磁共振動態(tài)增強結合血循環(huán)腫瘤細胞、循環(huán)游離DNA對乳腺癌的臨床診斷研究

張倩，俱京濤，張雅瓊，張春謙

作者單位：1滄州市人民醫(yī)院核磁共振室，河北 滄州061000；2北京中醫(yī)藥大學房山醫(yī)院，北京 102400；3石家莊市第三醫(yī)院放射科，河北 石家莊050000；4滄州市中心醫(yī)院CT室，河北 滄州061000

乳腺癌是臨床常見惡性腫瘤類型之一，具有高發(fā)病率、病死率等特征［1］。目前有關乳腺癌發(fā)病機制尚未十分明確，且早期多無特異性臨床表現(xiàn)，故常需與乳腺囊腫、炎癥等良性疾病鑒別診斷。血循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）主要來源于轉移或原發(fā)腫瘤，能有效反映腫瘤侵襲與轉移［2］。循環(huán)游離DNA（cfDNA）是循環(huán)血中游離在細胞外的高度片段化DNA，在肺癌、食管癌等多種疾病診斷中的價值現(xiàn)已被證實［3］。目前乳腺癌影像學研究逐漸深入到分子生物學層面，采用影像學聯(lián)合細胞因子進行診斷已成為可能。磁共振動態(tài)增強（DCE-MRI）是MRI掃描序列之一，可觀察病變血流動力學特征，同時其定量參數(shù)能反映造影劑在腫瘤內的動態(tài)分布情況，對提高疾病診斷準確性意義重大［4］。但目前有關DCE-MRI結合CTCs、cfDNA診斷乳腺癌的報道少見。鑒于此，本研究就DCE-MRI結合CTCs、cfDNA對乳腺癌的診斷價值進行了探討，以期為臨床治療該病提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集滄州市人民醫(yī)院2020年6月至2021年11月收治的乳腺癌病人的臨床資料。納入標準：（1）均經(jīng)術后穿刺病理活檢確診為腫塊型乳腺癌；（2）無MRI檢查禁忌證；（3）影像學圖像清晰，不影響診斷；（4）實驗室、影像學及病理等資料完整。排除標準：（1）存在自身免疫疾病或全身感染性疾病；（2）孕婦、交流障礙、意識障礙等特殊人群；（3）進行化療、放療等治療者；（4）循環(huán)功能嚴重障礙、肝腎功能嚴重損傷者；（5）非腫塊型或直徑較小無法進行病灶常規(guī)測量者。根據(jù)公式：N=Z2×σ2/d2，置信區(qū)間95%，抽樣誤差10%，標準差取值0.5，得到預計樣本量96例，根據(jù)納入及排除標準，最終82例乳腺癌病人納入本次研究。將82例乳腺癌病人納入乳腺癌組，病人均為女性，病人年齡范圍為26～67歲，年齡（44.42±6.17）歲。臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期28例，Ⅲ～Ⅳ期54例，58例伴淋巴結轉移。

另選取同期符合納入、排除標準的乳腺良性病變病人65例作為良性組。良性組納入標準：（1）影像學圖像資料完整；（2）未合并其他疾??；（3）經(jīng)過病理學活檢證實；排除標準：（1）未進行CTCs、cfDNA檢測者；（2）既往行乳腺手術史者；（3）非妊娠期、哺乳期女性。乳腺良性病變病人作為良性組，病人年齡范圍26～68歲，年齡（45.18±7.05）歲。兩組資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 方法

1.2.1 MRI檢查 MRI平掃：3.0 T飛利浦磁共振掃描儀，乳腺聯(lián)合線圈，行軸位快速自旋回波T1WI、T2WI及冠狀自旋回波脂肪飽和T2WI序列掃描。②DWI掃描參數(shù)：重復時間（TR）9 145 ms，回波時間（TE）79 ms，層厚、間距分別為3.5 mm、0 mm。b值=0、800 s/mm2。③增強掃描：對比劑為Gd-DTPA 0.2 mmol/kg，注射速率2 mL/s，隨后快速推注20 mL 0.9%氯化鈉溶液，隨后行動態(tài)增強掃描，注入對比劑同時立即開始eTHRIVE掃描，參數(shù)：TR 4.3 ms，TE 2.1 ms，層厚1.5 mm，矩陣280×339，F(xiàn)OV 280 mm×340 mm。共9期，每期74 s。掃描結束后利用相應MRI工作站進行圖像處理，并選擇病變最佳層面，將興趣區(qū)（ROI）置于病變實質區(qū)域（ROI面積根據(jù)病變實質區(qū)域面積而定），避開鈣化、血管、壞死組織，每例至少重復測量3次，取平均值，由同一技師進行上述操作。定量參數(shù)包括速度常數(shù)（Ktrans）值、速率常數(shù)（Kep）值及血管外細胞外容積分數(shù)（Ve）。

1.2.2 CTCs、cfDNA檢測 空腹抽取兩組病人晨起靜脈血5 mL，離心（3 500 r/min，離心半徑15 cm，5 min），分離上層血漿，低溫保存用于cfDNA提取檢測。采用qPCR檢測外周血cfDNA，提取血漿中DNA，基于實驗室前期建立的Alu序列RTFQ PCR檢測cfDNA的方法進行檢測：針對Alu115、247序列的引物：（5'-3'）Alu115正向CCTGAGGTCAGGAGTT CGAG，反向CCCGAGTAGCTGGGATTACA；Alu 247正向GTGGCTCACGCCTGTAATC，反向CAGGCTGGAGTGCAGTGG。按說明書進行配置成10 μmol/mL溶液，置于低溫保存。PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 S，60 ℃ 60 s，共35個循環(huán)。完成擴增后，對數(shù)據(jù)進行分析，并取3次結果均值作為1次檢測結果。以長、短片段（115 bp、247 bp）擴增產(chǎn)物比值作為cfDNA完整性指標。

CTCs采用Cell Search系統(tǒng)檢測，取7.5 mL血漿樣本與6.5 mL緩沖液置于Autoprep錐形管中，離心10 min后，取上清液，置入Autoprep系統(tǒng)中檢測。將每7.5毫升外周血中檢出至少1個CTCs定義為CTCs表達陽性。

1.3 觀察指標 比較兩組DCE-MRI定量參數(shù)、CTCs、cfDNA水平，并對比MRI一般特征，包括邊緣情況、形態(tài)、強化、TIC分型及早期增強率。分析上述因子與乳腺癌臨床特征的關系及DCE-MRI結合CTCs、cfDNA診斷價值。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件分析本組數(shù)據(jù)，各組DCE-MRI定量參數(shù)、CTCs、cfDNA水平均以描述，行t檢驗；計數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗；診斷價值采用ROC曲線分析，ACU值顯著性檢驗采用Z檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組DCE-MRI定量參數(shù)及CTCs、cfDNA比較 乳腺癌組DCE-MRI定量參數(shù)Ktrans、Kep及Alu247/115水平明顯高于良性組，CTCs計數(shù)多于良性組（P＜0.05）。見表1。

表1 乳腺癌82例及乳腺良性病變65例磁共振動態(tài)增強（DCE-MRI）定量參數(shù)及CTCs、cfDNA比較/

表1 乳腺癌82例及乳腺良性病變65例磁共振動態(tài)增強（DCE-MRI）定量參數(shù)及CTCs、cfDNA比較/

注：cfDNA為循環(huán)游離DNA，CTCs為血循環(huán)腫瘤細胞，Ktrans為速度常數(shù)，Kep為速率常數(shù)，Ve為血管外細胞外容積分數(shù)。

組別良性組乳腺癌組t值P值Alu247/115 0.55±0.12 0.97±0.32 10.30＜0.001例數(shù)65 82 Ktrans/min 0.05±0.01 0.18±0.04 25.56＜0.001 Kep/min 0.51±0.11 1.32±0.27 22.73＜0.001 Ve 0.13±0.03 0.14±0.04 1.68 0.096 CTCs計數(shù)/（個/毫升）10.15±1.45 12.97±2.14 9.09＜0.001

2.2 兩組MRI一般特征比較 良性組邊緣多光滑，形狀規(guī)則，內部強化以均勻為主，TIC分型Ⅰ型多見，早期增強率＜60%，乳腺癌組邊緣毛刺征、形狀不規(guī)則，內部不均勻強化為主，以TIC分型Ⅲ型多見，早期增強率＜60%占比高。見表2。

表2 乳腺癌82例及乳腺良性病變65例MRI一般特征比較/例（%）

2.3 CTCs、cfDNA與乳腺癌臨床特征間的關系 淋巴結轉移、Ⅲ～Ⅳ期者CTCs數(shù)量、Alu247/115水平明顯高于無淋巴結轉移、Ⅰ～Ⅱ期者（P＜0.05），見表3。

表3 乳腺癌82例血循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）、循環(huán)游離DNA（cfDNA）與乳腺癌臨床特征間的關系/

表3 乳腺癌82例血循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）、循環(huán)游離DNA（cfDNA）與乳腺癌臨床特征間的關系/

特征CTCs計數(shù)/（個/毫升）Alu247/115年齡＜45歲≥45歲腫瘤長徑＜5 cm≥5 cm病理類型浸潤性導管癌導管原位癌浸潤性小葉癌臨床分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期淋巴結轉移是否例數(shù)4 2 t，P值1.56，0.124 t，P值0.67，0.503 40 12.61±1.87 13.34±2.36 0.95±0.21 0.99±0.32 1.16，0.251 1.18，0.242 69 13 12.85±2.06 13.61±2.74 0.98±0.19 0.91±0.23 2.26，0.111 0.01，0.998 54 21 7 12.63±1.85 13.74±2.36 13.21±2.59 0.97±0.33 0.96±0.31 0.98±0.36 7.11，＜0.001 5.31，＜0.001 28 54 9.76±1.03 14.63±3.54 0.68±0.17 1.12±0.42 17.79，＜0.001 9.33，＜0.001 58 24 15.56±3.57 6.71±0.63 1.17±0.52 0.48±0.12

2.4 DCE-MRI結合CTCs、cfDNA對乳腺癌診斷價值分析 三者聯(lián)合（DCE-MRI+CTCs+cfDNA）診斷效果優(yōu)于單一檢測CTCs、cfDNA檢測（P＜0.05），見表4。

表4 DCE-MRI結合CTCs、cfDNA對乳腺癌診斷價值分析

2.5 病例分析 女，45歲，乳腺癌（圖1），MRI掃描示雙側乳腺對稱，腺體呈散在纖維腺體型，背景實質強化輕微，右側乳腺外上象限約10點方向可見一不規(guī)則結節(jié)狀長T1稍長T2信號灶（圖1A），DWI呈高信號（圖1B）。MRI增強掃描可見病灶呈明顯不均質強化（圖1C～1E）。大小約為16 mm（上下徑）×13 mm（前后徑）×12 mm（左右徑），邊緣欠清晰，可見淺分葉，鄰近皮膚未見明顯增厚，右側乳頭未見凹陷。病理診斷為乳腺浸潤性導管癌（圖1F）。

圖1 女，45歲，乳腺浸潤性導管癌，乳房MRI掃描圖像及病理圖片：A為乳房T1WI圖；B為乳房T2WI圖；C為乳房增強1期圖；D為乳房增強2期圖；E為乳房增強3期圖，F(xiàn)為乳腺切除標本病理學圖（HE染色×10）

3 討論

隨著疾病的進展，原發(fā)性乳腺癌易發(fā)生淋巴結轉移和血行轉移。早期診斷和治療是改善病人預后的關鍵［5］。病理活檢仍是乳腺癌臨床診斷的金標準，但屬于有創(chuàng)檢查，在早期篩查中存在一定局限性［6］。目前，臨床早期篩查主要依靠影像學檢查和血清腫瘤標志物。影像學檢查中，MRI檢查具有多角度成像、分辨率高等優(yōu)勢，有助于發(fā)現(xiàn)細小病灶或多發(fā)病灶，近年來檢查適應證范圍逐漸擴大［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，良性組、乳腺癌組邊緣、形狀、內部強化、TIC分型及早期強化率等MRI一般特征均具有差異，與既往報道結果相似，病灶邊緣出現(xiàn)毛刺，提示腫塊浸潤性生長、容易浸潤周圍血管、淋巴管，淋巴結更易發(fā)生轉移。由此可見，多數(shù)乳腺病灶的常規(guī)MRI形態(tài)學有一定特征可循，通過分析MRI影像學表現(xiàn)能對病灶行初步定性評估。值得注意的是，部分極低度惡性或體積較小的病變處，影像學征象存在一定重疊，常規(guī)MRI檢查在該類病灶的定性評估效果欠佳［8］。

DCE-MRI屬于一種功能性MRI成像方法，可通過繪制TIC來評估腫瘤動態(tài)強化特征，既往研究指出，血管生長在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，而DCE-MRI可觀察血流動力學情況，通過收集定量參數(shù)用于評估腫瘤血管生成狀態(tài)［9］。在DCE-MRI定量參數(shù)中，Ktrans是指對比劑由血漿向血管外細胞外間隙（extracellular space，EES）轉移的速率，與滲透性存在一定關系，可反映對比劑經(jīng)血管腔內擴散至腔外的血流信息，實際上，Ktrans并非反映對比劑血管分布的理想?yún)?shù)，任何影響血流灌注的因素，譬如高血壓、心輸出量等均引起Ktrans值發(fā)生波動；Kep反應了對比劑由EES重新回流至血漿的速率，可提供血管外細胞間隙回流至腔內的相關信息，凸顯腫瘤血管的生成特征；Ve則是指對比劑漏出的間隙或分布間隙［10］。

Bertani等［11］發(fā)現(xiàn)，乳腺良、惡性疾病DCE-MRI定量參數(shù)Ve比較差異無統(tǒng)計學意義，Ktrans、Kep比較差異有統(tǒng)計學意義。本研究結果與上述報道相符。究其原因可能是：乳腺癌病人腫瘤組織血管密度較高，血管外腫瘤細胞間隙增寬，微循環(huán)血容量大、流速快；而良性病灶相較乳腺癌組織，微血管較少，血管壁結構完整，血流灌注低，強化程度輕。本研究進一步通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)DCE-MRI定量參數(shù)用于鑒別診斷乳腺良惡性疾病的AUC值達0.80，與王睿等［12］研究結果相似，證實DCE-MRI定量參數(shù)在良惡性乳腺疾病鑒別診斷中具有重要價值。值得注意的是良性組與乳腺癌組的DCE-MRI定量參數(shù)Ve比較無差異，推測其原因可能是Ve值在病變過程中變化較小，良、惡性腫瘤的Ve水平差異無統(tǒng)計學意義，因此引起良惡性腫塊Ve值的變化范圍產(chǎn)生重疊區(qū)域，進行統(tǒng)計學處理后未見兩者間存在明顯差異。另一方面亦可能與惡性變四周組織的水腫程度或動脈有關，實際上部分學者認為，可以通過延長獲取圖像的時間，解決上述技術問題，提高Ve值變化度，進而獲取更高的診斷效果，但有關這一項解決方案目前尚存在爭議，同時本研究中結果發(fā)現(xiàn)三者聯(lián)合診斷效果與DCE-MRI相當，雖與以往文獻資料顯示聯(lián)合效能優(yōu)于單一影像學診斷的結果存在一定差異，引起這一差異的原因有待后續(xù)進一步深入探討，但DCE-MRI暫時獲得的診斷效果值得肯定。

近年來研究顯示，腫瘤細胞生物學行為和其組織病理學改變與分子生物學之間存在某種關系［13-14］。CTCs屬于異質腫瘤細胞，是原發(fā)、復發(fā)或轉移病灶脫落后，從脈管系統(tǒng)浸潤外周血循環(huán)的腫瘤細胞總稱，通過檢測血液中CTCs數(shù)量可獲取腫瘤實時信息［15］。cfDNA可來源于壞死、凋亡的腫瘤細胞或由腫瘤細胞自身分泌［16-17］。已有研究證實，cfDNA完整性在腫瘤診斷、評估分期等具有重要作用［18］。本研究中，乳腺癌組CTCs數(shù)量、基于Alu序列的cfDNA247/115比值均高于良性組；且隨分期增高、淋巴結轉移，CTCs數(shù)量、Alu247/115水平亦更高，表明CTCs、cfDNA完整性可能成為早期診斷乳腺癌、評估其病情的可靠指標。通過ROC曲線分析乳腺癌CTCs、cfDNA完整性水平單項檢測時，發(fā)現(xiàn)二者單獨檢測靈敏度、特異度較低，但聯(lián)合DCE-MRI檢查時靈敏度、特異度分別達0.93、0.84，可見DCE-MRI結合CTCs、cfDNA能幫助臨床獲取更高的診斷效果，推測其原因可能是聯(lián)合檢查可為臨床提供影像學、分子生物學方面的雙重信息，使診斷依據(jù)更加充分，從而提高診斷價值［19-20］。

綜上所述，乳腺癌病人CTCs、cfDNA存在異常表達，可能與病人臨床分期、淋巴結轉移有關，相對單一實驗室檢測，DCE-MRI結合CTCs、cfDNA檢測能獲取更多可靠信息。本研究的不足之處在于屬于回顧性研究，樣本量偏低可能對統(tǒng)計學結果產(chǎn)生一定偏倚，后續(xù)仍需擴大樣本量，進一步行多中心前瞻性研究證實結論。