它包括三個關鍵步驟：變性﹑引物結合和延伸。PCR 技術利用DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性，反復進行高溫變性﹑引物退火和延伸反應，從而在無須細胞和基因庫的條件下，快速產生大量目標DNA 序列[1]。

1.1 PCR-RFLP 技術

PCR-RFLP（聚合酶鏈式反應-限制性內切酶長度多態(tài)性）技術是一種用于分子鑒定和檢測樣品中摻雜成分的方法，它結合了PCR 技術和限制性內切酶酶切分析，可以實現(xiàn)對樣品的半定量檢測。

有研究指出[2]，在PCR 反應中使用這些DNA 模板進行擴增，并選擇適當?shù)南拗菩詢惹忻高M行酶切，由于川貝母和偽品具有不同的DNA 序列，限制性內切酶在兩者中會產生不同長度的DNA 片段。這些片段通過凝膠電泳進行分離和可視化。最后，研究人員使用專業(yè)的軟件來分析凝膠電泳圖像上的條帶強度，通過比較川貝母樣品與不同摻偽比例樣品的條帶強度，來計算摻偽量的大致比例。這種方法直觀地提供了摻假﹑摻偽樣品的半定量結果[3]。

1.2 PCR 常常結合其他技術

有研究指出[4]，在實際應用中，PCR 常常結合其他技術進行綜合分析，以提高鑒定的準確性和可靠性。除了基本的PCR 技術，還有一些快速﹑小樣本﹑高通量的技術在中藥種屬及品質鑒定中得到廣泛發(fā)展和應用，包括基因芯片﹑一代測序（結合有中藥指紋技術）和新一代測序（NGS）技術。

還有研究指出[5]，基因芯片技術是一種高通量的DNA 分析方法，可以同時對上千個DNA 序列進行擴增和檢測。通過使用特定的DNA 探針，基因芯片可以檢測中藥材中大量的基因信息，從而實現(xiàn)種屬的鑒定和品質分析。

一代測序技術結合了中藥指紋技術，可以對中藥材中的多個成分進行快速﹑高效的檢測。與傳統(tǒng)的色譜分析相比，一代測序技術具有更高的靈敏度和分辨率，能夠更全面地評估中藥材的品質[6]。

NGS 技術是一種高通量測序技術，可以同時對大量的DNA 序列進行測序。在中藥種屬及品質鑒定中，NGS 技術可以通過擴增和測序中藥材中的DNA 條形碼或指紋圖譜，從而實現(xiàn)對中藥材種屬的準確定量分析[7]。

綜上所述，除了基本的PCR 技術之外，結合基因芯片﹑一代測序和NGS 等高通量技術，可以更全面﹑快速地進行中藥種屬及品質鑒定。這些技術的發(fā)展和應用將有助于提高中藥材的品質控制和質量評估。

2 PCR 技術在中藥鑒定中的應用案例

2.1 DNA 條形碼技術

DNA 條形碼技術是一種基于PCR 技術的分子鑒定方法，通過特定引物擴增中藥材DNA，并對擴增產物進行測序和比對，以識別中藥材的物種來源。

研究顯示[8]，對于常用的中藥材川芎，由于其形態(tài)特征與其他相似植物相近，傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定方法存在一定的局限性。因此，研究者利用DNA 條形碼技術來準確鑒定川芎。選擇合適的DNA 條形碼區(qū)域作為PCR引物，這通常是一段高度保守的DNA 片段。然后，從川芎樣品中提取總DNA，利用PCR 技術將目標區(qū)域擴增出來。擴增產物經純化后進行測序，得到DNA 序列。將得到的DNA 序列與已知物種的DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫進行比對，通過比對結果可以確定川芎的物種來源。如果比對結果與某一物種完全匹配，即可確認川芎為該物種。

因此，通過DNA 條形碼技術，可以在分子水平上對中藥材進行準確的鑒定，避免了傳統(tǒng)鑒定方法的主觀性和不確定性。此外，DNA 條形碼技術還可以應用于中藥材的質量控制﹑真?zhèn)舞b別以及市場監(jiān)管等方面。

2.2 種質資源保護

種質資源保護是一種重要的措施，旨在保護和維持中藥材的遺傳多樣性，以確保其可持續(xù)利用。PCR 技術在中藥鑒定中的應用案例之一就是通過對中藥材的遺傳多樣性進行PCR 分析，評估并保護中藥材的種質資源，并為中藥的合理開發(fā)和利用提供科學依據(jù)。

研究指出[9]，通過PCR 技術，可以利用特定的引物擴增中藥材的DNA 樣品，并通過分析擴增產物的多態(tài)性來評估中藥材的遺傳多樣性。例如，研究者可以選擇適當?shù)奈⑿l(wèi)星標記或SNP 標記作為PCR 引物，對中藥材不同個體或不同地理種群的DNA 進行擴增。

相關研究表明[10]，PCR 可以通過特異性引物擴增中藥材基因組中與種屬相關的DNA 區(qū)域，從而確定中藥材的種屬。例如，在種植中藥材中，可以使用基于PCR的DNA 條形碼技術，如ITS（Internal Transcribed Spacer）序列和rbcL（Rubisco Large Subunit）等，進行種屬鑒定。

PCR 可以用于檢測中藥材遺傳變異，評估中藥材的遺傳多樣性和品質穩(wěn)定性。通過比較不同采集地﹑不同品種或不同批次的遺傳差異，可以對中藥材質量進行評估。

PCR 可以用于鑒定中藥材的真實性和純度。通過檢測特定基因或DNA 區(qū)域，可以判斷中藥材是否含有其他植物成分或摻雜物，從而確保中藥材的質量和安全性。

PCR 可以結合其他分析方法，如定量PCR﹑實時熒光PCR 和基因表達分析等，用于評估中藥材中活性成分的含量和表達水平。這有助于控制中藥材的品質，并為臨床應用提供科學依據(jù)。

綜上所述，PCR 技術在中藥鑒定中的應用之一是通過對中藥材的遺傳多樣性進行PCR 分析，評估并保護中藥材種質資源，為中藥的合理開發(fā)和利用提供科學依據(jù)。

2.3 中藥真?zhèn)舞b定

中藥真?zhèn)舞b定是保證中藥材質量和安全的重要環(huán)節(jié)。PCR 技術在其中也扮演著關鍵的角色，通過擴增和分析目標基因，可以準確地鑒定中藥材真?zhèn)危⒆R別摻假品種。

一些研究指出[11-12]，中藥真?zhèn)舞b定利用PCR 技術對中藥材中的特定基因進行擴增和分析。這些基因通常與中藥材的特征性成分﹑藥效或生物學特性相關。確定用于真?zhèn)舞b定的目標基因，該基因應具有以下特點：與中藥材的真實性密切相關﹑在核酸水平上穩(wěn)定存在﹑易于擴增和分析等。從待鑒定的中藥材樣品中提取總DNA，并使用PCR 技術擴增目標基因。PCR 擴增引物的設計至關重要，需要確保引物的特異性和擴增效率。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他相關技術，對PCR 擴增產物進行分離和檢測。通過比對待鑒定樣品的PCR 產物與已知真品和假品的PCR 產物，可以確定中藥材的真實性。還可以采用其他分析方法，如DNA 測序﹑限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析﹑單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析等來進一步確認中藥材的真?zhèn)巍Ｍㄟ^PCR 技術進行中藥真?zhèn)舞b定具有高度的準確性和靈敏性。它可以有效地檢測摻假品種，避免因摻雜其他植物材料或低質量替代品而導致中藥材的質量下降或藥效減弱。通過PCR 技術對目標基因進行擴增和分析，可以準確地鑒定中藥材的真?zhèn)?，并識別摻假品種，從而保障中藥材的質量和安全。

3 PCR 技術在中藥鑒定中應用的挑戰(zhàn)和未來發(fā)展方向

在中藥鑒定中，PCR 技術雖然具有許多優(yōu)勢，但也面臨一些挑戰(zhàn)。其中一個重要的挑戰(zhàn)是制定和建立統(tǒng)一的檢測方法和標準，以確保PCR 技術在中藥鑒定中的可靠性和準確性。

制定和建立統(tǒng)一的PCR 檢測方法和標準是關鍵。這包括選擇適當?shù)囊锖吞结槪_定合適的PCR 條件和參數(shù)，標準化擴增產物的分離和檢測方法等。通過建立統(tǒng)一的標準化流程，可以提高PCR 結果的可重復性和可比性。選擇合適的引物和探針對于PCR 的成功至關重要。針對中藥材的鑒定，需要設計特異性高﹑能夠擴增目標基因的引物和探針。此外，還可以利用基因組學數(shù)據(jù)和生物信息學工具來輔助引物和探針的設計，提高其特異性和靈敏度。

中藥材樣品通常經過炮制﹑干燥等處理，其中可能存在DNA 的降解或污染。因此，有效的樣品預處理方法對于PCR 鑒定的準確性至關重要。開發(fā)適合中藥材樣品的DNA 提取和純化方法，可以最大限度地提高PCR 結果的準確性。建立中藥材的DNA 序列數(shù)據(jù)庫和參考標本庫可以為PCR 鑒定提供參考。這些數(shù)據(jù)庫可以包含已知的中藥材的DNA 序列信息，以及其他相關信息，如產地﹑鑒定方法等。通過與這些數(shù)據(jù)庫比對，可以更準確地確定待鑒定樣品的真實性。除了傳統(tǒng)的PCR 技術外，還可以結合其他分子生物學技術和高通量測序技術，進行更全面和深入的中藥鑒定。例如，利用單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析﹑基因組學﹑轉錄組學等技術，可以進行中藥材遺傳多樣性分析，從而更準確地識別和鑒定中藥材的真?zhèn)巍?/p>

綜上所述，應對PCR 技術在中藥鑒定中應用的挑戰(zhàn)需要制定和建立統(tǒng)一的檢測方法和標準，進一步改進引物和探針設計，優(yōu)化樣品預處理方法，建立數(shù)據(jù)庫和參考標本庫，以及結合其他新技術的應用。PCR 及其相關技術在中藥種屬鑒定方面具有很高的特異性和準確性，可以快速且可靠地確定藥材的種屬。然而，在藥效鑒定以及原產地鑒定方面，PCR 技術的應用確實存在一些限制。藥效鑒定是評估中藥材藥理作用和療效的一個重要方面。傳統(tǒng)的藥效鑒定往往需要綜合考慮多個因素，如中藥材中的多個活性成分的含量﹑它們之間的相互作用等。雖然PCR 技術可以用于對中藥活性成分相關基因的檢測和表達研究，但藥效鑒定通常需要更加復雜的實驗方法和數(shù)據(jù)分析手段來進行準確評估。至于原產地鑒定，目前的技術并不能完全滿足要求。雖然PCR 技術可以在一定程度上幫助確定中藥材的種屬，但對于精確的原產地鑒定來說，還需要結合其他輔助手段，如同位素分析﹑化學成分分析等。這些方法可以從不同的角度揭示中藥材的產地信息，提供更全面準確的鑒定結果。

盡管PCR 及其相關技術在中藥種屬鑒定方面具有優(yōu)勢，但在藥效鑒定和原產地鑒定方面仍存在一定的局限性。為了得到更全面﹑準確的結果，需要結合其他技術手段進行綜合分析，并不斷推進相關研究和方法的發(fā)展。

4 結論

PCR 技術在中藥鑒定中具有廣闊的應用前景。通過使用PCR 技術，可以快速﹑準確地鑒定中藥樣品，并保護中藥的品質和安全性。然而，PCR 技術在中藥鑒定中應用仍面臨一些挑戰(zhàn)和限制，需要繼續(xù)改進和發(fā)展。未來的研究方向包括標準化PCR 檢測方法﹑結合新興基因組學技術的應用以及建立大規(guī)模中藥數(shù)據(jù)庫等。這些努力將有助于推動中藥鑒定領域的發(fā)展，并為中藥的研究和開發(fā)提供更多的支持。