真皮黑素細胞的研究進展

黃斐然 王大光 駱丹

真皮黑素細胞的研究進展

黃斐然 王大光 駱丹

真皮干細胞具有增殖和多向分化的潛能，角質形成細胞通過表達Wnt3a和E鈣黏素來誘導真皮干細胞移行和分化為黑素細胞。研究表明，在黑素細胞形成過程中，真皮黑素細胞與表皮黑素細胞依賴的信號通路明顯不同，表皮黑素細胞高度依賴干細胞因子信號通路，而真皮黑素細胞高度依賴內皮素3和肝細胞生長因子信號通路。目前關于色素痣痣細胞的來源尚不清楚，有研究認為，痣細胞來源于能分化為黑素細胞的干細胞，真皮干細胞能分化為黑素細胞，是否是痣細胞的來源尚需進一步研究。

黑素細胞；真皮；信號傳導；痣，色素；表皮

黑素細胞起源于神經嵴，神經嵴細胞定向分化為成黑素細胞，成黑素細胞經真皮移行到表皮，在表皮內成黑素細胞增殖、分化為成熟的黑素細胞［1］。目前對表皮及毛囊內黑素細胞的研究已較為深入，但對真皮內黑素細胞的研究較少。概述真皮黑素細胞的來源、真皮黑素細胞信號傳導機制及真皮黑素細胞與色素痣關系等的研究，有助于理解色素性疾病的發(fā)病機制。

1 人真皮干細胞（DSC）能分化為有功能黑素細胞

研究已發(fā)現，毛囊外毛根鞘隆突區(qū)存在黑素干細胞，小鼠和人毛囊外毛根鞘隆突區(qū)分離獲得的干細胞，在一定條件下能向黑素細胞分化。掌跖等無毛皮膚一樣富含黑素細胞，但沒有毛囊，這一現象提示黑素細胞很可能也來源于真皮。

1.1 真皮干細胞可分化為黑素細胞：Li等［2-4］將從人包皮中分離出來的DSC用HESCM4培養(yǎng)基培養(yǎng)，DSC能形成特征性的3D球（真皮球），這些細胞具有增殖的能力。DSC與神經嵴干細胞相似，表達干細胞標志神經生長因子受體75（NGFRp75），而且具有多向分化的潛能，在不同細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，能分化為神經細胞，平滑肌細胞，軟骨細胞和脂肪細胞。DSC與毛囊中的黑素干細胞不同，不表達黑素細胞標志HMB45和酪氨酸相關蛋白1（TYRP1），但將DSC用黑素細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)時，分化的細胞表達黑素細胞標志小眼畸形相關轉錄因子（MITF）、酪氨酸 酶 相 關 蛋 白 2 （TRP2）、S100、TYRP1 以 及HMB45，說明DSC能分化為黑素細胞。

Li等采用3D皮膚重建結構進一步證明了DSC能分化為表皮黑素細胞。這種皮膚重建結構包含真皮和表皮，其中真皮是由膠原和成纖維細胞組成，表皮是由多層角質形成細胞組成。將DSC形成的真皮球種植在重建皮膚的真皮中，單個細胞可從真皮球中移行出來，并逐漸向上移行，最終定位在真皮與表皮交界處的基底膜上，然后開始表達黑素細胞特異性標記分子S100、TYRP1和HMB45，表明DSC能分化移行為表皮黑素細胞［2，5］。

作者單位：210029南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院皮膚性病科

1.2 角質形成細胞調控真皮干細胞移行并生成黑素細胞：角質形成細胞在DSC形成黑素細胞的過程中發(fā)揮重要作用，角質形成細胞通過表達Wnt3a和E鈣黏素來誘導DSC移行和分化為成熟的表皮黑素細胞。既往研究發(fā)現，Wnt能夠抑制神經嵴細胞向神經元和神經膠質細胞分化，并促使神經嵴細胞向黑素細胞系分化，神經嵴細胞缺失Wnt3a或其配體β連環(huán)蛋白（catenin）后，會導致分化的細胞不表達MITF和黑素細胞分化標記，因此，Wnt3a信號是決定神經嵴細胞向黑素細胞分化的關鍵信號分子［6］。Wnt維持 DSC穩(wěn)定并調節(jié)其分化，Zabierowski等［5］發(fā)現，DSC高表達Wnt5a信號，不表達Wnt3a信號，在DSC形成黑素細胞過程中需要經歷Wnt5a向Wnt3a信號轉換過程。將DSC用含有Wnt3a的黑素細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)時，能分化為黑素細胞；把DSC放入3D皮膚重建結構中時，沒有加入外源性的Wnt3a，依然能分化為表皮黑素細胞［2，5］。Jia 等［7］發(fā)現，表皮基底層表達Wnt3a，而角質形成細胞是表皮的主要構成細胞，因而推測可能是角質形成細胞產生Wnt3a誘導了DSC向黑素細胞分化。既往研究已證明，角質形成細胞通過經典的鈣黏素如E鈣黏素、N鈣黏素、P鈣黏素等決定黑素細胞在皮膚的定位，特別是E鈣黏素在引導黑素前體細胞到達表皮過程中起關鍵作用，黑素細胞丟失E鈣黏素后，將不受其臨近的角質形成細胞控制，會發(fā)生定位錯誤，甚至惡性轉變［8］。DSC既不表達E鈣黏素，也不表達N鈣黏素，在皮膚3D重建結構的真皮中也沒有發(fā)現E鈣黏素陽性的細胞，而在表皮基底層上來源于DSC的黑素細胞在增加與角質形成細胞的聯系后，表達E鈣黏素，因而Li等［2］認為，在黑素細胞形成過程中，需通過E鈣黏素與其周邊的角質形成細胞建立聯系，才能形成成熟的表皮黑素細胞。

研究表明，DSC是黑素細胞的儲庫之一，DSC在分化為表皮黑素細胞過程中，需要角質形成細胞參與才能形成成熟的黑素細胞。

2 真皮黑素細胞與表皮黑素細胞的信號通路區(qū)別

許多信號通路和細胞因子在黑素細胞形成過程中發(fā)揮重要作用，其中干細胞因子（SCF）及其配體（Kit）、內皮素（ET）3及ET受體B和肝細胞生長因子（HGF）及其配體（c-MET）的研究比較深入。這些細胞因子在參與調控表皮黑素細胞和真皮黑素細胞發(fā)揮生理功能過程中存在一定差異。

2.1 SCF-Kit：在表皮黑素細胞，SCF通過與其配體Kit結合調節(jié)黑素細胞的存活、分化、移行和增生等SCF基因Mgf或其配體基因kit突變可導致小鼠全身毛色減退、頭部和腹部白斑。Kawaguchi等［9］通過轉基因的方法使鼠皮膚基底層細胞表達SCF，發(fā)現轉基因鼠表皮黑素細胞較同窩正常鼠大量增加，并且出生后無明顯下降，當皮下注射Kit特異性抗體ACK2后，阻斷了SCF與c-Kit的結合，黑素細胞迅速減少，停止注射后，皮膚的黑素細胞還可以恢復說明SCF-Kit具有維持表皮黑素細胞存活，促進表皮黑素細胞增殖和分化的功能。對于真皮黑素細胞SCF-Kit不具有類似功能，真皮黑素細胞的生長過程中不需要SCF參與。Kunisada等［10］通過轉基因的方法使鼠皮膚基底層細胞表達HGF，發(fā)現轉基因鼠真皮黑素細胞明顯增多，用ACK2注射HGF轉基因新生鼠和非轉基因新生鼠，在20 d時觀察發(fā)現轉基因鼠表現黑色皮膚和白色毛發(fā)，而對照組皮膚和毛發(fā)均為白色，通過組織學分析發(fā)現，轉基因鼠皮膚真皮中富含黑素細胞，而對照組未發(fā)現黑素細胞，說明真皮黑素細胞形成和維持并不依賴SCF-Kit途徑。

2.2 ET-3-ET受體B：ET-3主要作用是促進神經嵴細胞增殖并向黑素細胞分化，ET-3-ET受體B在真皮黑素細胞形成過程中起重要作用，ET-3能夠促進真皮黑素細胞生成，維持黑素細胞在真皮中的定位。Garcia等［11］通過轉基因的方法使鼠皮膚基底層細胞表達ET-3，發(fā)現轉基因鼠與對照組鼠相比皮膚顏色加深，顏色加深的皮膚真皮中有黑素細胞，表皮中未發(fā)現黑素細胞，對照組鼠表皮真皮中均未發(fā)現黑素細胞。為了進一步研究ET-3對真皮黑素細胞的作用，Aoki等［12］將 ET-3 轉基因鼠與 KitV620ATg斑駁病模型鼠交配，發(fā)現雙轉基因鼠即使是長白毛區(qū)域的皮膚顏色也變深，長白毛的皮膚毛囊中沒有黑素細胞，但真皮中有黑素細胞；而對照組SCF轉基因鼠與Kit V620A Tg斑駁病模型鼠交配后的雙轉基因鼠毛囊中沒有黑素細胞，真皮中也沒有黑素細胞。另外 Saldana-Caboverde 和 Kos［13］發(fā)現，ET-3或Ednrb的基因敲除小鼠黑素細胞幾乎全丟失Waardenburg綜合征Ⅳ型與ET-3基因或EDNR基因的突變有關，該病皮膚表現不僅有皮膚白斑，而且存在虹膜色素異常，表明ET-3能夠促進真皮黑素細胞的生成，維持黑素細胞在真皮中的定位。

2.3 HGF-c-MET：HGF能促進真皮黑素細胞分化和增殖［14］。在體外，HGF可促進黑素細胞增殖，在神經嵴培養(yǎng)基加入HGF后，成黑素細胞數量變多、且向黑素細胞分化的數量變多，說明HGF-c-MET能夠促進成黑素細胞增殖并向黑素細胞分化。在體內，HGF能促進表達其特異性受體c-MET的前體黑素細胞向真皮黑素細胞分化和增殖。與人不同，鼠出生后黑素細胞僅存在毛囊中，Kunisada等［10］通過轉基因的方法使鼠皮膚基底層細胞表達HGF，在鼠胚胎17.5天時，通過免疫組織分析發(fā)現，HGF轉基因鼠皮膚中TRP2陽性細胞大多分布在真皮和毛囊，雖然表皮上也有一些TRP2陽性細胞，但真皮中TRP2陽性細胞數量是表皮中的5倍，并且是正常對照組真皮中細胞2倍多，95%TRP2陽性細胞不表達c-Kit，基本都表達c-MET；而對照組同窩仔的TRP2陽性細胞大多分布在毛囊和表皮，毛囊中98%TRP2陽性細胞表達c-Kit，表皮中78%TRP2陽性細胞表達c-Kit。出生后，HGF轉基因鼠皮膚是黑色的，真皮中出現大量黑素細胞，在背部皮膚真皮中的黑素細胞數量比對照組高300倍，并且皮膚顏色一直保持不變，這說明真皮黑素細胞的形成和維持依賴HGF。HGF轉基因鼠真皮中黑素前體細胞不表達E鈣黏素，E鈣黏素是表皮黑素細胞表達的分子，對于黑素細胞進入并定位于表皮至關重要。該結果結合轉HGF基因鼠真皮中存在大量黑素細胞現象，很可能說明HGF通過下調細胞E鈣黏素的表達，從而使黑素前體細胞不能進入表皮而定位在真皮中，形成了真皮黑素細胞的大量聚集。盡管轉HGF基因鼠表皮中的黑素細胞與對照組相比也有增多，但與真皮相比可忽略不計，并且表皮中的黑素細胞隨著鼠生長逐漸消失，說明HGF不能維持表皮黑素細胞的存活。

通過以上研究結果可以得出：表皮黑素細胞高度依賴SCF-Kit信號通路，而真皮黑素細胞則高度依賴ET-3-Ednrb信號通路和HGF-c-MET信號通路。

3 真皮黑素細胞與痣的形成

目前色素痣的發(fā)病機制尚不清楚，關于痣細胞的來源也無定論［15］。有人認為，痣細胞來源于表皮黑素細胞，也有人提出，色素痣黑素細胞是由能分化為黑素細胞的干細胞而來，包括毛囊干細胞和真皮干細胞，而是由已分化的黑素細胞而來。早期研究認為，痣的形成符合Abtropfung概念，該概念為痣細胞來源于表皮黑素細胞，隨著時間的推移，逐漸下降到真皮，在這一過程中相繼形成了交界痣、復合痣和皮內痣［16］。然而，Worret和 Burgdorf［17］通過對來自各年齡段3534例患者的痣進行了分析，發(fā)現＜10歲患者的痣沒有交界痣，多數是皮內痣，而＞60歲患者的痣12%是交界痣，這與Abtropfung概念不相符，說明痣不太可能開始于表皮黑素細胞。此外，Grichnik等［15］發(fā)現，藍痣缺乏表皮成分，也說明痣不太可能起源于表皮黑素細胞。

Krengel［16］認為，色素痣可能來源于毛囊干細胞，已發(fā)現在鼠毛囊隆突部存在能夠分化為黑素細胞的黑素干細胞。有臨床證據表明，部分先天性色素痣來源于與毛囊緊密相關的細胞，例如，先天性痣切除后再生的痣圍繞毛囊生長。然而，毛囊模式并不符合大多數先天性痣，尤其是在無毛的掌跖皮膚出現的先天性痣。真皮干細胞已從人無毛皮膚中分離出來了，也具有分化為黑素細胞的潛能，因而推測，痣有可能來源于DSC。Kinsler等［18］對66例先天性痣的樣本進行分析，通過免疫組化發(fā)現，大多數樣本痣細胞表達干細胞標記巢蛋白（nestin），而DSC也表達巢蛋白，先天性痣的基底層上有明顯的正常表皮黑素細胞，推測這是因為痣是由黑素細胞移行后留下的能分化為黑素細胞的細胞發(fā)生突變增殖形成的，而不是有由已分化的表皮黑素細胞增殖形成。另外先天性痣的超微結構顯示有不規(guī)則和缺口的細胞核、細胞核中有夾雜物、增多的纖毛和中心粒、痣巢被基板包繞（痣巢是由分開的單個細胞增殖形成的），這些特點均與干細胞相似。綜上所述，真皮干細胞很可能是痣細胞的來源。

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Advances in dermal melanocytes

Huang Feiran,Wang Daguang,Luo Dan.Department of Dermatology and Venereology,First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China

Dermal stem cells （DSCs） have great proliferation and multidirectional differentiation potential.Keratinocytes can induce DSCs to migrate and differentiate into melanocytes by expressing Wnt-3a and E-cadherins.Researches have indicated that the generation of dermal and epidermal melanocytes is dependent on different signaling pathways.More concretely,epidermal melanocyte generation is highly dependent on the stem cell factor （SCF） signaling pathway,while dermal melanocyte generation on the endothelin 3 （ET3） and hepatocyte growth factor （HGF） signaling pathways.The origin of nevus cells in pigmented nevus is not yet clear.Some studies suggest that nevus cells may derive from the stem cells which can differentiate into melanocytes.DSCs can differentiate into melanocytes,but further research is needed to determine whether they are the source of nevus cells.

Melanocytes;Dermis;Signal transduction;Nevus,pigmented;Epidermis

Wang Daguang,Email:wangirwin@126.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2015.04.018

國家自然科學基金（81000703）；江蘇省自然科學基金（BK2009437）

王大光，Email：wangirwin@126.com

本文主要縮寫：DSC：真皮干細胞，NGFRp75：神經生長因子受體75，SCF：干細胞因子，ET：內皮素，Ednrb：內皮素受體 B，HGF：肝細胞生長因子，MITF：小眼畸形相關轉錄因子，TYRP1：酪氨酸酶相關蛋白1，TRP2：酪氨酸酶相關蛋白2

2014-07-04）