MAP3K7、MPO基因與中國人群壞疽性膿皮病發(fā)病的相關(guān)性研究

靳傳洋 王真真 孫樂樂 劉亭亭 劉 紅 張福仁

1山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬皮膚病醫(yī)院,山東濟(jì)南,250022;2 山東省皮膚病性病防治研究所,山東濟(jì)南,250022

壞疽性膿皮病(pyoderma gangrenosum, PG)是一種以皮膚炎癥和潰瘍?yōu)橹饕憩F(xiàn)的非感染性、自身炎性、嗜中性皮膚病。PG表現(xiàn)為快速發(fā)展的疼痛性皮膚潰瘍,常常發(fā)生在下肢和軀干[1]。其發(fā)病率在美國成年人中為58/107,在英國人口中約為6/107[2]。其病因尚不明確,目前觀點(diǎn)認(rèn)為,該病是在遺傳傾向的背景下,先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)失調(diào)造成的[3]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)了10個(gè)與PG發(fā)病相關(guān)的基因:NLRP3,MEFV,NOD2,LPIN2,PSMB8,NLRP12,PSTPIP1,PTPN6,JAK2和NFκB1[4-8]。這些基因突變后主要是通過影響NF-κB通路來影響多種細(xì)胞因子的過度表達(dá)(如IL-1α,IL-1β,IL-36,G-CSF等),進(jìn)而影響中性粒細(xì)胞的聚集,延長中性粒細(xì)胞壽命,從而導(dǎo)致PG的發(fā)病[2]。

既往對PG易感基因的報(bào)道多集中在病例報(bào)道和小樣本的研究中(最大樣本量為14例PG患者和20例對照)[6],且研究的種群多集中在歐美人種,僅有1例對中國漢族群體的病例報(bào)道[9]。因此,我們匯總了一組可能與PG發(fā)病相關(guān)的基因,囊括了既往報(bào)道的10個(gè)基因(NLRP3,MEFV,NOD2,LPIN2,PSMB8,NLRP12,PSTPIP1,PTPN6,JAK2和NFκB1);同時(shí),在對既往報(bào)道的PG相關(guān)基因PTPN6所在炎癥通路的研究中發(fā)現(xiàn),MAP3K7,MyD88,SYK,RIRPK1在促進(jìn)IL-1α、TNF、G-CSF等細(xì)胞因子分泌起關(guān)鍵作用[10]。此外,PG患者中存在髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)功能缺陷的報(bào)告[11]提示:髓過氧化物酶編碼基因MPO有害性突變可能是PG患者中髓過氧化物酶功能缺陷的原因。因此,我們也納入了PTPN6所在炎性通路中的4個(gè)相關(guān)基因(MAP3K7,MyD88,SYK,RIRPK1)和髓過氧化物酶編碼基因MPO,共計(jì)15個(gè)基因,對36例中國漢族PG患者的此組基因進(jìn)行目標(biāo)基因二代測序(next generation sequencing,NGS),旨在探索該病的遺傳學(xué)背景與種族差異性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015-2022年來我院就診的36例壞疽性膿皮病散發(fā)患者,年齡10～89歲,男22例,女14例,平均年齡56.06歲,平均發(fā)病年齡54.69歲。經(jīng)過我院皮膚病醫(yī)師臨床診斷及組織病理學(xué)診斷確診為壞疽性膿皮病。448例對照采用全外顯子測序,測序結(jié)果儲存于山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬皮膚病醫(yī)院數(shù)據(jù)庫,對照組男356例,女92例,平均年齡69.67歲。該研究通過山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬皮膚病醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 從-80℃超低溫冰箱取出外周血,使用TIANamp Blood DNA Kit DP318-02(天根血液基因組DNA提取試劑盒),TGudieM16 全自動(dòng)核酸提取儀提取外周血基因組DNA。

1.2.2 目標(biāo)區(qū)域測序及注釋 使用Access Array公司微控流技術(shù)對36例壞疽性膿皮病患者的15個(gè)基因進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域測序。15個(gè)基因包括既往文獻(xiàn)中報(bào)道的10個(gè)突變基因NLRP3,MEFV,NOD2,LPIN2,PSMB8,NLRP12,PSTPIP1,PTPN6,JAK2,NFκB1以及可能與PG發(fā)病相關(guān)的基因共5個(gè):SYK,MYD88,RIPK1,MAP3K7,MPO。測序結(jié)果基于hg19參考基因組,用ANNOVA軟件對所有36例PG患者與448例全外顯子測序數(shù)據(jù)中的此15個(gè)基因中存在的變異位點(diǎn)進(jìn)行注釋。除去千人基因計(jì)劃數(shù)據(jù)庫2015版與ExAC數(shù)據(jù)庫中等位基因頻率大于0.005的數(shù)據(jù)后,滿足以下任意一條即認(rèn)為該突變?yōu)橛泻ν蛔?(1)stop gain, stoploss, frameshift, splicing;(2)滿足 SIFT_score<0.05, Polyphen2_HDIV_score >=0.957, CADD_pred>15 并且排除ACMG 2015標(biāo)準(zhǔn)中“Benign”和“Likely benign”的突變位點(diǎn)。注釋后再進(jìn)行顯性遺傳模式和隱性遺傳模式的基因負(fù)荷檢驗(yàn)。

1.2.3 Sanger測序 我們對值得討論的致病性突變位點(diǎn)進(jìn)行了Sanger測序驗(yàn)證。使用NCBI網(wǎng)站的Primer-BLAST引物設(shè)計(jì)工具進(jìn)行引物設(shè)計(jì),分別獲取外顯子的跨側(cè)翼的上下游引物序列,由華大基因公司合成。PCR反應(yīng)在美國ABI公司9700 型PCR擴(kuò)增儀上完成,使用醋酸鈉乙醇沉淀法純化PCR產(chǎn)物。最后在美國ABI公司3500XL遺傳分析儀直接測序。

2 結(jié)果

2.1 NGS測序結(jié)果 按照我們的有害性篩選標(biāo)準(zhǔn),在其中4例患者中的5個(gè)基因中,發(fā)現(xiàn)了6個(gè)有害性突變位點(diǎn)。包括一個(gè)移碼突變: NLRP12:c.908delT(p.F303fs)和 5個(gè)錯(cuò)義突變:MAP3K7: c.815C>G(p.S272C), MPO: c.1484C>T(p.T495I), MPO: c.1705C>T(p.R569W), NOD2: c.2975G>A(p.R992Q), SYK: c.389A>G(p.E130G) (MAP3K7, MPO, NOD2, SYK 和NLRP12 的氨基酸序列分別基于NM_003188, NM_000250, NM_001293557, NM_001135052 和NM_001277126轉(zhuǎn)錄本)。經(jīng)過顯性遺傳模式和隱性遺傳模式的基因負(fù)荷檢驗(yàn),我們未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的突變基因(表1)。然而我們發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)值得討論的突變。MAP3K7的雜合突變和MPO的純合(復(fù)合雜合)突變,此兩種突變僅存在于病例組,提示:MAP3K7與MPO可能是PG發(fā)病的關(guān)聯(lián)基因。

表1 基因負(fù)荷檢驗(yàn)結(jié)果

2.2 Sanger測序結(jié)果 我們對3個(gè)值得討論的致病性突變位點(diǎn)進(jìn)行了Sanger測序驗(yàn)證,排除了假陽性。測序結(jié)果如圖1。

1a:MPO錯(cuò)義突變: c.C1484T in exon 9;1b:MPO錯(cuò)義突變: c.C1705T in exon 10;1c:MAP3K7錯(cuò)義突變:c.C815G in exon 8;1d:MPO正常對照:c.1484C in exon 9;1e:MPO正常對照: c.1705C in exon 10;1f:MAP3K7正常對照:c.815C in exon 8圖1 Sanger測序結(jié)果

3 討論

在我們的病例樣本中,共在MAP3K7,SYK,NOD2,MPO,NLRP12基因中發(fā)現(xiàn)了致病性突變位點(diǎn),其中MAP3K7的雜合突變和MPO純合(復(fù)合雜合)突變引起了我們的關(guān)注,這兩個(gè)基因突變僅見于PG患者群體中,在448例對照中均無出現(xiàn)。MAP3K7基因編碼TAK1(tumor growth factor-β activated kinase 1),Prajwal Gurung團(tuán)隊(duì)通過對Ptpn6spin小鼠的研究發(fā)現(xiàn)TAK1是引發(fā)該種小鼠嗜中性粒細(xì)胞疾病的關(guān)鍵。Ptpn6spin小鼠是PTPN6基因純合突變模型,導(dǎo)致SHP1上208位氨基酸Tyr突變?yōu)锳sn,該種小鼠會出現(xiàn)持續(xù)性的足墊腫脹和化膿性炎癥,與人類嗜中性皮膚病非常相似[12]。在對該種小鼠的研究中發(fā)現(xiàn):脾酪氨酸激酶 (spleen tyrosine kinase,SYK)是一種可磷酸化MyD88(myeloid differentiation primary response gene 88)的關(guān)鍵激酶,MyD88磷酸化后可將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到RIRK1(receptor interacting protein kinase 1,由RIRPK1基因編碼)和TAK1(tumor growth factor-β activated kinase 1 ,由MAP3K7基因編碼),最終促進(jìn) IL-1α,TNF,G-CSF等細(xì)胞因子分泌,并在PTPN6spin小鼠中介導(dǎo)皮膚病;RIPK1支架功能和TAK1信號傳導(dǎo)在Ptpn6spin小鼠足墊炎癥中發(fā)揮重要作用,我們在人類PG患者中發(fā)現(xiàn)的MAP3K7突變,提示RIPK1-TAK1信號軸可能在人類PG發(fā)病過程中也發(fā)揮著相似的作用。

此外,我們發(fā)現(xiàn)的MPO復(fù)合雜合突變(c.1484C> T;c.1705C>T)是隊(duì)列中純合(復(fù)合雜合)狀態(tài)下觀察到的唯一變化。該患者具有的c.1705C>T錯(cuò)義突變在先前髓過氧化物酶缺乏癥(MPOD)患者中曾被報(bào)道過[13]。 髓過氧化物酶是中性粒細(xì)胞嗜天青顆粒和單核細(xì)胞溶酶體中的重要成分[14],髓過氧化物酶缺乏癥是一種常染色體隱性遺傳病,在1954年首次描述,該病是吞噬細(xì)胞常見的遺傳缺陷,表現(xiàn)為對病原微生物殺傷能力受損[15]。MPOD患者可伴發(fā)嗜中性皮膚病,例如全身泛發(fā)性膿皰型銀屑病(Generalized pustular psoriasis,GPP)[13]和PG[11]。GPP是一種無菌性膿皰性疾病,可以表現(xiàn)為急性的或持續(xù)性進(jìn)行性發(fā)作,有時(shí)可有危及生命的多系統(tǒng)炎癥發(fā)作。我們在該例MPO復(fù)合雜合突變的PG患者中,發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)[9.89×109,參考值(1.8～6.3)×109]增加和中性粒細(xì)胞比例(82.4%,參考值40%～55%)增加的現(xiàn)象,這一現(xiàn)象在MPO突變的GPP患者中也有出現(xiàn)。

MPO功能喪失突變導(dǎo)致GPP發(fā)病的機(jī)制,已經(jīng)有了相對清晰的闡釋。Haskamp等證明,GPP患者中的MPO功能喪失突變導(dǎo)致中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中的MPO缺乏,并且導(dǎo)致中性粒細(xì)胞中中性粒細(xì)胞絲氨酸組織蛋白酶(neutrophil serine proteases cathepsin G,CTSG)的活性增加。CTSG的活性增加會導(dǎo)致IL-36前體向IL-36的轉(zhuǎn)化增加。其次,MPO缺陷導(dǎo)致中性粒細(xì)胞細(xì)胞外陷阱(neutrophil extracellular trap,NET)的形成減少,導(dǎo)致與NET結(jié)合蛋白酶減少,激活I(lǐng)L-36前體的可溶性中性粒細(xì)胞蛋白酶占優(yōu)勢。此外,在MPO缺陷患者和MPO-/-小鼠中,單核細(xì)胞對中性粒細(xì)胞的吞噬作用(中性粒細(xì)胞胞葬作用)受損,這表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞在皮膚炎癥部位的抵抗時(shí)間延長和外周血中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)增多[13]。這些發(fā)現(xiàn)表明,MPO在皮膚中充當(dāng)神經(jīng)營養(yǎng)因子相關(guān)炎癥的調(diào)節(jié)劑,MPO的功能喪失突變通過IL-36高活化和中性粒細(xì)胞胞葬作用受損誘導(dǎo)膿皰型銀屑病的發(fā)生[16]。IL-36也是一種被認(rèn)為在PG病理生理學(xué)中起重要作用的細(xì)胞因子[17],在PG患者的皮損中亦可觀察到密集的中性粒細(xì)胞浸潤和NET聚集[18],在我們MPO復(fù)合雜合突變的患者中也發(fā)現(xiàn)了中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)增加的現(xiàn)象。這些提示,MPO功能喪失突變在PG的發(fā)病過程中,可能發(fā)揮著與在GPP發(fā)病過程中相似的作用。

總之,我們對既往研究的可能與壞疽性膿皮病15個(gè)基因進(jìn)行了目標(biāo)區(qū)域測序,在MAP3K7,SYK,NOD2,MPO,NLRP12基因中發(fā)現(xiàn)了功能丟失突變位點(diǎn),其中NOD2與NLRP12基因突變在一項(xiàng)針對意大利PG患者的研究中被報(bào)道過[4]。我們在中國漢族的PG患者中發(fā)現(xiàn)了這兩個(gè)基因的突變,表明壞疽性膿皮病中存在的NOD2,NLRP12基因的突變可能是跨越種族的。此外,我們發(fā)現(xiàn)了MAP3K7,MPO基因功能丟失突變可能與壞疽性膿皮病的發(fā)病相關(guān)。其中,MAP3K7在Ptpn6spin小鼠發(fā)生類似人類嗜中性皮膚病的過程中起著關(guān)鍵作用,PTPN6突變在美國壞疽性膿皮病患者中被報(bào)道過[5],MAP3K7基因上功能丟失的突變,提示了RIPK1-TAK1信號軸可能在PG發(fā)病過程中起著重要作用。早在1991年,Disdier等就發(fā)表過一例法國PG患者中存在髓過氧化物酶缺陷的病例報(bào)道[11],MPO突變可能是髓過氧化物酶缺陷的原因,這提示MPO與PG的發(fā)病可能有著密切的關(guān)系。

我們的研究也存在著不足,這可能是由于本研究的樣本量太小而沒有發(fā)現(xiàn)顯著性差異,需要后續(xù)更大樣本量的探索?？傊覀兊难芯堪l(fā)現(xiàn)了兩個(gè)有提示意義的基因:MPO與MAP3K7,證明了PG是一種復(fù)雜的多基因相關(guān)自身免疫性疾病,為進(jìn)一步探明PG發(fā)病機(jī)制提供了遺傳學(xué)的視角。