老年慢性心力衰竭病人血清微RNA-21、白細(xì)胞介素-6、腦利鈉肽水平與預(yù)后的關(guān)系研究

侯杰，王麗芳，李園春，劉勇，姚海濤

作者單位：1唐山中心醫(yī)院急診科，河北 唐山063008；2唐山市豐南區(qū)醫(yī)院內(nèi)科，河北 唐山063300；3鹽山縣人民醫(yī)院內(nèi)三科，河北 滄州061300

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是指病人由于心肌梗死、炎癥或血流動(dòng)力學(xué)負(fù)荷過(guò)重等各種原因?qū)е滦募〖?xì)胞損傷，功能喪失，心肌收縮/舒張力減弱，心臟的搏出量不能滿(mǎn)足機(jī)體代謝需要而引起的一系列臨床綜合征，是各種心臟疾病的終末期［1-2］。臨床表現(xiàn)為全身乏力、呼吸困難及體液潴留等。CHF病人病情復(fù)雜，危險(xiǎn)性高，預(yù)后差。所以盡早對(duì)病人的預(yù)后作出評(píng)價(jià)，對(duì)預(yù)后不良的病人可實(shí)現(xiàn)干預(yù)措施前移，避免或延緩心血管事件的發(fā)生。美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)/美國(guó)心臟協(xié)會(huì)（ACC／AHA）心衰指南根據(jù)CHF的嚴(yán)重程度分為四個(gè)階段，但這四個(gè)階段的劃分對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值不高。目前臨床雖有一些與CHF有關(guān)指標(biāo)對(duì)預(yù)后的評(píng)估有一定的作用，但至今為止仍未形成共識(shí)。因此尋找新的、有價(jià)值的標(biāo)志物對(duì)CHF的診治有積極的意義。隨著研究的深入，臨床已公認(rèn)CHF是一種多層次、多系統(tǒng)功能改變，或多分子、基因功能衰竭交互作用的結(jié)果，這些交互作用變化包括胚胎蛋白和基因的再表達(dá)，心肌細(xì)胞肥大、凋亡等變化。近年來(lái)的研究已證實(shí)心室重構(gòu)的發(fā)生與進(jìn)展與過(guò)度表達(dá)的活性分子有關(guān)，其中細(xì)胞因子平衡失調(diào)及神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂在心室重構(gòu)的進(jìn)程中起著重要作用［3］。同時(shí)心室重構(gòu)是一個(gè)“進(jìn)展性”過(guò)程，心肌細(xì)胞在多種病因的作用下功能形態(tài)會(huì)逐漸趨于異常，直至CHF癥狀出現(xiàn)并進(jìn)展至終點(diǎn)事件-死亡，這是一個(gè)持續(xù)進(jìn)展的過(guò)程。腦利鈉肽（BNP）是Sudoh在上世紀(jì)八十年代從豬腦中發(fā)現(xiàn)的由心室合成的一種循環(huán)激素，現(xiàn)有的研究已證明心室容量或壓力負(fù)荷增加時(shí)，BNP水平會(huì)隨之升高［4］，說(shuō)明BNP參與了CHF的發(fā)生和進(jìn)展。但單一指標(biāo)靈敏度和特異度較低。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，血清微RNA-21（miRNA-21）在急性心肌梗死病人中的表達(dá)異常升高［5］。白細(xì)胞介素-6（IL-6）可通過(guò)各種機(jī)制引起心功能不全。目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)于BNP、IL-6與CHF危險(xiǎn)分層及預(yù)后關(guān)系的研究較多，但miRNA-21與CHF預(yù)后關(guān)系的研究研究較少，尚無(wú)血清miRNA-21、IL-6、BNP與CHF預(yù)后關(guān)系的研究。本研究根據(jù)是否發(fā)生CHF再次入院和全因死亡分組，比較兩組血清miRNA-21、IL-6、BNP水平，并分析水平變化與預(yù)后的關(guān)系，為臨床提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對(duì)象為唐山中心醫(yī)院2020年1月至2021年1月住院的老年CHF病人，選擇其中符合以下入排標(biāo)準(zhǔn)的120例病人為本研究樣本。研究樣本均隨訪(fǎng)至2022年1月31日，以發(fā)生CHF再入院、全因死亡為終點(diǎn)事件，發(fā)生終點(diǎn)事件的46例病人為預(yù)后不良組，年齡范圍60～79歲；未發(fā)生終點(diǎn)事件的74例病人為預(yù)后良好組，年齡范圍60～78歲；兩組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。本研究方法均告知病人或近親屬，其知情同意并簽署知情同意書(shū)，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

表1 兩組老年慢性心力衰竭（CHF）病人一般資料比較

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)《中國(guó)心力衰竭診斷和治療指南2014》中CHF診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡≥60周歲；②CHF病史≥6個(gè)月。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并腎功能并不全者、甲狀腺疾病及免疫性疾病者；②合并惡性腫瘤者；③急性心肌梗死及呼吸衰竭病人；④入院前1周使用過(guò)激素、免疫抑制劑等影響檢測(cè)指標(biāo)藥物者。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)室相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)IL-6、BNP水平；miRNA-21采用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)，先用Trizo1法對(duì)總RNA進(jìn)行抽提和純化，純度符合要求后按以下步驟操作：①以cDNA為模板行熒光定量PCR，采用大連寶生物TaKaRa公司的熒光定量PCR試劑盒；②以總RNA為模板行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；③PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；④采用相對(duì)定量方法，以miR39為外參基因，計(jì)算3次，取平均值作為血清miRNA-21值。

1.3.2 超聲檢測(cè) 所有病人均于入院24 h內(nèi)行心臟超聲檢查，檢測(cè)左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用EXCEL 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總，使用SPSS 23.0進(jìn)行研究資料分析。研究資料中的計(jì)量數(shù)據(jù)，均通過(guò)正態(tài)性檢驗(yàn)，以描述，兩組間的比較為成組t檢驗(yàn)或校正t'檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）描述，兩組比較為χ2檢驗(yàn)或校正χ2檢驗(yàn)。此外，影響因素分析及多指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用之預(yù)測(cè)評(píng)估模型的建立采用多因素非條件logistic回歸。預(yù)測(cè)診斷評(píng)估效能分析為受試者操作特征（ROC）曲線(xiàn)分析。統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，均為雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組心功能比較 預(yù)后良好組與預(yù)后不良組心功能分級(jí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。預(yù)后良好組LVEF高于預(yù)后不良組，LVEDD低于預(yù)后不良組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩組老年慢性心力衰竭（CHF）病人心功能分級(jí)及LVEF、LVEDD比較

2.2 兩組血清miRNA-21、IL-6、BNP水平比較預(yù)后良好組血清miRNA-21、IL-6、BNP水平均低于預(yù)后不良好組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 老年CHF病人預(yù)后良好組與預(yù)后不良組病人血清miRNA-21、IL-6、BNP水平比較/

表3 老年CHF病人預(yù)后良好組與預(yù)后不良組病人血清miRNA-21、IL-6、BNP水平比較/

注：CHF為慢性心力衰竭，miRNA-21為血清微RNA-21，IL-6為白細(xì)胞介素-6，BNP為腦利鈉肽。

BNP/（ng/L）524.99±39.82 1 963.58±85.73 106.87＜0.001組別預(yù)后良好組預(yù)后不良好組t值P值例數(shù)74 46 miRNA-21 0.52±0.08 1.19±0.13 31.45＜0.001 IL-6/（μg/L）71.46±10.57 139.75±19.76 21.60＜0.001

2.3 CHF病人預(yù)后不良的影響因素分析 為探討CHF病人預(yù)后不良的影響因素，建立非條件logistic回歸模型。以本研究資料為樣本，以CHF病人預(yù)后為應(yīng)變量，賦值預(yù)后不良（發(fā)生CHF再入院或全因死亡）=1，預(yù)后良好=0。以心功能指標(biāo)及血清miRNA-21、IL-6、BNP水平作為自變量。其中，心功能3個(gè)指標(biāo)互有較強(qiáng)的共線(xiàn)相關(guān)關(guān)系，經(jīng)臨床和統(tǒng)計(jì)人員會(huì)商，只選擇LVEF指標(biāo)。回歸過(guò)程采用逐步后退法，以進(jìn)行自變量的選擇和剔除，設(shè)定α剔除=0.10，α入選=0.05。

回歸結(jié)果：心功能（LVEF）指標(biāo)及三個(gè)血清指標(biāo)（miRNA-21、IL-6、BNP）均被保留入回歸模型，P＜0.05，OR＞1，即它們均是CHF病人預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表4。

表4 心功能LVEF及血清miRNA-21、IL-6、BNP水平對(duì)老年慢性心力衰竭（CHF）預(yù)后影響的logistic回歸結(jié)果

2.4 血清miRNA-21、IL-6、BNP水平對(duì)CHF預(yù)后的預(yù)測(cè)評(píng)估效能分析 進(jìn)一步探討血清miRNA-21、IL-6、BNP等三指標(biāo)對(duì)CHF預(yù)后的預(yù)測(cè)評(píng)估效能：以預(yù)后不良組為陽(yáng)性樣本（n=46），以預(yù)后良好組為陰性樣本（n=74），建立ROC預(yù)測(cè)分析模型。

單獨(dú)應(yīng)用：各指標(biāo)均參考臨床實(shí)踐劃分成若干個(gè)組段，再以軟件擬合之ROC曲線(xiàn)讀取約登指數(shù)最大值點(diǎn)，對(duì)應(yīng)計(jì)算理論閾值和各項(xiàng)參數(shù)。并按實(shí)測(cè)樣本計(jì)算敏感度、特異度、準(zhǔn)確度。

聯(lián)合應(yīng)用（LogP模式）：以前述logistic回歸結(jié)果，建立血清miRNA-21、IL-6、BNP等三指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估/預(yù)測(cè)模型，以其Log（P/1-P）=1.020×miRNA-21+0.048×IL-6+0.016×BNP為聯(lián)合應(yīng)用的虛擬概率量指標(biāo)，再行ROC分析。

分析結(jié)果顯示：聯(lián)合應(yīng)用診斷效能很高，AUC及靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度均較各單獨(dú)應(yīng)用指標(biāo)有明顯提升。見(jiàn)表5。

表5 血清miRNA-21、IL-6、BNP對(duì)老年慢性心力衰竭（CHF）病人預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討論

3.1 血清BNP水平與預(yù)后的關(guān)系 大量的研究已證實(shí)機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)在心功能出現(xiàn)異常之初就已被激活，并參與心肌重構(gòu)［6］。同時(shí)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)激活后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，并在血流動(dòng)力學(xué)等因素的相互影響下加速心功能的進(jìn)一步惡化，心室的適應(yīng)性逐漸降低，最終進(jìn)展為有癥狀的CHF。而作為心血管神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)標(biāo)志物之一的心臟肽類(lèi)物質(zhì)首先引起了臨床的高度關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)心室容量或壓力負(fù)荷升高時(shí)，BNP水平會(huì)隨之高，其主要作用是拮抗腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)［7］。大量研究已證實(shí)，CHF病人BNP水平高于健康人群，且CHF病人病情越嚴(yán)重，BNP水平越高［8］。Maisel等［9］分析了LVEF與BNP水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示，LVEF與BNP水平呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.46，P＜0.05）。本研究結(jié)果顯示，預(yù)后良好組血清BNP水平低于預(yù)后不良好組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。且預(yù)后良好組LVEF高于預(yù)后不良組，LVEDD低于預(yù)后不良組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與Maisel等研究結(jié)果基本相符。提示隨著B(niǎo)NP水平升高，CHF病人心功能狀態(tài)越差。而進(jìn)一步的logistic回歸分析顯示，CHF病人較高的BNP水平是預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，故BNP指標(biāo)對(duì)病人預(yù)后的評(píng)估及治療有一定的指導(dǎo)價(jià)值。

3.2 血清IL-6水平與預(yù)后的關(guān)系 細(xì)胞因子是由免疫和非免疫細(xì)胞分泌合成的小分子多肽，作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能。IL-6是調(diào)節(jié)炎性和免疫反應(yīng)的多功能細(xì)胞因子，單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、吞噬細(xì)胞及T2淋巴細(xì)胞等激活后均可產(chǎn)生IL-6。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，CHF病人的死亡還與促炎細(xì)胞因子水平升高有關(guān)［10］。另有研究［11］顯示，高IL-6水平的CHF病人病死率高于低IL-6水平的病人，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。認(rèn)為IL-6可結(jié)合心肌成纖維細(xì)胞與心肌細(xì)胞上的受體，增加一氧化氮（NO）的合成，誘導(dǎo)心臟纖維化和肥大致舒張功能障礙。另有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究［12］顯示，IL-6通過(guò)Janus激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT3）途徑抑制左室乳頭肌收縮功能，認(rèn)為IL-6介導(dǎo)的負(fù)性肌力作用是通過(guò)促進(jìn)心肌合成N0而實(shí)現(xiàn)的，隨著心功能不全的加重，血清IL-6水平呈進(jìn)行性增高。因此，檢測(cè)血清IL-6水平可間接反映CHF病人的血流動(dòng)力學(xué)紊亂，并可作為預(yù)后預(yù)測(cè)的獨(dú)立指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，預(yù)后良好組血清IL-6水平低于預(yù)后不良好組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步logistic回歸分析顯示：較高水平的IL-6，也是CHF病人預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。故血清IL-6有一定的預(yù)測(cè)CHF病人預(yù)后的評(píng)估效能，此點(diǎn)亦為本研究的ROC分析結(jié)果所證實(shí)。

3.3 血清miRNA-21水平與預(yù)后的關(guān)系 MicroRNA（miRNA）是一類(lèi)內(nèi)生的微小RNA，早期的臨床研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-21在多個(gè)器官惡性腫瘤中呈高表達(dá)，因此一直將其視為致癌性物質(zhì)。近年來(lái)miRNA-21在心血管疾病上的作用受到臨床的普遍關(guān)注［13］。有文獻(xiàn)報(bào)道［14］，miRNA幾乎參與了包括心肌缺血、冠狀動(dòng)脈狹窄、心肌肥厚、CHF等所有心血管疾病的病理過(guò)程，而miRNA-21在其中參與了多個(gè)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-21可外周血中可穩(wěn)定存在，并在急性心肌梗死病人中的表達(dá)異常升高［14-15］，提示其可能成為心血管疾病病人的又一敏感指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，預(yù)后良好組血清miRNA-21水平低于預(yù)后不良好組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。logistic回歸分析顯示，較高水平的miRNA-21，是CHF病人預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。基于此建立的ROC曲線(xiàn)，證實(shí)血清miRNA-21預(yù)測(cè)CHF病人預(yù)后的AUC在單一指標(biāo)中預(yù)測(cè)價(jià)值最高。究其原因可能是當(dāng)心臟負(fù)荷增加時(shí)，會(huì)上調(diào)miRNA-21表達(dá)，并激活纖維化基因程序，促進(jìn)心肌細(xì)胞纖維化［16-18］。

最后，本研究結(jié)果顯示，血清miRNA-21、IL-6、BNP聯(lián)合預(yù)測(cè)CHF病人預(yù)后的AUC 95%CI為0.86（0.77，0.94），Youden為0.69，均遠(yuǎn)高于3種指標(biāo)的單獨(dú)應(yīng)用。此結(jié)果提示該聯(lián)合應(yīng)用方法，能有效地用于CHF的早期診斷和預(yù)后評(píng)估，為CHF病人的靶向治療提供新思路。當(dāng)然，本研究由于樣本量較少，研究結(jié)果可能存在偏差，后期將擴(kuò)大樣本，對(duì)研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)。