半夏輪作土壤叢枝菌根真菌多樣性與環(huán)境因子相關(guān)性研究

張翔宇 陳曉芳 柳敏 成忠均 李恒謙 查欽

摘要： 解析不同輪作年限半夏土壤叢枝菌根真菌群落多樣性與環(huán)境因子的相關(guān)性，為利用土壤環(huán)境因子調(diào)控AMF組成與豐度，提高半夏栽培效益提供參考。采用不同年限輪作半夏種植土壤為材料，通過高通量測序和生物信息學(xué)分析土壤叢枝菌根真菌群落多樣性，并結(jié)合環(huán)境因子進行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，AMF的多樣性和豐度均隨著輪作時間的延長而增加，5個樣地的15個土壤樣品中共注釋到了12個科、14個屬、63個種的AMF類群，球囊霉屬（Glomus）、近明球囊霉屬（Claroideoglomus）為優(yōu)勢類群，占總序列數(shù)的91.65%；在優(yōu)勢菌群中，球囊霉屬的相對豐度與ACP活性極顯著負相關(guān)，與TK含量顯著負相關(guān)，近明囊霉屬的相對豐度與OM含量顯著負相關(guān)，與TK含量、CAT活性、PPO活性顯著或極顯著正相關(guān)；非優(yōu)勢菌群中，未分類的球囊霉門的相對豐度與URE活性極顯著正相關(guān)，與pH值極顯著負相關(guān)，多孢囊霉屬（Diversispora） 的相對豐度與pH值極顯著正相關(guān)，與AN含量極顯著負相關(guān)；不同菌群與土壤理化性質(zhì)和酶活性的關(guān)聯(lián)性差異較大，不同輪作年限土壤環(huán)境因子對半夏土壤中AMF群落組成和多樣性影響較大。

關(guān)鍵詞： 半夏；輪作；叢枝根真菌；環(huán)境因子；多樣性；相關(guān)性

中圖分類號：S567.23+9.01；S182 ?文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）02-0213-08

中藥材半夏［Pinellia ternate（Thunb.）Breit.］具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)的功效［1］。半夏在我國為廣泛分布種，自然居群不徑相同。產(chǎn)地沿革考證其產(chǎn)區(qū)有陜西、山東、江蘇、湖北等地［2］。如今我國半夏種植主產(chǎn)區(qū)為甘肅、河北、貴州、湖北等省，貴州赫章是主要半夏種植產(chǎn)區(qū)之一［3］，所產(chǎn)半夏個大粒圓、色白粉足［4-5］。

植物和土壤微生物之間的相互作用是連接生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵［6］。土壤微生物量是土壤活性的重要標志［7］。植物為土壤微生物提供一定的營養(yǎng)，促進兩者協(xié)同進化。土壤微生物可分解有機物并被植物吸收［6］。土壤微生物重要組成部分叢枝菌根真菌（以下簡稱“AMF”）廣泛分布于農(nóng)田、森林等土壤環(huán)境［8］。國內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的AMF虛擬種有145個， 隸屬于8科12屬［9］，包括糧食作物、蔬菜和中藥材等90%以上陸地維管植物可與AMF形成菌根結(jié)構(gòu)［10］。

AMF與植物根系形成互惠的根系系統(tǒng)［11］，增強植物營養(yǎng)和礦質(zhì)吸收，提高光合速率和生物量［12］。其形成的菌絲網(wǎng)可增加病原菌侵染根系難度［13］，AMF可與病原菌競爭生態(tài)位抑制其繁殖從而防控土傳病害。AMF能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防御酶類，這些酶類是植物抗病性的重要指標［14-15］。免耕能促進AMF生長和提高土壤堿性磷酸酶活性，持續(xù)免耕4年的土壤AMF群落結(jié)構(gòu)沒有退化［16］，提高大粒徑團聚體中AMF種群豐度可促進土壤團聚［17］，AMF增殖和活性的提高可增強抑病能力［18］。單一作物輪作會抑制根際AMF活性和數(shù)量［19］，而采用間作方式能夠有效提高土壤中AMF的豐富度和多樣性，促進AMF的侵染和菌根的形成［20］。

半夏的相關(guān)研究主要集中在栽培技術(shù)、病蟲害防治、輪作障礙因子等，有關(guān)半夏種植土壤AMF多樣性的研究雖有［21-24］，但對采用不同作物輪作土壤AMF多樣性與土壤環(huán)境因子的相關(guān)性研究卻鮮見報道。本研究通過高通量測序，對赫章半夏道地產(chǎn)區(qū)輪作樣地土壤AMF的群落組成及多樣性進行分析，并進一步探究不同輪作土壤AMF組成與土壤環(huán)境因子的關(guān)系，以期為土壤環(huán)境因子調(diào)控AMF提高半夏栽培效益提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用半夏種子采用貴州省赫章縣本地選育優(yōu)勢品種赫麻芋1號（貴州省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳認證品種），挑選直徑為1.0～1.5 cm的健康半夏種子用 2 000 倍石灰水浸泡5 h進行消毒處理后漂洗3次，用62.5 g/L精甲·咯菌腈懸浮種衣劑拌種晾干備用。

1.2 試驗地概況

田間試驗設(shè)在貴州省畢節(jié)市赫章縣雙坪鄉(xiāng)貴州山地高效農(nóng)業(yè)公司半夏種植區(qū)域，選擇土層深厚肥沃、排灌良好的沙質(zhì)土壤為試驗基地，劃分不同小區(qū)連續(xù)栽種半夏與不同蔬菜，形成不同輪作茬數(shù)的處理樣地。

1.3 土壤樣本采集

于貴州省赫章縣雙坪鎮(zhèn)赫章縣山地高效農(nóng)業(yè)科技有限公司半夏種植基地內(nèi)，按照隨機取樣方法，采集未種植（CK）、半夏—蔬菜（白菜）輪作1年（LZ1）、半夏—蔬菜（甘藍）輪作2年（LZ2）、半夏—蔬菜（蘿卜）輪作3年（LZ3）、半夏—蔬菜（玉米）輪作4年（LZ4）的不同樣地半夏根際土壤，每個樣地按照隨機取樣法取5份后混合為1個樣，每組3個生物學(xué)重復(fù)，采集的土壤過20目篩后一部分置于-80 ℃下保存，用于土壤微生物DNA提取測序；另一部分室內(nèi)自然風(fēng)干后用于土壤理化性質(zhì)測定。

1.4 理化指標及酶活性測定

對不同樣本土壤理化性質(zhì)和酶活性測定具體方法如下：土壤樣品經(jīng)硫酸-加速劑消解后用凱氏法測定全氮（TN）含量；經(jīng)NaOH堿熔后用鉬銻抗分光光度法測定全磷（TP）含量、用火焰光度計法測定全鉀（TK）含量；用玻璃電極法測定pH值；用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測定有機質(zhì)（OM）含量；用堿解擴散法測定堿解氮（AN）含量；用B-0.05 mol/L HCl-0.025 mol/L H2SO4（1/2 H2SO4） 法測定有效磷（OP）含量；用乙酸銨浸提-火焰光度計測定速效鉀（AK）含量； 用高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶（CAT）活性；用試劑盒測定脲酶（URE）、蔗糖酶（SC）、 酸性磷酸酶（ACP）、多酚氧化酶（PPO）活性。以上指標測定委托南京卡文思檢測技術(shù)有限公司負責(zé)。

1.5 DNA提取、擴增和高通量測序

根據(jù) FastDNASpin Kit for Soil說明書進行土壤微生物群落總基因組 DNA 抽提。以提取的 DNA 為模板進行Nest-PCR 擴增，一輪引物為AML1F（5′-ATCAACTTTCGATGGT AGGATAGA-3′） 和AML2R（5′-GAACCCAAACACTTTGGTTTCC- 3′）；二輪引物為AMV 4-5NF（5′- A A G C T C G T A G T T G A A T T T C G -3′）和AMDGR（5′- C C C A A C T A T C C C T A T T A A T C A T -3′）。PCR反應(yīng)每個樣本3次重復(fù)。將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后回收，利用Illumina公司的MiSeq PE300平臺進行測序。以上相關(guān)流程均委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

以97%相似度的 OTU為分類學(xué)水平，將所有樣本序列按最小樣本序列數(shù)進行抽平，利用 Mothur 計算α多樣性指數(shù)，并采用Wilxocon秩和檢驗進行α多樣性的組間差異分析；基于bray-curtis距離算法檢驗樣本間微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性；通過R（version 3.3.1）、pheatmap package軟件計算環(huán)境因子與物種之間的相關(guān)性系數(shù)（Spearman等級相關(guān)系數(shù)）數(shù)值矩陣獲得Heatmap圖；用Network軟件進行雙因素相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析（相關(guān)系數(shù)類型：Spearman；相關(guān)系數(shù)絕對值≥0.5）；采用Excel 2017 軟件數(shù)據(jù)處理；使用 SPSS 22.0 進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)及酶活性分析

對5個采樣地半夏根際土壤基本理化性質(zhì)和酶活性8項指標進行檢測（表1），不同樣地土壤理化性質(zhì)及酶活性存在一定的顯著性或極顯著性差異。TN、TP、AN、ACP含量隨輪作時間的延長呈波浪式降低；TK含量隨輪作時間延長而增加；AK、CAT、URE、SC、PPO活性隨輪作的延長而先增后降；pH值在CK、LZ1、LZ2土壤呈強酸性，在LZ3呈弱堿性，在LZ4呈弱酸性。

2.2 土壤AMF高通量測序結(jié)果及多樣性分析

序列經(jīng)抽平后，采用反映物種豐富度的Shannon指數(shù)繪制稀釋曲線，隨著樣品測序深度的增加，15個樣品的OTU稀釋曲線趨于平緩（圖1），表明其測序深度足夠，而且各樣品測序覆蓋度均在99.95%以上，說明本次檢測的結(jié)果能夠客觀地代表樣本中AMF的多樣性。

所有樣本共聚類到155個OTU，圖2韋恩圖為樣本間獨有、共有OTU數(shù)量， ?下方柱狀圖為每一樣本OTU總數(shù)。在輪作年限中，OTU數(shù)量上表現(xiàn)為LZ4> LZ3>LZ2>LZ1，輪作越長土壤中AMF的OTU種類越多，輪作4年AMF的OTU達90種（圖2）。

對不同樣地的α多樣性指數(shù)分析（表2）表明：LZ4的AMF群落多樣性和豐富度均為最高，其次為CK，而輪作一年LZ1為最低。 反映土壤AMF豐富度的ACE 和 Chao 指數(shù)分別在（27.501 7±9.118 3）～ （70.624 8±3.566 6）和（18.666 7±3.055 1）～（68.566 7±3.156 5） 之間，反映AMF群落多樣性的 Shannon指數(shù)在（1.337 5±0.404 3）～（3.055 2± 0.103 5）之間，其中，LZ4樣地半夏根際土壤AMF多樣性最豐富，Shannon 指數(shù)和Chao指數(shù)分別為3.055 2±0.103 5和68.566 7±3.156 5。與之相反，LZ1樣地AMF多樣性最低，Shannon指 數(shù)、Chao指數(shù)分別為1.337 5±0.404 3和18.666 7± 3.055 1。 反映土壤AMF優(yōu)勢度的 Simpson 指數(shù)在（0.074 7± 0.006 1）～（0.346 3±0.169 5）之間，LZ1樣地的AMF優(yōu)勢度最高，輪作土壤中AMF群落的優(yōu)勢度均高于對照組（CK）。

由樣本土壤AMF群落組間差異檢驗（圖3）可知，不同組間存在一定顯著性差異。其中CK與LZ1、LZ2、LZ3之間有極顯著差異（P<0.01），CK與LZ4之間無顯著差異；LZ1與LZ2之間有顯著差異（P<0.05），與LZ3、LZ4之間有極顯著差異（P<0.01）；LZ2與LZ3之間無顯著差異，與LZ4有極顯著差異（P<0.01）；LZ3與LZ4之間有極顯著差異（P<0.01）。以上表明，輪作時間越長土壤中AMF越趨于穩(wěn)定，與未種植（CK）基本接近，但由于種植半夏與蔬菜的輪作，從而導(dǎo)致土壤中AMF比未種植過半夏的土壤更豐富；半夏土壤AMF的多樣性和豐度均隨著輪作時間的延長而增加。

2.3 土壤AMF組成及豐度分析

在科的水平，15個樣品中共注釋到了12個科的AMF類群，將物種豐度占比小于0.01的歸入其他（others）（圖4），球囊霉科（Glomeraceae）、近明球囊霉科（Claroideoglomeraceae）在5個樣地中均有，為主要的優(yōu)勢類群，豐度總占比達91.65%，其中球囊霉科占比63.06%；球囊霉科在CK、LZ1、LZ3中為絕對優(yōu)勢類群，球囊霉科和近明球囊霉科在LZ2、LZ4中的豐度基本接近；而類球囊霉科（Paraglomeraceae）在CK、LZ1、LZ2、LZ4中占有一定的比例，在LZ3土壤樣品中未被檢出。在屬的水平，15 個樣品中共注釋到了14個屬的AMF菌類群（圖5），球囊霉屬（Glomus）、近明球囊霉屬（Claroideoglomus）為主要的優(yōu)勢類群，占總序列數(shù)的91.65%，其中球囊霉屬占比達63.06%，2個優(yōu)勢屬在各樣本中的分布規(guī)律與科水平一致。在種的水平，15個樣品中共注釋到了63個種（圖6），遺憾的是AMF在種水平很多未被具體分類，說明AMF在種水平的研究還有較大的空間。

2.4 土壤AMF群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境因子相關(guān)性分析

對豐度排名Top10的AMF科與環(huán)境因子進行相關(guān)性聚類熱圖分析。結(jié)果（圖7）表明，無梗囊霉屬（Acaulospora）、巨孢囊霉屬（Gigaspora）的相對豐度與OM含量顯著正相關(guān)，與TP含量、OP含量、PPO活性極顯著負相關(guān)（P<0.01）；球囊菌門（Glomeromycota）未分類屬的相對豐度與OM含量顯著正相關(guān)，與TN含量、AN含量、URE活性極顯著正相關(guān)，與pH值（P<0.001）、OP含量（P<0.01）極顯著負相關(guān)，與PPO活性顯著負相關(guān)；盾巨孢囊霉屬（Scutellospora）、原囊霉屬（Archaeospora）的相對豐度與URE活性顯著正相關(guān)，與pH值、OP含量顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）負相關(guān)；近明囊霉屬的相對豐度與OM含量顯著負相關(guān)，與TK含量、CAT活性、PPO活性顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）正相關(guān)；類球囊霉屬（Paraglomus）、球囊霉目（Glomerales）的未分類屬的相對豐度與AK含量、SC活性顯著（P<0.05）或極顯著（P≤0.01）負相關(guān)；球囊霉目（Glomerales）未分類屬的相對豐度與OP含量顯著正相關(guān)；球囊霉屬的相對豐度與ACP活性極顯著負相關(guān)，與TK含量顯著負相關(guān)；多孢囊霉屬（Diversispora）的相對豐度與ACP活性、OM含量、TN含量、AN含量、URE活性顯著或極顯著負相關(guān)，與pH值、OP含量、CAT活性、PPO活性顯著或極顯著正相關(guān)。

對AMF屬水平群落與環(huán)境因子進行雙因素Network網(wǎng)絡(luò)分析。結(jié)果（圖8）表明，未分類的球囊霉門的相對豐度與URE極顯著正相關(guān)，與pH值極顯著負相關(guān)；多孢囊霉屬的相對豐度與pH值極顯著正相關(guān)，與AN極顯著負相關(guān)。以上結(jié)果與聚類熱圖（圖7）相互印證。AMF群落與環(huán)境因子的連線為：多孢囊霉屬為9條、未分類的球囊霉門為6條、巨孢囊霉屬為4條、無梗囊霉屬為4條、近明球囊霉屬為4條、雙型囊霉屬（Ambispora）為4條、原囊霉屬為3條、盾巨孢囊霉屬（Scutellospora）為3條，與環(huán)境因子的連線越多，表明該群落與環(huán)境因子的關(guān)系越密切，受影響因素越多。綜上所述，對AMF菌群的生長調(diào)節(jié)需要考慮多因素環(huán)境因子的相互關(guān)系，這為采用施肥調(diào)整土壤結(jié)構(gòu)從而有目的增加某屬AMF菌群的豐度具有指導(dǎo)意義。

3 討論與結(jié)論

土壤pH值、OM含量、TN含量、TP含量、 TK含量等能直觀反映土壤肥力，對植物和微生物的生長具有重要影響。安艷發(fā)現(xiàn)，半夏連作根際土壤中TN、 TP、 OP、OM含量和CAT、URE活性等降低，AK含量、PPO活性升高［25］。杭燁等發(fā)現(xiàn)，單作半夏土壤細菌數(shù)量和放線菌數(shù)量低于其余6種間作組合，間作可以提高土壤綜合肥力［26］。王禮科等發(fā)現(xiàn)，隨半夏連作年限增加，AK、OP含量下降［27］。本研究結(jié)果與上述既相似又有所不同，即均為TN含量、TP含量、OM含量、URE活性下降，但AK含量、OP含量、CAT活性結(jié)果不同，其原因可能是不同栽培模式導(dǎo)致土壤環(huán)境因子發(fā)生規(guī)律不一致，本研究連續(xù)輪作與連作的區(qū)別在于在半夏采收過后種植一茬蔬菜，從而改變了土壤理化性質(zhì)的變化規(guī)律。本研究結(jié)果表明，輪作情況下半夏根際土壤TN含量、TP含量、AK含量、AN含量、URE活性、SC活性、ACP活性、OM含量隨著輪作時間的延長最終降低；TK含量、OP含量、CAT活性、PPO活性隨著輪作時間的延長而增加。

唐成林等發(fā)現(xiàn)，種植半夏后土壤中微生物數(shù)量增加［28］。施曉峰等發(fā)現(xiàn)，大量的 AMF 孢子存在于半夏根際土中，經(jīng)鑒定得到20種3屬，其中球囊霉屬16種（80.0%），無梗囊霉屬3種（15.0%），盾巨孢囊霉屬1種（5.0%）［24］。何志貴發(fā)現(xiàn)，不同種植方式土壤真菌群落結(jié)構(gòu)各自聚類，與種植時限無明顯關(guān)系。種植方式的變換可顯著抑制病原真菌而提升有益真菌豐度［29］。劉詩蓉等發(fā)現(xiàn)，隨著半夏連茬次數(shù)的增加，根際土有益微生物豐度減少、有害微生物豐度增加，多樣性降低，并認為這是連作障礙形成的重要原因［30］。本研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)輪作情況下土壤AMF的種類和豐度均上升，Shannon指數(shù)從LZ1的（1.337 5±0.404 3）上升LZ4的（3.055 2±0.103 5），說明隨著輪作時間的延長，種植半夏土壤中AMF群落多樣性越高；球囊霉科、近明球囊霉科為主要的優(yōu)勢菌群，不管是在科水平還是屬水平的，所占總序列數(shù)比例均為91.65%。

本研究中無梗囊霉屬、巨孢囊霉屬、球囊菌門未分類屬、盾巨孢囊霉屬、原囊霉屬等的相對豐度與土壤有效磷之間呈現(xiàn)顯著或極顯著負相關(guān)性，說明隨著土壤有效磷含量的增加，以上AMF菌群的物種豐度下降，這與Tawaraya等的研究結(jié)果類似，即較低的OP會促進 AMF的生長［31］。張海波等發(fā)現(xiàn)，在偏堿性石灰土中的AMF多樣性高于偏酸性黃壤［32］。本研究LZ3的土壤pH值偏堿性，其土壤中AMF多樣性高于偏酸性的LZ1、LZ2，但又低于偏酸性的LZ4，說明偏堿性的土壤中AMF多樣性要高于偏酸性土壤并不絕對，還與耕作模式、種植年限等相關(guān)。Liang等發(fā)現(xiàn)，喀斯特地區(qū)AMF多樣性與土壤pH值呈負相關(guān)，本研究中雖然部分AMF群落與pH值呈現(xiàn)負相關(guān)性，但多孢囊霉屬卻與pH值呈極顯著正相關(guān)，說明該屬的生長更偏向于堿性土壤［33］。在pH值為 5～9的喀斯特地區(qū)，土壤堿性與球囊霉屬比例正相關(guān)，該屬可能處于更重要的生態(tài)位［34］。本研究中球囊霉屬為主要優(yōu)勢菌群，近明球囊霉屬次之，這與上述研究結(jié)果類似。

土壤微生物和土壤酶共同參與土壤的生物生化過程，土壤酶活性反映其生化反應(yīng)過程的方向和強度［35-39］。AMF能夠增強寄主植物根系中相關(guān)酶活提高抗鹽能力［40］。菌根能改善土壤OM含量、團粒結(jié)構(gòu)和透氣性［41］，增強脲酶、蔗糖酶等酶活性而減緩輪作危害［42-43］。AMF通過調(diào)節(jié)植物根系分泌物降解酚酸類物質(zhì)［44］。AMF能與土壤其他有益微生物協(xié)同作用增強植株抵御能力，其誘發(fā)的防御反應(yīng)可提高植物對病原菌抗性，促進養(yǎng)分、水分的吸收，改善輪作土壤生境狀況，緩解輪作障礙的危害［44］。近明球囊霉、根內(nèi)球囊霉、摩西斗管囊霉等能夠促進宿主對營養(yǎng)元素的吸收和促進植物生長和生物量積累，根內(nèi)根孢囊霉在高溫脅迫下顯著提高蒼術(shù)根莖鮮質(zhì)量、含水量、根干質(zhì)量、地下總干質(zhì)量、揮發(fā)油組分數(shù)，根內(nèi)根孢囊霉在鹽脅迫下可以增加羅勒對鉀的吸收、降低對鈉和氯化物的吸收［45-46］。本研究的土壤酶活性與樣本AMF群落相關(guān)性表明，AMF群落與過氧化氫酶、脲酶、多酚氧化酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶活性之間具有一定的相關(guān)性。而不同AMF與土壤酶活性之間的相關(guān)性有較大區(qū)別，如無梗囊霉屬、巨孢囊霉屬與PPO活性極顯著負相關(guān)；球囊菌門的未分類屬與URE活性極顯著正相關(guān)，與PPO活性顯著負相關(guān)；盾巨孢囊霉屬、原囊霉屬與URE顯著正相關(guān)；近明囊霉屬與CAT、PPO活性顯著或極顯著正相關(guān)；類球囊霉屬、球囊霉目的未分類屬與SC活性顯著負相關(guān)；球囊霉屬與ACP活性極顯著負相關(guān)；多孢囊霉屬與ACP、URE活性顯著或極顯著負相關(guān)，與CAT、PPO活性顯著或極顯著正相關(guān)。

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收 稿日期：2023-02-08

基金項目：國家科技支撐計劃（編號：2015BAI05B03）；貴州省人才基地項目（編號：RCJD2020-21）；貴州省高層次創(chuàng)新型人才項目（編號：畢科人才合字［2021］05號）；畢節(jié)市揭榜掛帥項目（編號：畢科合重大專項字［2021］3號）；畢節(jié)市科技局聯(lián)合基金項目（編號：畢科聯(lián)合字yz［2021］5號）。

作者簡介：張翔宇（1986—），男，貴州道真人，碩士，副研究員，研究方向為藥用植物資源工程。E-mail：304626335@qq.com。

通信作者：陳曉芳，碩士，副教授，研究方向為特色資源分子生物學(xué)，E-mail：672409415@qq.com；查 欽，碩士，副研究員，研究方向為藥用植物資源開發(fā)與利用，E-mail：914282286@qq.com。