黑白中藥通過調(diào)節(jié)MC1R和RTKs的表達(dá)對(duì)黑色素代謝的影響研究

楊波濤 賈桂云 陳鯤 吳躍文 楊柳 查旭山

[摘要]目的：探討首烏、女貞子等七味黑色中藥和白及、白芷等七味白色中藥對(duì)豚鼠皮膚組織黑色素合成中黑皮質(zhì)素1受體（Melanocortin 1 receptor，MC1R）、受體酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinase，RTKs）表達(dá)的影響。方法：采用水提法獲得中藥提取物，用灌胃的方法以14 d為周期等量灌胃豚鼠獲得背部皮膚組織，采用免疫組化及免疫熒光法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)和對(duì)照組MC1R、RTKs蛋白的表達(dá)，用Image J軟件統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，比較不同中藥環(huán)境對(duì)豚鼠皮膚組織的黑色素合成的影響，分析MC1R、RTKs蛋白與黑素細(xì)胞代謝三者的變化關(guān)系。結(jié)果：對(duì)MC1R蛋白有抑制作用的白藥有白芷、白茯苓、白蘞、白及、白僵蠶、白術(shù)，其中白芷、白僵蠶、白術(shù)的作用最為明顯，對(duì)MC1R有明顯抑制作用的黑藥有烏梅、黑芝麻、丹參、雞血藤，其中丹參的抑制作用最為明顯。該結(jié)果顯示上述10味中藥對(duì)黑色素合成有抑制作用，其中白芷、白僵蠶、白術(shù)、丹參的抑制作用最為明顯。其中對(duì)于RTKs蛋白有抑制作用的白藥有白芷、白茯苓、白蘞、白及、白僵蠶，其中白茯苓、白蘞、白及的作用最為明顯，具有明顯作用的黑藥有黑芝麻、丹參，其中丹參的作用最為明顯。結(jié)論：藥材顏色與藥效之間有一定關(guān)系；黑白中藥都對(duì)MC1R及RTKs蛋白有不同程度的抑制作用，色象中藥可能通過調(diào)節(jié)α-黑素細(xì)胞剌激素/黑皮素1受體（Alpha-melanocyte stimulating hormone/Melanocortin 1 receptor，α-MSH/M1CR）、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子/受體酪氨酸激酶（Stem cell growth factor/Receptor tyrosine kinase，SCF/RTKs）信號(hào)通路來影響黑素細(xì)胞代謝。

[關(guān)鍵詞]中藥色象理論；黑白中藥；黑素細(xì)胞；黑皮質(zhì)素1受體；受體酪氨酸激酶

[中圖分類號(hào)]R285? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2024）03-0012-05

Study on the Effect of Black and White Chinese Medicine on Melanin Metabolism by Regulating the Expression of MC1R and RTKs

YANG Botao1，2，JIA Guiyun3，CHEN Kun3，WU Yuewen2，YANG Liu4，ZHA Xushan1

（1.Department of Dermatology，the First Clinical Medical College of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405，Guangdong，China; 2.Department of Dermatology，Nanhai Hospital， Guangdong Provincial People's Hospital，F(xiàn)oshan 510251，Guangdong，China; 3.School of Life Sciences，Guangzhou University，Guangzhou 510006，Guangdong，China; 4.School of Traditional Chinese Medicine，Southern Medical University，Guangzhou 510515，Guangdong，China）

Abstract： Objective? To investigate the effects of seven black Chinese herbs， such as Polygonum multiflorum Thunb， and Ligustrum lucidum， and seven white Chinese herbs， such as Bletilla striata and Angelica dahurica， on the expression of melanocortin 1 receptor （MC1R） and receptor tyrosine kinase （RTKs） in melanin synthesis of guinea pig skin. Methods? The extract of traditional Chinese medicine was obtained by water extraction， and the skin tissue of the back of guinea pigs was obtained by gavage of the same amount in a 14 day cycle. The expression of MC1R protein and RTKs protein in the experimental and control groups were detected by immunohistochemistry and fluorescence methods. The results were statistically analyzed by Image J software. The effects of different traditional Chinese medicine environments on melanin synthesis in the skin tissue of guinea pigs were compared， and MC1R The relationship between RTKs protein and melanocyte metabolism. Results? The white herbs with inhibitory effect on MC1R protein are Angelica dahurica， Poria cocos， Ampelopsis japonica， Atractylodes macrocephala， atractylodes macrocephala， among which the effects of Angelica dahurica， Atractylodes macrocephala， Atractylodes macrocephala are the most obvious， and the black herbs with significant inhibitory effect on MC1R are Ophiopogon flexuosus， Nigella sativa， Dangshen， Chickweed， among which the inhibitory effect of Dangshen is the most obvious. This result showed that the above 10 herbs had inhibitory effects on melanin synthesis， among which the inhibitory effects of Angelica dahurica， Cortex alba， Atractylodes macrocephala， and Salvia miltiorrhiza were the most obvious. Among them， the white herbs with inhibitory effect on RTKs protein are Angelica dahurica， Poria cocos， Ampelopsis pilosulae， Bupleurum officinale and Bupleurum officinale， among which Poria cocos， Ampelopsis pilosulae and Bupleurum officinale have the most obvious effect， and the black herbs with obvious effect are Nigella sativa and Salvia miltiorrhiza， among which Salvia miltiorrhiza has the most obvious effect. Conclusion? There is a certain relationship between the color of medicinal materials and their efficacy. Both black and white drugs inhibit the action of MC1R and RTKs protein to varying degrees， and color image Chinese medicine may regulate α- MSH/M1CR and SCF/RTKs signal pathways affect melanocyte metabolism.

Key words： Color-effect phenomenon theory of traditional Chinese herbs; black and white Chinese herbs; melanocytes; melanocortin 1 receptor; receptor tyrosine kinase

中藥色象是表明中藥材顏色與療效相關(guān)的現(xiàn)象，該理論稱為色象理論，而基于該理論的中藥稱為色象中藥[1]，但中藥材本身的顏色與藥效之間是否存在特定的作用關(guān)系，機(jī)制尚未闡明。筆者團(tuán)隊(duì)從2007-2022年來一直致力于中藥色象理論基礎(chǔ)研究與臨床工作，最近通過觀察臨床常用治療白癜風(fēng)與黃褐斑色象中藥以及文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)分析篩選出最常用的色象中藥即黑色與白色中藥[2]各七味，提取物灌胃豚鼠后，采用免疫組化及熒光檢測(cè)并觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組黑素皮質(zhì)激素受體1（MC1R）蛋白、RTKs蛋白的表達(dá)量，分析不同中藥環(huán)境對(duì)豚鼠皮膚組織的黑色素合成影響的原因及其相互作用關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1? 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)成年豚鼠64只，體重約250克/只，均購(gòu)于廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2 主要試劑與材料：白芷、白附子、白茯苓、白蘞、白及、白僵蠶、白術(shù)、首烏、熟地、烏梅、女貞子、黑芝麻、丹參、雞血藤共14味中藥（均由香港奧美藥業(yè)股份有限公司提供）、免疫染色固定液、免疫染色洗滌液、RTKs Rabbit Monclonal Antibody、MC1R Rabbit Monclonal Antibody、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）、DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒（均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司）。電磁爐（購(gòu)于美的集團(tuán)股份有限公司）、離心機(jī)（Model E3116R，ESSENSCIEN U.S.A.）、粉碎機(jī)、載玻片（帆船）、冷凍切片機(jī)（Leica，Germany）、熒光倒置顯微鏡（Nikon，Japan），電子天平（ME203E/02，購(gòu)于梅特勒-托利多儀器上海有限公司）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 中藥的提?。ㄋ岱ǎ簩?4味黑白中藥分別稱取10 g，用粉碎機(jī)粉碎成粉末狀，分別加入蒸餾水300 ml，浸泡30 min，大火煎煮至沸騰，改用文火煎煮至黏稠。再加150 ml蒸餾水煎煮，重復(fù)上述操作兩次，室溫下靜置過夜，次日用4層紗布過濾，得濾液于離心管，5 000 r/min離心15 min，收集上清液后定容至50 ml，分裝后-20℃保存。

1.2.2 豚鼠給藥及皮膚組織獲取：將64只健康豚鼠（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理編號(hào)：KJ-2019-03-001）按照隨機(jī)分組的方式分為16組，每組4只，其中兩組為對(duì)照組，余下14組為實(shí)驗(yàn)組。相同條件下飼養(yǎng)1周后實(shí)驗(yàn)組每組每只每天灌胃喂養(yǎng)0.5 ml的中藥提取液，對(duì)照組以同樣的方法喂入等量的蒸餾水，連續(xù)喂藥14 d，每天盡量保證同一時(shí)間給藥。喂藥周期結(jié)束后，處死豚鼠，刮去背毛，取其背部約4 cm2的皮膚組織，用液氮迅速冷卻后置于離心管中做好標(biāo)記后在-80℃下儲(chǔ)存。

1.2.3 皮膚組織的免疫組化：使用德國(guó)Leica冷凍切片機(jī)將獲取的豚鼠皮膚組織切成10μm的薄片置于載玻片上，滴加免疫染色固定液覆蓋組織切片，固定10 min后用免疫染色洗滌液洗滌2～3次，5分鐘/次。吸去最后1次洗滌液后立即滴加BSA封閉液室溫封閉1.5 h，回收封閉液后立即滴加稀釋好的一抗[MC1R抗體或RTKs抗體（均按照1∶200的比例稀釋）]室溫孵育1.5 h?；厥找豢?，用洗滌液洗滌3次，6分鐘/次，吸去最后一次洗滌液后滴加稀釋好的二抗[辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（按照1∶200的比例稀釋）]室溫孵育1 h?；厥斩梗孟礈煲合礈?～5次，6分鐘/次（整個(gè)過程要避免切片干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景），加入配置好的DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒（A液∶B液=1∶1）染色10 min，用蒸餾水洗滌3次。將載玻片置于熒光倒置顯微鏡下觀察熒光，拍照記錄結(jié)果。

2? 結(jié)果

2.1 黑白中藥對(duì)MC1R蛋白表達(dá)的影響：結(jié)果顯示，對(duì)MC1R蛋白有抑制作用的白藥有白芷、白茯苓、白蘞、白及、白僵蠶、白術(shù)，其中白芷、白僵蠶、白術(shù)的作用最明顯，見圖1。黑藥中對(duì)MC1R有明顯抑制作用的中藥有烏梅、黑芝麻、丹參、雞血藤，其中丹參的抑制作用最為明顯，見圖2（結(jié)果圖片來源于廣州大學(xué)生命科學(xué)院）。黑白中藥對(duì)MC1R蛋白表達(dá)影響Image J軟件分析結(jié)果見圖3。

2.2 黑白中藥對(duì)RTKs蛋白的影響：結(jié)果顯示，對(duì)RTKs蛋白有抑制作用的白藥有白芷、白茯苓、白蘞、白及、白僵蠶，其中白茯苓、白蘞、白及的作用最為明顯，見圖4；具有明顯抑制作用的黑藥有黑芝麻、丹參，其中丹參的作用最為明顯，見圖5。黑白中藥對(duì)RTKs蛋白表達(dá)影響Image J軟件分析結(jié)果見圖6。

2.3 黑白中藥對(duì)豚鼠背部皮膚組織熒光強(qiáng)度與面積的影響分析：結(jié)果顯示，黑白中藥對(duì)豚鼠背部皮膚組織MC1R、RTKs熒光強(qiáng)度與面積的影響作用與熒光圖片、Image J軟件分析結(jié)果一致。見表1。

3? 討論

本研究選擇經(jīng)典的黑色素代謝研究方法（含中藥血清對(duì)體外干預(yù)蘑菇酪氨酸酶活性的方法、中藥血清干預(yù)體外培養(yǎng)人黑素細(xì)胞后其酪氨酸酶基因蛋白的表達(dá)、黑素合成量）來研究色象中藥對(duì)色素代謝的影響，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠。黑色素的產(chǎn)生與黑素細(xì)胞分化緊密相關(guān)，分化和色素沉著的產(chǎn)生以各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活為標(biāo)志，這些途徑主要導(dǎo)致誘導(dǎo)鄰苯二甲酸相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Mitf轉(zhuǎn)錄。Mitf反過來激活的黑色素合成相關(guān)基因如TYIP1，TYRP2，Tyr等基因的分化。研究表明[3-7]，有兩種主要途徑可控制Mitf的誘導(dǎo)：α-黑素細(xì)胞刺激素（α-MSH）/黑皮質(zhì)素1受體（MC1R）信號(hào)傳導(dǎo)途徑，以及干細(xì)胞因子（SCF）/RTKs受體酪氨酸激酶途徑。作為對(duì)紫外線輻射的急性生理反應(yīng)，角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生并分泌α-MSH（類似于促腎上腺皮質(zhì)激素，ACTH）可以與MC1R結(jié)合，從而在黑素細(xì)胞中啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)cAMP介導(dǎo)的信號(hào)級(jí)聯(lián)。活化蛋白反過來激酶A（PKA）磷酸化cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB），導(dǎo)致Mitf的轉(zhuǎn)錄激活，從而驅(qū)動(dòng)皮膚色素沉著。而RTKs受體（CD117）是由原癌基因RTKs編碼的具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，它是Ⅲ型受體酪氨酸激酶家族（RTK）的重要成員[8]，SCF/RTKs信號(hào)通路調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞的增殖和遷移[9-10]。以上都說明α-MSH/M1CR、SCF/RTKs兩種信號(hào)通路在黑素細(xì)胞代謝中起到關(guān)鍵作用。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)黑白色中藥均有不同程度抑制MC1R與RTKs（酪氨酸激酶受體）蛋白的作用，這與之前研究的基礎(chǔ)推論一致。黑色素增加與減少與MC1R與RTKs兩者關(guān)系緊密，呈現(xiàn)一定相關(guān)性。

本實(shí)驗(yàn)研究從中醫(yī)傳統(tǒng)治驗(yàn)與臨床皮膚病治療的實(shí)踐中最常應(yīng)用的治法“以黑治白，以白治黑”入手，選擇臨床常用于治療色素障礙性疾病的黑、白兩大類中藥各7種中藥作代表發(fā)現(xiàn)了藥材本身的顏色（黑藥、白藥）與藥效之間確實(shí)存在一定關(guān)系，也印證中藥色象理論的科學(xué)性。而中藥顏色與藥效關(guān)系的機(jī)制之一可能是通過調(diào)節(jié)α-MSH/M1CR、SCF/RTKs信號(hào)通路來影響黑素細(xì)胞代謝。

本研究存在不足：①現(xiàn)有資料表示僅有白附子和白僵蠶具有毒性。豚鼠皮膚對(duì)藥物刺激反應(yīng)靈敏，其反應(yīng)與人類相似，在飼喂豚鼠的過程中，所有藥物的使用劑量對(duì)黑色素的合成有抑制作用但并未明顯表現(xiàn)出毒性，若后續(xù)用于臨床研究，則需先進(jìn)行毒性檢測(cè)，條件與時(shí)間所限本實(shí)驗(yàn)暫時(shí)未做藥物的毒性檢查。②本研究只對(duì)MC1R以及RTKs蛋白表達(dá)做了基礎(chǔ)研究，但是對(duì)MC1R的凋亡通路以及RTKs蛋白增殖通路包括SCF/RTKs信號(hào)傳導(dǎo)途徑是否有被黑白中藥具體影響還值得深入研究?？梢钥吹降氖乾F(xiàn)有研究黑藥如黃連、紅花等中藥的美白已經(jīng)初具成效[11-12]，白藥如白及、白附子等中藥美白也在理化研究階段[13-15]，黑白中藥即色象中藥在皮膚美容方面擁有較大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

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[收稿日期]2023-01-09

本文引用格式：楊波濤，賈桂云，陳鯤，等.黑白中藥通過調(diào)節(jié)MC1R和RTKs的表達(dá)對(duì)黑色素代謝的影響研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2024，33（3）：12-16.