常染色體隱性遺傳性羊毛狀發(fā)伴少毛癥兩家系基因突變分析

趙安琪 曹巧玉 鄭璐瑤 劉慶梅 李 明 吳文育 趙敬軍

1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院皮膚科,上海,200092;2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所,上海,200092;3復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院皮膚科,上海,201102;4安徽省兒童醫(yī)院皮膚科,安徽合肥,230022;5復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科,上海,200040

遺傳性少毛癥是一組相對(duì)罕見的遺傳性皮膚病,具有廣泛的基因譜和表型譜,根據(jù)是否伴隨其他系統(tǒng)損害分為綜合征型和非綜合征型。非綜合征型遺傳性少毛癥僅表現(xiàn)為毛發(fā)的異常,其毛發(fā)表型包括先天性少毛/無毛、羊毛狀發(fā)、念珠狀發(fā)等。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道了兩種遺傳模式,分別是常染色體顯性遺傳和常染色體隱性遺傳[1]。在非綜合征型遺傳性少毛癥中,常染色體隱性遺傳性羊毛狀發(fā)伴少毛癥(autosomal recessive woolly hair/ hypotrichosis, ARWH/HT,OMIM 278150/604379)是一種發(fā)生于高加索人或亞洲人群中的遺傳性疾病。患者通常在出生時(shí)即表現(xiàn)出毛發(fā)的異常特征,其頭發(fā)呈粗糙、無光澤、干燥、卷曲,形成發(fā)干螺旋狀或波浪卷曲的外觀,導(dǎo)致頭發(fā)呈現(xiàn)彌漫性羊毛狀,并伴有不同程度的毛發(fā)稀疏?；颊叩拿l(fā)生長緩慢,到達(dá)一定長度后即停止生長,同時(shí)可能伴有毛發(fā)色素減退。眉毛、睫毛、胡須、腋毛和陰毛可能呈現(xiàn)稀少或正常狀態(tài)。其他方面,如牙齒、指(趾)甲及汗腺的發(fā)育正常,極少數(shù)患者可能伴有掌跖角化癥和毛周角化癥。目前已報(bào)道的致病基因包括:LIPH,LPAR6,C3ORF52,KRT25[2]。我們收集了兩例ARWH/HT家系,并進(jìn)行了突變檢測以進(jìn)一步了解該疾病的遺傳基礎(chǔ)。

1 病例資料

先證者1,男,24歲。出生后出現(xiàn)頭發(fā)卷曲、稀少,頭發(fā)生長緩慢,至2～3 cm后停止生長,易扯斷,眉毛、睫毛、腋毛、陰毛稀疏,牙齒、指甲、皮膚無明顯異常。父母非近親結(jié)婚,家族成員中無類似疾病患者。先證者2,女,7歲,表現(xiàn)為生后毛發(fā)卷曲、稀疏,頭發(fā)生長至3～4 cm后停止生長,發(fā)質(zhì)粗糙,易纏繞打結(jié),易折斷,牙齒、指甲、皮膚無明顯異常。父母非近親結(jié)婚,家族成員中無類似疾病患者。

體檢:兩例患者一般情況可,營養(yǎng)、智力、骨骼均發(fā)育正常,心、肺等系統(tǒng)檢查未見異常。皮膚科檢查:先證者1頭發(fā)稀疏明顯,可見頭皮裸露,頭頂部、后枕部可見頭發(fā)整體卷曲,發(fā)質(zhì)粗糙,卷曲纏繞成團(tuán)。眉毛、睫毛、腋毛和陰毛較稀疏(圖1a)。先證者2頭發(fā)卷曲呈羊毛狀改變,稍稀疏,眉毛、睫毛、腋毛和陰毛較稀疏,患者均無牙齒、黏膜、指甲等其他外胚層發(fā)育異常表現(xiàn)(圖1b)。綜合上述病史和體檢結(jié)果,診斷為羊毛狀發(fā)伴少毛。

2 基因突變檢測

2.1 外周血基因組DNA提取 經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批件號(hào)XHEC-D-2019-115),以及先證者1本人和先證者2的父母簽署知情同意書后,分別采取先證者及其父母外周血2 mL,應(yīng)用QIAamp DNA Blood MinikitⅠ(德國QIAGEN公司)試劑盒提取全血基因組DNA。同樣方法提取100例無親緣關(guān)系的健康個(gè)體血樣基因組DNA作為對(duì)照。

2.2 二代靶向測序和Sanger測序 使用二代遺傳性皮膚病靶向測序包(上海安百隆生物科技有限公司)檢測先證者的突變基因,該測序包納入554個(gè)與遺傳性皮膚病密切相關(guān)的基因,靶向測序的范圍涵蓋目標(biāo)基因外顯子及毗鄰剪接區(qū)域約20 bp。設(shè)計(jì)探針由遺傳性皮膚病權(quán)威專家設(shè)計(jì),由瑞士羅氏NimbleGen合成。測序平臺(tái)選用IlluminaHiseq X Ten高通量測序儀測序,平均測序深度可達(dá)200×以上。在相關(guān)變異頻率數(shù)據(jù)庫[寡核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(dbSNP)、千人基因組數(shù)據(jù)庫、ClinVar數(shù)據(jù)庫和人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)]中對(duì)致病變異位點(diǎn)進(jìn)行評(píng)估,根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG)遺傳變異分類指南及患者的臨床表型進(jìn)行致病變異的篩選。使用Primer-BLAST工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)設(shè)計(jì)基因引物,并通過PCR擴(kuò)增,用ABI3730XL型全自動(dòng)測序儀進(jìn)行Sanger測序。E5正向引物5’-ATTAGCCTTGCAGTGGATGAGTG-3’,反向引物5’-CCTGCCAGGTATAAGCAGGAAT-3’,擴(kuò)增片段長度為407 bp;E6正向引物5’-GGGTCTTTCACCAAAGCATA-3’,反向引物3’-GAGGAAACTGGTTAGAC-5’,擴(kuò)增片段長度為434 bp;E7正向引物5’-GATTGGATCAACCTGGCTGC-3’,反向引物5’-ACATGCAGAATGGGCTCTCC-3’,擴(kuò)增片段長度為306 bp;反應(yīng)條件:96℃預(yù)變性3 min,96℃變性30 s,在相應(yīng)Tm值溫度退火30 s,72℃延伸30 s,循環(huán)35次,73℃充分延伸5 min,4℃保存。

2.3 剪切突變驗(yàn)證 對(duì)于先證者攜帶的剪切突變,我們進(jìn)行了Minigene實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。首先,將目的基因片段通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞系中,進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。隨后,采用Trizol法提取培養(yǎng)細(xì)胞中的RNA,并進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn),設(shè)計(jì)特定于突變位點(diǎn)的PCR引物,針對(duì)剪切突變c.982+12A>G設(shè)計(jì)引物序列為:LIPH-E7F:AGTGATGGTGAGTGTGGTTGTTGCTTTTGCCT-AA;LIPH-E7R:AACCACACTCACCACTCACTGCAGAATG。針對(duì)剪切突變c.629-1_629delinsTT設(shè)計(jì)引物序列為:LIPH-E5F:TATTACTGGGCTACAAGGAGCCAT ;LIPH-E5R:CTCCTTGTAGCCCAGTAATAAAAGAGAACACATCTGCT。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳驗(yàn)證后,我們回收產(chǎn)物并進(jìn)行Sanger測序,以驗(yàn)證其剪切方式。

3 結(jié)果

3.1 二代皮膚靶向測序包篩選和Sanger測序驗(yàn)證結(jié)果 兩例先證者均檢測到了LIPH的復(fù)合雜合突變。先證者1的LIPH第6號(hào)外顯子第742位核苷酸由C突變?yōu)锳(c.742C>A),導(dǎo)致第248位氨基酸由組氨酸變?yōu)樘於彼?p.His248Asn),同時(shí)第7號(hào)外顯子下游第12位核苷酸由A突變?yōu)镚(c.982+12A>G),Sanger測序驗(yàn)證顯示先證者父親為c.982+12A>G雜合突變攜帶者,先證者母親為c.742C>A雜合突變攜帶者。家系圖和突變攜帶情況見圖2a、2b。

2a、2b:家系1的先證者和父母突變信息;2c、2d:家系2的先證者和父母突變信息圖2 家系圖和先證者及父母的突變信息

先證者2的LIPH第5號(hào)外顯子上游第1位至編碼區(qū)第629位核苷酸由GC突變?yōu)門T(c.629-1_629delinsTT),同時(shí)第5號(hào)外顯子編碼區(qū)第687和688位核苷酸之間插入17 bp (c.686delinsGTAGAAC-CCAACCTGGCT),該插入突變會(huì)導(dǎo)致從229位天冬氨酸開始發(fā)生移碼突變,移碼37位氨基酸后編碼終止(p.Asp229GLyfs*37),Sanger測序驗(yàn)證顯示先證者父親為c.686delinsGTAGAACCCAACCTGGCT雜合突變攜帶者,先證者母親為c.629-1_629delinsTT雜合突變攜帶者。家系圖和突變攜帶情況見圖2c、2d。100例對(duì)照中均未檢測到該四種突變。SIFT和Polyphen-2軟件預(yù)測p.His248Asn和p.Ile220Argfs*29均為有害變異位點(diǎn),可能影響蛋白質(zhì)功能。

3.2 剪切突變驗(yàn)證結(jié)果LIPH剪切突變c.982+12A>G是指第7號(hào)外顯子下游第12位核苷酸由A突變?yōu)镚,突變示意圖如圖3a中黃色標(biāo)注所示。Minigene驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)該剪切突變會(huì)使剪切位點(diǎn)后延,導(dǎo)致7bp內(nèi)含子序列滯留,圖3b展示了Sanger測序結(jié)果和錯(cuò)誤剪切,內(nèi)含子滯留部分標(biāo)紅。

3a:LIPH c.982+12A>G剪切突變示意圖,如黃色標(biāo)注所示;3b:Sanger測序結(jié)果,該剪切突變導(dǎo)致7 bp內(nèi)含子序列滯留(標(biāo)紅);3c:LIPH c.629-1_629delinsTT剪切突變示意圖;3d:Sanger測序結(jié)果,兩種錯(cuò)誤剪切:①突變所在5號(hào)外顯子被跳過(主峰);②5號(hào)外顯子前AG缺失后,將內(nèi)部AG識(shí)別為剪切信號(hào),導(dǎo)致缺失14 bp(底峰)圖3 剪切突變驗(yàn)證結(jié)果

LIPH剪切突變c.629-1_629delinsTT是指第5號(hào)外顯子上游第1位至編碼區(qū)第629位核苷酸由GC突變?yōu)門T,突變示意圖如圖3c中黃色標(biāo)注所示。Minigene驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)該剪切突變會(huì)導(dǎo)致復(fù)雜剪切變異,同時(shí)存在兩種錯(cuò)誤剪切:①突變所在5號(hào)外顯子被跳過(主峰);②5號(hào)外顯子前AG缺失后,將內(nèi)部13-14位的AG堿基識(shí)別為剪切信號(hào),導(dǎo)致缺失14 bp(底峰);這兩種錯(cuò)誤剪切如圖3d所示。

4 討論

常染色體隱性羊毛狀發(fā)/少毛癥(ARWH)是一種罕見的遺傳性毛發(fā)疾病,臨床特征為出生時(shí)或生后早期出現(xiàn)頭發(fā)卷曲稀疏。目前已報(bào)道的基因包括LIPH,LPAR6,KRT25和C3ORF52等[2]。LIPH基因定位于人染色體3q27上,含有10個(gè)外顯子,編碼451個(gè)氨基酸,它編碼脂肪酶H,也稱為膜相關(guān)性磷脂酸-選擇性磷脂酶A1α,主要功能是催化水解磷脂酸產(chǎn)生2-酰基溶血磷脂酸(2-acyl lysophosphatidic acid, LPA)。C3ORF52能與LIPH相互作用,影響其催化功能[3]。LPA會(huì)激活溶血磷脂酸受體6(lysophosphatidic acid receptor 6,LPAR6),LIPH、LPAR6或C3ORF52的功能喪失會(huì)導(dǎo)致LIPH- LPA -LPAR6信號(hào)傳導(dǎo)減少,導(dǎo)致表皮生長因子受體信號(hào)傳導(dǎo)的反激活減少,從而影響毛囊發(fā)育和毛發(fā)生長[2]。目前已報(bào)道的LIPH基因致病突變位點(diǎn)有34個(gè),包括12個(gè)錯(cuò)義/無義突變,4個(gè)剪接突變,7個(gè)缺失突變,4個(gè)插入突變,以及4個(gè)缺失-插入突變(www.hgmd.cf.ac.uk)。

ARWH具有遺傳異質(zhì)性,因種族和國家/地理區(qū)域而異。在巴基斯坦ARWH人群中,47.2%由LIPH突變導(dǎo)致,其余52.8% ARWH患者由LPAR6突變導(dǎo)致。在巴基斯坦LIPH突變患者中,超過一半攜帶c.659_660delTA (p.Ile220Argfs*29)突變。在日本ARWH人群中,98.7%攜帶LIPH突變,且熱點(diǎn)突變?yōu)閏.736T>A (p.Cys246Ser)和c.742C>A (p.His248Asn)[2]。在我國尚未有統(tǒng)計(jì)LIPH突變占比和熱點(diǎn)突變情況。據(jù)我們統(tǒng)計(jì),目前中國已經(jīng)報(bào)道的LIPH突變患者中,c.736T>A和c.742C>A突變占75%左右[4-12]。

目前,已有日本的兩項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),外用米諾地爾可以改善LIPH突變導(dǎo)致的ARWH患者。在其中一項(xiàng)前瞻性非隨機(jī)臨床試驗(yàn)中,共納入8例攜帶LIPH致病突變的ARWH患者和1例TRPS1致病突變導(dǎo)致的毛發(fā)-鼻-指綜合征患者,所有納入者均每天2次外用1%米諾地爾,持續(xù)一年,發(fā)現(xiàn)所有具有LIPH致病變異的患者少毛癥狀均有改善,毛發(fā)-鼻-指綜合征患者的少毛癥沒有改善[13]。在另一項(xiàng)研究中,共納入4例具有LIPH突變的日本ARWH患者,所有患者在局部應(yīng)用米諾地爾后均出現(xiàn)毛發(fā)生長[14]。

我們團(tuán)隊(duì)在2020年報(bào)道一例羊毛狀發(fā)患者攜帶LIPHc.686delAinsGTAGAACCCAACCTGGCT突變,該突變與先證者2的突變位點(diǎn)一致,導(dǎo)致D229Gfs*37的移碼突變,最終產(chǎn)生截?cái)嗟鞍譡6]。此外,本報(bào)道中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新的LIPH剪切突變c.982+12A>G和c.629-1_629delinsTT。剪切突變是指影響基因剪切過程的一類突變,可能引起多種轉(zhuǎn)錄本的變化,包括外顯子跳躍、內(nèi)含子保留、部分外顯子缺失以及復(fù)雜剪切變異(包括外顯子跳躍、內(nèi)含子保留等多種組合)等。而這些異常剪切的結(jié)果是蛋白質(zhì)缺失一長段氨基酸或者更為常見的翻譯提前終止(插入、缺失的序列往往不是3的倍數(shù))。我們通過Minigene實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)該剪切突變導(dǎo)致的錯(cuò)誤剪切。其中,c.982+12A>G導(dǎo)致出現(xiàn)7 bp的內(nèi)含子滯留,c.629-1_629delinsTT則同時(shí)導(dǎo)致了5號(hào)外顯子跳躍和部分5號(hào)外顯子缺失。我們的研究進(jìn)一步豐富了LIPH的基因譜,具體機(jī)制有待進(jìn)一步功能學(xué)實(shí)驗(yàn)證明。