腥擲孢酵母17wy1 的分離、鑒定及對(duì)小麥白粉病防效初探

王俊美，李亞紅，徐 飛，楊共強(qiáng)，馮超紅，李好海，宋玉立

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部華北南部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2.河南省植物保護(hù)檢疫站，河南 鄭州 450002）

由布氏白粉菌（Blumeria graminisf.sp.tritici，Bgt）侵染引起的小麥白粉病在全球范圍內(nèi)普遍發(fā)生，是小麥生產(chǎn)上的主要病害之一，嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)。選用對(duì)小麥白粉病具有生防作用的微生物有望成為取代化學(xué)殺菌劑的一種有效方法[1-2]。拮抗酵母菌具有抗菌譜廣、可以與化學(xué)殺菌劑聯(lián)合使用、不產(chǎn)生對(duì)寄主和人有毒有害物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，是一類理想的生防菌[3]。腥擲孢酵母是一種腐生酵母樣擔(dān)子菌，能夠彈射孢子（稱為擲孢子），通常附生在不同種類植物的葉片表面[4-5]。GOKHALE[6]將Tilletiopsis albescens和Tilletiopsis pallescens歸到腥擲孢酵母屬Tilletiopsis，WANG等[7]2015 年將腥擲孢酵母屬屬名Tilletiopsis變更為Golubevia，沿用至今。研究表明，腥擲孢酵母對(duì)白粉病具有生物控制活性[8]。國(guó)內(nèi)外對(duì)于腥擲孢酵母的研究主要集中在對(duì)玫瑰、黃瓜、葡萄等高經(jīng)濟(jì)附加值作物病害的拮抗機(jī)制和控制方面[9-12]。小麥白粉病拮抗腥擲孢酵母菌的研究起步較晚，特別是直接從小麥上分離獲得腥擲孢酵母菌并對(duì)其拮抗機(jī)制和病害控制進(jìn)行研究的報(bào)道不多[13-14]。

筆者前期在室內(nèi)培養(yǎng)小麥白粉菌的試驗(yàn)中觀察到分生孢子有異常生長(zhǎng)的現(xiàn)象，即菌落顏色呈現(xiàn)黃褐色、孢子散生且生長(zhǎng)緩慢、孢子量消減且逐漸敗落，推測(cè)可能是被某些具有拮抗作用的微生物寄生所致。因此，對(duì)這類拮抗微生物進(jìn)行分離，并根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和26S rDNA 序列分析確定其分類地位，同時(shí)，測(cè)定其發(fā)酵液對(duì)小麥白粉菌分生孢子萌發(fā)的抑制效果以及對(duì)室內(nèi)盆栽、田間小麥白粉病的防治效果，利用定量PCR 解析其拮抗機(jī)制，為其在小麥白粉病防治中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試小麥白粉菌為本實(shí)驗(yàn)室保存的混合小麥白粉菌株；供試小麥材料為感白粉病品種津豐1號(hào)。

拮抗微生物分離采用PDA 培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L、自然pH值，120 ℃滅菌30 min），拮抗微生物液體培養(yǎng)采用YPB 培養(yǎng)基（酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L，自然pH值，120 ℃滅菌30 min）。

供試試劑：Omega DNA 提取試劑盒、Taq酶、dNTPs、Trizol 試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑等均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 拮抗微生物的分離純化與分子生物學(xué)鑒定

用滅菌手術(shù)刀將生長(zhǎng)異常的小麥白粉菌分生孢子小心刮下涂抹于PDA 固體培養(yǎng)基上，置于霉菌培養(yǎng)箱中25 ℃恒溫培養(yǎng)，3～5 d 后挑取在培養(yǎng)皿蓋上有映射的菌落部分并轉(zhuǎn)接于PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，重復(fù)2 次，收集培養(yǎng)物于PE 離心管中，提取DNA，進(jìn)行PCR鑒定。

采用Omega 試劑盒提取DNA，利用26S rDNA D1/D2 區(qū)序列分析法進(jìn)行分類鑒定。引物序列為NL1：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3' ；NL4：5'-GGTCCGTDTTTCAAGAACGG-3'[15]。 將PCR 產(chǎn)物直接送武漢奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，序列提交至GenBank 中心，獲得登錄號(hào)。通過BLAST 在線軟件（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行比對(duì)分析并獲得同源序列，根據(jù)試驗(yàn)菌株與已知酵母菌株相應(yīng)序列的相似程度對(duì)試驗(yàn)菌株進(jìn)行鑒定，并利用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。將鑒定完畢、種類明確的分離菌株以PDA 試管斜面的方式接種培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)出后，送中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行菌株保藏，獲得菌株保藏號(hào)。

1.3 拮抗酵母菌對(duì)小麥白粉菌分生孢子萌發(fā)的抑制試驗(yàn)

將PDA 培養(yǎng)基上的拮抗酵母菌轉(zhuǎn)接于YPB 液體培養(yǎng)基中，于180 r/min、25 ℃條件下?lián)u培7 d，用滅菌的擦鏡紙過濾，顯微鏡檢測(cè)孢子濃度并稀釋至5×107個(gè)/mL 備用。采用載玻片上涂布培養(yǎng)基的方法培養(yǎng)小麥白粉菌分生孢子，測(cè)定拮抗酵母菌發(fā)酵液對(duì)小麥白粉菌分生孢子萌發(fā)的影響。具體步驟如下：制作0.5%水瓊脂培養(yǎng)基，用移液器取450 μL未冷凝的0.5%水瓊脂和等體積的拮抗酵母菌發(fā)酵液在2 mL 離心管中混勻，均勻涂于載玻片上，設(shè)置孢子濃度為5×106、5×107個(gè)/mL 的拮抗酵母菌發(fā)酵液和CK（水瓊脂培養(yǎng)基）3種處理，每處理重復(fù)3次。將新鮮的小麥白粉菌分生孢子均勻抖落在冷凝好的培養(yǎng)基上，之后將載玻片置于吸水紙保濕的塑料盒中，18 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)24 h，用普通光學(xué)顯微鏡觀察并記錄小麥白粉菌分生孢子的萌發(fā)情況，計(jì)算拮抗酵母菌發(fā)酵液對(duì)小麥白粉菌分生孢子的萌發(fā)抑制率。

孢子萌發(fā)抑制率=（對(duì)照萌發(fā)率-處理萌發(fā)率）/對(duì)照萌發(fā)率×100%。

1.4 拮抗酵母菌對(duì)小麥白粉病的盆栽防治試驗(yàn)

室內(nèi)種植小麥盆苗，于兩葉一心期采用抖落孢子法接種小麥白粉菌并置于光照培養(yǎng)箱中18 ℃條件下培養(yǎng)。待6～7 d 顯癥時(shí)，將孢子濃度為5×106、5×107個(gè)/mL 的拮抗酵母菌發(fā)酵液噴施于發(fā)病小麥葉片上，以清水作對(duì)照，7 d 后進(jìn)行第2 次噴施。14 d 后調(diào)查不同處理盆苗中每株麥苗上部2 個(gè)發(fā)病嚴(yán)重葉片的發(fā)病情況，共調(diào)查3 個(gè)重復(fù)，每重復(fù)100片。記錄病級(jí)并計(jì)算病情指數(shù)及防效。病級(jí)鑒定標(biāo)準(zhǔn)按照盛寶欽等[16]提出的反應(yīng)級(jí)別進(jìn)行分級(jí)。

病情指數(shù)=∑（病級(jí)數(shù)×該級(jí)病葉數(shù)）/（調(diào)查葉數(shù)×最高病級(jí)數(shù)）×100；

防治效果=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100%。

1.5 拮抗酵母菌對(duì)小麥白粉病的田間防治試驗(yàn)

田間種植感病小麥品種津豐1 號(hào)，苗期在其周邊栽種小麥白粉病顯癥麥苗。正常田間管理同，小麥整個(gè)生長(zhǎng)期不噴施殺菌劑。孕穗至抽穗期，當(dāng)感病品種充分發(fā)病時(shí)，在孢子濃度為5×107個(gè)/mL 的酵母菌發(fā)酵液中加入0.1% 吐溫80 作為分散劑，噴施于發(fā)病小麥上，以噴施清水作對(duì)照，每處理1 m2，重復(fù)3 次。藥后10 d 進(jìn)行病害調(diào)查，每個(gè)重復(fù)5 點(diǎn)取樣，每點(diǎn)選取30 株。按照GB/T 17980.22—2000《農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則（一）殺菌劑防治禾谷類白粉病》的方法進(jìn)行病級(jí)調(diào)查并計(jì)算病情指數(shù)及防效。

1.6 小麥病程相關(guān)蛋白基因表達(dá)的定量分析

采集1.4 中不同處理的小麥葉片，分別提取RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA第一鏈，10倍稀釋后于-20 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)小麥的病程相關(guān)蛋白PR1（抗菌蛋白）、PR2（β-1，3-葡聚糖酶）、PR5（類甜蛋白）和TaPAL（苯丙氨酸解氨酶）的基因序列信息合成引物[17-18]，以小麥組成型表達(dá)基因18SrRNA（Accession No.AY049040）作為內(nèi)參，引物序列見表1。熒光定量反應(yīng)在伯樂CFX Connect 定量PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系：2×SYBR Premix ExTaq10 μL，上、下游引物（濃度為10 μmol/L）各1 μL，cDNA 模板5 μL，ddH2O 補(bǔ) 足 至20 μL。反 應(yīng) 程 序：95 ℃30 s；95 ℃5 s，55 ℃退火34 s，72 ℃35 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熒光值變化曲線和熔解曲線分析。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)，采用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[19]。

表1 本研究所用引物Tab.1 Primers in this study

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Excel 2010 和SPSS 18.0 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，利用鄧肯氏（Duncan’s）新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗微生物的分離純化與鑒定

從異常生長(zhǎng)的白粉菌孢子堆上獲得一株真菌分離物，命名為17wy1，其菌落特征為乳白色或奶油色，光滑無(wú)皺褶，呈凸起狀，表面濕潤(rùn)且具有光澤，邊緣整齊；能彈射孢子于培養(yǎng)皿蓋上并形成白色鏡像，在顯微鏡下可觀察到其投射的孢子為腎形或豆形，稱之為擲孢子（圖1a、1b）。將固體和液體培養(yǎng)物在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，可見其孢子為橢圓形，大小不等，同時(shí)具有明顯的出芽生殖特征（圖1c、1d）。

圖1 拮抗微生物17wy1的菌落及顯微形態(tài)Fig.1 Morphology and micromorphology of antagonistic microorganism 17wy1

分離物17wy1 的26S rDNA D1/D2 區(qū)序列GenBank 登錄號(hào)為ON479429.1，運(yùn)用在線BLAST 軟件進(jìn)行比對(duì)分析后選取同源序列，通過MEGA 7.0軟件中的鄰接法（Neighboor-joining，NJ）計(jì)算進(jìn)化距離，構(gòu)建17wy1 與其他15 個(gè)擲孢酵母菌的遺傳進(jìn)化樹。結(jié)果（圖2）顯示，菌株17wy1 位于一個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化小分支上，與來自腥擲孢酵母菌的5 個(gè)菌株（Golubevia pallescensCBS 369.85、Tilletiopsis pallescensM115、Golubevia pallescensGYDJ-G、GolubeviapallescensCBS 606.83、Tilletiopsis pallescensCBS 438.90）位于同一個(gè)大的進(jìn)化分支，且序列相似性達(dá)95%以上，進(jìn)化關(guān)系較近；與其他9個(gè)酵母菌位于不同進(jìn)化分支上，進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。可見，17wy1是一種腥擲孢酵母菌（Golubevia albescens），且不同于目前已經(jīng)報(bào)道的Golubevia pallescens，是一個(gè)新菌株。

圖2 腥擲孢酵母菌17wy1 26S rDNA D1/D2區(qū)的同源進(jìn)化分析Fig.2 Homology evolution analysis of 26S rDNA D1/D2 sequence of Golubevia albescens 17wy1

形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明，該菌為一種新的腥擲孢酵母菌。將菌株郵寄至中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行保藏，保藏號(hào)為CGMCC No：14148。

2.2 腥擲孢酵母菌17wy1對(duì)小麥白粉菌分生孢子萌發(fā)的抑制效果

由表2 和圖3 可見，小麥白粉菌分生孢子在水瓊脂培養(yǎng)基上的萌發(fā)率為93.4%；酵母菌發(fā)酵液處理后多數(shù)分生孢子萌發(fā)受到抑制，其中5×106個(gè)/mL酵母菌發(fā)酵液處理的孢子萌發(fā)率為30.1%，萌發(fā)抑制率為67.8%；5×107個(gè)/mL 酵母菌發(fā)酵液處理的孢子萌發(fā)率為13.9%，萌發(fā)抑制率為85.1%。

表2 腥擲孢酵母菌17wy1發(fā)酵液處理對(duì)小麥白粉菌孢子萌發(fā)抑制率Tab.2 Inhibition rate for conidium germination of Bgt treated with yeast 17wy1 fermentation broth

2.3 腥擲孢酵母菌17wy1對(duì)小麥白粉病的盆栽防治效果

室內(nèi)盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，盆苗對(duì)照上小麥白粉菌生長(zhǎng)旺盛，且隨著病害加重麥苗逐漸枯萎死亡；噴施酵母菌發(fā)酵液的白粉菌生長(zhǎng)被抑制，分生孢子堆明顯消減，麥苗恢復(fù)生長(zhǎng)（圖4）。調(diào)查計(jì)算病情指數(shù)和防效，正常發(fā)病對(duì)照的病情指數(shù)為99.7，5×106個(gè)/mL 酵母菌發(fā)酵液處理的病情指數(shù)為57.4，防效為42.4%；5×107個(gè)/mL 酵母菌發(fā)酵液處理的病情指數(shù)為41.3，防效為58.5%。

圖4 腥擲孢酵母菌17wy1對(duì)盆栽小麥白粉病的防治效果Fig.4 Control effect of yeast 17wy1 on wheat powdery mildew in pot

2.4 腥擲孢酵母菌17wy1對(duì)小麥白粉病的田間防治效果

由圖5 可見，對(duì)照小麥葉片及葉鞘上白粉菌菌絲層較厚，形成連片病斑；噴施17wy1發(fā)酵液后白粉菌分生孢子數(shù)量明顯減少，僅在小麥葉鞘邊緣有少量稀薄的菌絲。田間正常發(fā)病植株病情指數(shù)高達(dá)88.33，噴施17wy1 發(fā)酵液的小麥植株病情指數(shù)僅為26.67，防效為69.8%。

圖5 腥擲孢酵母菌17wy1對(duì)田間小麥白粉病的防治效果Fig.5 Control effect of yeast 17wy1 on wheat powdery mildew in field

2.5 小麥病程相關(guān)蛋白基因表達(dá)分析

小 麥 病 程 相 關(guān) 蛋 白 基 因PR1、PR2、PR5 和TaPAL的定量表達(dá)分析結(jié)果見圖6，其中基因PR1、PR5在接種小麥白粉菌的小麥葉片中相對(duì)表達(dá)量均為0.99，17wy1 發(fā)酵液處理的接種葉片中相對(duì)表達(dá)量為543.10、30.61，表達(dá)量顯著增強(qiáng)；基因PR2在接種小麥白粉菌的葉片中相對(duì)表達(dá)量為1.00，17wy1發(fā)酵液處理葉片相對(duì)表達(dá)量為0.09，表達(dá)量顯著下降；基因TaPAL在接種白粉菌的葉片中相對(duì)表達(dá)量為0.99，用17wy1 發(fā)酵液處理后葉片中相對(duì)表達(dá)量為1.52。

圖6 接種白粉菌后不同處理小麥葉片中防御相關(guān)基因的定量分析Fig.6 Quantitative analysis of defense-related genes in wheat leaves with different treatments after Bgt inoculation

3 結(jié)論與討論

許多研究人員開展了小麥白粉病生防菌的篩選和鑒定等研究工作。伊艷杰等[20]從小麥莖葉組織中分離內(nèi)生真菌，篩選出多個(gè)對(duì)小麥白粉菌分生孢子萌發(fā)抑制效果較好的菌株，其中2 株對(duì)小麥離體葉段和活體盆栽苗白粉病的防效達(dá)80%以上。曹遠(yuǎn)銀等[21]從山西等5個(gè)?。ㄊ校┑?2份不同生態(tài)環(huán)境土樣中分離篩選出一株對(duì)小麥白粉病有良好防效的鏈孢擬諾卡氏菌株。張晶等[22]從不同省份的土樣中分離菌株，通過孢子萌發(fā)抑制試驗(yàn)和藥效試驗(yàn)篩選出對(duì)小麥白粉病防效較好的放線菌菌株。李玲等[23]獲得2 株對(duì)小麥白粉菌分生孢子萌發(fā)具有明顯抑制作用的木霉菌，抑制率分別為90.06% 和85.95%，對(duì)盆栽麥苗白粉病的防效分別達(dá)68.63%、66.67%。這些研究表明，生防菌株在室內(nèi)小麥白粉菌孢子萌發(fā)抑制試驗(yàn)、離體葉段和活體盆栽防治試驗(yàn)中對(duì)白粉菌有較好的拮抗效果。

RUSS 等[14]通過顯微鏡觀察到被重寄生的小麥白粉菌分生孢子上有酵母菌菌絲長(zhǎng)出，2 種酵母菌對(duì)白粉菌的寄生率分別為26%（菌株BC0812）和16.1%（菌株BC0850）。K?HL 等[13]篩選出對(duì)小麥白粉病有拮抗作用的腥擲孢酵母菌菌株BC0441 和BC0850，可使田間盆栽麥苗期葉片的白粉菌孢子量減少30%～62%。本研究從異常生長(zhǎng)的小麥白粉菌分生孢子上分離獲得一株腥擲孢酵母17wy1，其發(fā)酵液對(duì)分生孢子萌發(fā)抑制率達(dá)85.1%，對(duì)室內(nèi)盆栽麥苗白粉病的防效為58.5%，田間防效為69.8%。表明腥擲孢酵母菌對(duì)小麥白粉菌具有較好的拮抗作用。

RUSS等[14]根據(jù)轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果推測(cè)，腥擲孢酵母菌在與小麥白粉菌的互作過程中，可通過調(diào)節(jié)植物防御反應(yīng)、清除H2O2來控制對(duì)自身的損害、兼性重寄生和氮競(jìng)爭(zhēng)等作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)病原菌的控制和自身的生理調(diào)節(jié)。本研究中，顯癥盆苗在酵母菌處理后小麥病程相關(guān)基因PR1上調(diào)表達(dá)，與RUSS 等[14]的結(jié)論一致，由于PR1 是系統(tǒng)獲得抗性的標(biāo)志性蛋白質(zhì)，說明腥擲孢酵母菌17wy1 可通過介導(dǎo)小麥的獲得抗性途徑增強(qiáng)其對(duì)白粉病的抗性。PR2基因在本研究中呈下調(diào)表達(dá)，與RUSS 等[14]的結(jié)果不同，可能是由于小麥體內(nèi)β-1，3-葡聚糖酶種類較多而不同研究中獲得的基因種類不同。本研究中獲得的PR5基因上調(diào)表達(dá)，與RUSS 等[14]的研究結(jié)果相反，是否不同腥擲孢酵母菌株啟動(dòng)的植物防御途徑有差異，有待于進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。RUSS等[14]的研究結(jié)果表明，TaPAL基因在菌株BC0812處理的白粉菌接種葉片中被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，而在菌株BC0850 處理的接種葉片與對(duì)照葉片的表達(dá)量差異不明顯。本研究中TaPAL基因在17wy1 處理后上調(diào)表達(dá)，但處理前后的表達(dá)值變化較小，是否不同菌株誘導(dǎo)的PAL基因的表達(dá)情況不同，仍需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上，本研究獲得的腥擲孢酵母17wy1 對(duì)小麥白粉菌分生孢子的萌發(fā)有明顯抑制作用，對(duì)室內(nèi)盆苗和田間小麥白粉病具有較好的防治效果，其通過增強(qiáng)小麥體內(nèi)抗病相關(guān)基因的表達(dá)提高小麥的抗病性，在小麥白粉病的防治中具有潛在應(yīng)用價(jià)值，可進(jìn)一步開發(fā)和利用。