天香百合、藥百合黃酮醇合成酶FLS基因克隆和表達分析

劉筱琳,孫婷婷,楊 捷,何恒斌

(北京林業(yè)大學 園林學院,花卉種質創(chuàng)新與分子育種北京市重點實驗室,國家花卉工程技術研究中心,城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實驗室,北京 100083)

百合(Liliumspp.)是百合科百合屬多年生球根植物,是全球最具經(jīng)濟價值和廣泛栽培的花卉作物之一[1]。中國作為一個花卉種質資源大國,其原產(chǎn)百合屬植物有55種,占據(jù)全球百合屬百分之五十左右[2],目前在中國種植較多的有亞洲百合雜種、麝香百合雜種及東方百合雜種等,其中東方百合以其花大艷麗、氣味芳香等特點被人們青睞,并成為國際花卉市場的主流產(chǎn)品。在鮮切花市場內(nèi),索邦、西伯利亞等雜交品種較為常見[3]。觀賞植物最重要品質性狀之一是花色,直接影響植物的觀賞價值和商業(yè)價值,特別是隨著人們生活水平的提升,對有著新奇花色植物的需求量逐年提高,所以百合的花色改良基因工程研究已刻不容緩[4]。在百合中花色主要的呈色物質是類黃酮和類胡蘿卜素[5],類黃酮是花朵呈色的重要色素之一,主要包括花青素苷、黃酮和黃酮醇3大類[6]。目前對百合花色相關的分子研究較少,有關研究主要包括對花青素苷的合成基因及相關調(diào)控基因的分離與功能驗證方面[7-12]。作為類黃酮化合物代謝途徑的兩個分支,黃酮醇與花青素苷的生物合成共享著前期合成路徑,底物二氫黃酮醇同時被黃酮醇合成途徑上的黃酮醇合成酶(FLS)與花青素苷合成途徑中的二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)競爭[13-14]。另外,黃酮醇也是主要的輔色素之一,能夠提高花青素苷的穩(wěn)定性,影響花色形成[15]。因此,黃酮醇合成酶是類黃酮代謝途徑中關鍵的節(jié)點酶之一[16]。

目前已從矮牽牛(Petuniaspp.)[17]、擬南芥(Arabidopsisthaliana)[18]、玉米(Zeamays)[19]、金花茶(Camellianitidissima)[20]、甜櫻桃(PrunusaviumL.)[21]、葡萄風信子(Muscariarmeniacum)[22-24]、郁金香(Tulipafosteriana)[25]、玫瑰(Rosarugosa)[26]、紅花檵木(Loropetalumchinensevar.rubrum)[27]等多種植物中克隆得到FLS基因。在龍膽(Gentianascabra)[28]、海棠(Maluscrabapple)[29]、擬南芥[30]、蘋果(M.domestica)[31]、葡萄風信子[32]等植物中的功能分析表明FLS基因的過表達能夠促進植物黃酮醇的積累,抑制花青素苷的合成;矮牽牛[17]和洋桔梗(Eustomagrandiflorum)[33]中FLS基因的表達受到抑制時,黃酮醇含量顯著降低同時出現(xiàn)花青素積累,過表達DFR會導致FLS基因表達量降低和紅色花的形成[34]。然而,百合中FLS基因的研究較少,其在花青素合成過程中作用機制尚不清楚。

由于百合在鮮切花市場上的重要性,國內(nèi)外通過各種雜交選育,已經(jīng)培育出多個優(yōu)良的觀賞百合品種。其中市面最常見的切花百合品種為東方百合中的索邦和西伯利亞,而東方百合是從天香百合(L.auratum)、鹿子百合(L.speciosum)、日本百合(L.japonicum)和湖北百合(L.henryi)的雜種中選育出來的,藥百合(L.speciosumvar.gloriosoides)是鹿子百合的一個變種,主要分布在中國安徽、廣西等區(qū)域。本研究以市場上常見的東方系百合主要親本中的天香百合、藥百合這兩種野生百合為研究材料,克隆它們的FLS基因并進行序列特征分析比對,對其氨基酸序列進行同源性比對與進化分析,運用實時定量PCR技術分析其FLS基因的表達模式,為進一步探討百合中FLS基因對花色形成的影響奠定基礎,并且為開展百合花色育種,選育更適宜中國審美的東方系百合提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

天香百合和藥百合均種植于北京林業(yè)大學溫室。根據(jù)開花不同階段花被片著色,將花發(fā)育過程分為4個取材階段:時期1,完全未著色的花蕾;時期2,花被片上斑點開始出現(xiàn);時期3,花被片完全著色但并未開放的花蕾;時期4,完全開放盛開階段的花。天香百合4階段命名為S1、S2、S3、S4,藥百合取材4個階段命名為T1、T2、T3、T4。分別采集植株4個發(fā)育階段的花被片和完全盛開階段的有色部分(S4C、T4C)和無色部分(S4W、T4W)為實驗材料(圖1)。所有材料均設置3個重復,取材后立即放入液氮速凍,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

A,天香百合;B,藥百合;C,天香百合4個階段取材;D,藥百合4個階段取材。A, L. auratum; B, L. speciosum var. gloriosoides; C, Four-stage materials of L. auratum; D, Four-stage materials of L. speciosum var. gloriosoides.

1.2 方法

1.2.1FLS基因的克隆

用EASY Spin Plus植物RNA快速提取試劑盒(艾德萊)提取兩個品種各階段花被片的RNA,并利用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(TOYOBO)合成cDNA第一鏈,放在-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)天香百合和藥百合轉錄組數(shù)據(jù)中的黃酮醇合成酶基因的CDS區(qū)設計特異性克隆引物(表1),以天香百合和藥百合第3階段取材的cDNA第一鏈為模板,擴增FLS基因的CDS序列,克隆反應體系參照說明書,做50 μL的體系,其中KOD-Plus-Neo高保真酶25 μL,引物F、引物R各1 μL,cDNA 1 μL,ddH2O 22 μL。94 ℃預變性2 min后進行擴增,擴增體系:94 ℃變性10 s,54 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,40個循環(huán)后72 ℃延伸10 min。得到的PCR產(chǎn)物進行電泳檢測,選擇正確的目標條帶用瓊脂糖凝膠回收純化試劑盒進行回收,連接到pTOPO-B載體(艾德萊)上、轉化DH5α感受態(tài)后挑選陽性克隆菌斑,搖菌后送睿博興科生物技術公司測序。

表1 引物序列表

1.2.2FLS基因生物信息學分析

利用ExPASy-Translate tool(http://web.expasy.org/translate)在線工具將測序獲得的正確CDS序列翻譯成氨基酸序列;在線網(wǎng)站NCBI-BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)、The Sequence Manipulation Suite(http://www.bio-soft.net/sms/index.html)、Clustal Omega(https://www.ebi. ac.uk/Tools/msa/clustalo/)和DNAMAN軟件進行FLS基因氨基酸的序列比對信息分析(表2);運用MEGA7軟件將本研究獲得的正確FLS基因編碼氨基酸序列與已報道的部分植物FLS基因氨基酸進行序列比對并構建演化樹(表3);用ExPASy (http://web.expasy.org/)在線網(wǎng)站中的ProtParam工具預測LaFLS和LsFLS氨基酸序列的理化性質;運用DTU Health Tech 在線技術分析網(wǎng)站(https://www.healthtech.dtu.dk/)中的SignalP 6.0工具預測LaFLS和LsFLS蛋白信號肽情況;用TMHMM 2.0研究LaFLS和LsFLS蛋白有無跨膜結構域;用Protscale工具(http://web.expasy.org/protscale/)對LaFLS和LsFLS的親疏水性進行分析;用TargetP-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)預測LaFLS和LsFLS 蛋白的亞細胞定位情況。

表2 序列比對基因信息

表3 系統(tǒng)進化樹基因信息

1.2.3 煙草亞細胞定位GFP表達載體構建

根據(jù)克隆結果設計亞克隆引物FLS(sub-clone)F、FLS(sub-clone)R(表1),由于LaFLS和LsFLS克隆得到的CDS序列幾乎相同,所以共用一套亞克隆引物。將比對出來的正確克隆菌液大搖后進行質粒提取,并以濃度合適的質粒為模板進行PCR擴增,擴增程序同1.2.1節(jié)。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測后膠回收正確序列長度的條帶,以膠回收產(chǎn)物為模板連接到pSuper1300-GFP表達載體后轉化大腸埃希菌感受態(tài)細胞,37 ℃培養(yǎng)16 h后挑選圓潤單菌落進行PCR檢測,選條帶正確的菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序,將序列拼接比對后的正確菌液進行大搖并提取質粒,將pSuper1300-FLS-GFP和空載(正對照)通過液氮轉化法導入GV3101農(nóng)桿菌(北京博邁德生物技術有限公司),28 ℃培養(yǎng)后選擇圓潤的單菌落重懸后侵染適齡的野生型本氏煙草(Nicotianabenthamiana)葉表皮細胞,暗培養(yǎng)24～48 h后用共聚焦顯微鏡(Nikon eclipse Ti)觀測定位結果并拍照記錄。

1.2.4FLS基因的時空表達分析

根據(jù)克隆獲得的LaFLS和LsFLS基因序列設計半定量引物,運用Primer3 Input 0.4.0(https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)在線工具設計熒光定量引物(表1),以不同發(fā)育階段花被片樣品的cDNA為模板,從天香百合中篩選出EF基因,從藥百合中篩選出TIP41基因,分別作為qRT-PCR的內(nèi)參基因,并以天香百合和藥百合各組織部位樣品的cDNA為模板進行qRT-PCR分析,配置20 μL的反應體系,其中2×TaqPCR MasterMix 10 μL、引物F和引物R各1 μL、cDNA 0.5 μL、ddH2O 7.5 μL。qRT-PCR程序:94 ℃預變性5 min,擴增程序:94 ℃變性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共35個循環(huán),然后72 ℃延伸5 min。

在Bio-Rad CFX Connect Real-Time PCR System熒光定量PCR儀上分別檢測兩個品種的FLS基因的相對表達量。根據(jù)退火實驗確定LaFLS和LsFLS的退火溫度,將不同階段花被片取材的cDNA稀釋10倍作為模板,參照SYBR?Premix Ex Taq TM Ⅱ(TaKaRa)說明書,配置反應體系20 μL,其中TB Green酶10 μL、稀釋10倍的引物F和引物R各4 μL、稀釋10倍的cDNA 2 μL。LaFLS擴增程序:95 ℃變性30s,58.4 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s;LsFLS擴增程序:95 ℃變性5 s,59.4 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s。均進行40個循環(huán),每個樣品設置3個重復。

2 結果與分析

2.1 LaFLS和LsFLS基因的克隆

從天香百合和藥百合中克隆獲得的黃酮醇合成酶基因LaFLS和LsFLS編碼區(qū)長度均為1 035 bp(圖2),都含有完整的開放閱讀框,且均編碼344個氨基酸。

M,DNA Marker;A1、A2,LaFLS的擴增產(chǎn)物;B1、B2,LsFLS的擴增產(chǎn)物。M, DNA Marker; A1, A2, Product of the LaFLS amplification in cDNA; B1, B2, Product of the LsFLS amplification in cDNA.

利用在線工具Clustal Omega對分別來自天香百合和藥百合的LaFLS和LsFLS進行序列比對發(fā)現(xiàn)有9個堿基差異,其中有4個堿基差異導致4個氨基酸差異,并且第89位變異的氨基酸位于保守的DIOX-N結構域中(圖3),這些位于保守結構域的氨基酸差異可能導致FLS催化活性不同,從而影響類黃酮代謝支路間的競爭關系。

A,LaFLS核苷酸及編碼氨基酸序列;B, LsFLS核苷酸及編碼氨基酸序列。方框表示LaFLS 和LsFLS核苷酸及編碼氨基酸序列中的差異。A, Nucleotide and amino acid sequences of LaFLS; B, Nucleotide and amino acid sequences of LsFLS. The frames show the differences between the nucleotide and amino acid sequences of LaFLS and LsFLS.

2.2 LaFLS和LsFLS基因的生物信息學分析

利用DNAMAN軟件,將天香百合的LaFLS和藥百合的LsFLS基因與NCBI公布的FLS氨基酸序列進行比對,發(fā)現(xiàn)LaFLS和LsFLS與其他植物的FLS氨基酸序列同源性高,說明FLS氨基酸序列在不同物種中是高度保守的。另外,利用NCBI Conserved Domain Search在線分析及序列比對顯示,LaFLS和LsFLS序列中均含有1個保守的DIOX-N功能域(從43個氨基酸到151個氨基酸)和一段典型的2-酮戊二酸和鐵(Ⅱ)依賴性加氧酶結構域(圖4),與已報道的FLS基因一致。

下劃線位置是DIOX-N結構域,紅色方框表示2-酮戊二酸和鐵(Ⅱ)依賴性雙加氧酶結構域;DHQ底物特異結合位點、2-酮戊二酸和Fe2+位點分別用黑色三角、星號及箭頭表示。The underlined position is the DIOX-N domain, and the red box represents the 2-ketoglutaric acid and iron (Ⅱ) dependent dioxygenase domain; DHQ substrate specific binding sites, 2-ketoglutaric acid and Fe2+ sites are indicated by black triangles, asterisks and arrows, respectively.

將克隆得到的LaFLS和LsFLS與東方百合白色花品種西伯利亞(Siberia)和粉色花品種索邦(Sorbonne),以及已報道的二十幾個FLS氨基酸序列進行比對,結果顯示,LaFLS和LsFLS與東方系百合西伯利亞和索邦的FLS基因相似度最高,并且天香百合、藥百合與索邦FLS基因的親緣關系較近,從進化樹也可以看出這幾種百合位于一個進化支(圖5),反映出天香百合和藥百合是東方百合品種的主要親本,參與了這些品種的培育。其次LaFLS和LsFLS與岷江百合(L.regale)的FLS基因相似度比較高,與單子葉植物郁金香、毛油點草(Tricyrtisspp.)、多花水仙(Narcissustazetta)、洋蔥(Alliumcepa)等親緣關系較近,而與雙子葉植物煙草(N.tabacum)、矮牽牛、龍膽、金魚草(Antirrhinummajus)等親緣關系較遠。

圖5 FLS基因系統(tǒng)進化樹分析Fig.5 The phylogenetic tree analysis of FLS

SignalP 5.0在線預測結果顯示,LaFLS和LsFLS蛋白均無信號肽序列(圖6);TMHMM Server v.2.0工具分析 LaFLS和LsFLS蛋白跨膜結構域圖像,結果表明,LaFLS和LsFLS蛋白均不存在跨膜結構域(圖7)。由ProtScale在線工具預測結果可知,LaFLS和LsFLS氨基酸序列中親水性最強的位點均是第150位的賴氨酸,分值為-3.078;第225位的蘇氨酸為疏水性最強位點,分值為2.144?？梢缘贸鯨aFLS和LsFLS蛋白的親水區(qū)域均多于疏水區(qū)域,為親水蛋白質(圖8)。

圖6 FLS蛋白的信號肽分析Fig.6 Analysis of FLS signal peptide

圖8 FLS蛋白的親疏水性分析Fig.8 Hydrophilic-hydrophobic analysis of FLS protein

2.3 LaFLS和LsFLS蛋白亞細胞定位分析

TargetP-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)預測LaFLS和LsFLS的亞細胞定位情況,在線預測結果顯示LaFLS和LsFLS蛋白定位于整個細胞內(nèi),在細胞質的可能性比較大,從預測結果推測LaFLS和LsFLS基因可能主要在細胞質中發(fā)揮功能。

瞬時表達結果顯示(圖9),空載質粒的熒光信號在細胞質和細胞核中均有表達,LaFLS-GFP融合蛋白和LsFLS-GFP融合蛋白幾乎在整個細胞都有信號,但是主要定位在細胞質和細胞核中,與單子葉植物葡萄風信子MaFLS蛋白的亞細胞定位結果一致[17]。

圖9 LaFLS和LsFLS蛋白的亞細胞定位分析Fig.9 Subcellular localization analysis of LaFLS and LsFLS proteins

據(jù)亞細胞定位結果可以得出,LaFLS和LsFLS主要定位在煙草表皮細胞的細胞質和細胞核,與在線網(wǎng)站預測的結果幾乎一致,由此推斷LaFLS和LsFLS基因在細胞質和細胞核中都發(fā)揮作用。

2.4 LaFLS和LsrFLS基因時空表達模式分析

本研究分別選取天香百合和藥百合的7個組織部位、花蕾4個發(fā)育時期的花被片,進行FLS基因的表達分析。半定量RT-PCR實驗結果表明,LaFLS和LsFLS在兩種百合的不同組織中具有相似的表達模式:LaFLS和LsFLS均在葉片、子房、花藥中表達量較高,在花柱、花絲中表達量較低(圖10),結果說明,LaFLS和LsFLS具有相似的組織特異性,反映了FLS的高度保守性。隨著花蕾發(fā)育,LaFLS表達量為先增加后降低,在S3時達到最大值,隨著花蕾開放表達量又下降,其花被片無色部分的表達量高于有色部分(圖11-A);LsFLS在花蕾發(fā)育早期表達量上升,在T2階段斑點出現(xiàn)顏色時減少到較低水平,之后逐漸增加,在T4階段表達量達到最高,其盛開階段花被片無色部分FLS的表達量高于其有色部位(圖11-B),結果表明,黃酮醇合成酶在百合花被片不同區(qū)域的花青素和類黃酮的競爭性積累中發(fā)揮功能,從而形成不同花色性狀。

1,上部葉;2,下部葉;3,花柱;4,柱頭;5,子房;6,花絲;7,花藥;8,花被片;LaEF,天香百合內(nèi)參基因;LsTIP,藥百合內(nèi)參基因。1, Upper leaf; 2, Lower leaf; 3, Style; 4, Stigma; 5, Ovary; 6, Perianth; 7, Anther; 8, Perianth; LaEF, Reference gene in L. auratum; LsTIP, Reference gene in L. speciosum var. gloriosoides.

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05).

3 結論與討論

類黃酮化合物廣泛存在于植物界中,作為類黃酮化合物中的重要的次生代謝物之一的黃酮醇在植物諸多生長發(fā)育過程中發(fā)揮著不可或缺的功能。在黃酮醇的生物合成過程中二氫黃酮醇可以在黃酮醇合成酶(FLS)催化下氧化形成黃酮醇苷元,經(jīng)過一系列修飾后形成黃酮醇衍生物,也可以在二氫黃酮醇(DFR)的催化下產(chǎn)生無色花青素,最終形成花青素苷[16,35],FLS和DFR基因競爭共同的底物,二者皆為黃酮醇生物合成途徑中重要限速酶。

黃酮醇合成酶是類黃酮化合物代謝途徑中一個重要的結點酶,屬于2-酮戊二酸和鐵(Ⅱ)依賴性雙加氧酶超家族。LaFLS和LsFLS氨基酸序列高度保守,且存在保守的DIOX-N結構域和典型的2-酮戊二酸和鐵(Ⅱ)依賴性雙加氧酶結構域,無信號肽和跨膜區(qū)域,均為親水性蛋白,與其他物種的FLS蛋白相似性高。

類黃酮化合物生物合成相關基因的表達受到植物種類、組織以及環(huán)境光照的影響,并且在植物體內(nèi)存在著不同的調(diào)控機制。黃酮醇合成酶FLS基因在植物不同發(fā)育時期、不同環(huán)境及不同組織中的表達量不同[36]。雖然研究表明天香百合和藥百合的FLS基因幾乎相同,但對比LaFLS和LsFLS的核苷酸序列和氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)部分位點存在差異,推測這些位點可能會影響底物的偏好性及催化活性,進而影響黃酮醇的合成和不同花色的形成[16]。百合是世界第五大鮮切花,長期的遺傳改良產(chǎn)生了豐富的商品種[37],序列比對及系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn),天香百合和藥百合FLS基因的氨基酸序列與其雜交子代東方百合粉色花品種索邦、白色花品種西伯利亞FLS基因氨基酸序列幾乎一致,但LaFLS與LhSiFLS的親緣關系更近,而LsFLS與LhSorFLS的親緣關系近。并且進化樹結果表明,藥百合的LsFLS、東方百合粉色花品種索邦的FLS與野生種岷江百合LrFLS的親緣關系比天香百合LaFLS和白色品種西伯利亞FLS基因更近。葛亮等[38]在對百合部分種及品種系統(tǒng)進化關系的研究中發(fā)現(xiàn),岷江百合、湖北百合關系較近,而東方百合雜種系是由湖北百合、來自日本的天香百合、鹿子百合等雜交形成,藥百合為鹿子百合的一個變種。藥百合、湖北百合及東方百合索邦花被片均有花青素顏色積累,而天香百合和西伯利亞花被片為淡黃色(并分布有紫色斑點)和白色,所以序列部分位點的差異能否對FLS基因表達造成影響,進而對花色呈色差異影響需要進一步研究證明。

通過LaFLS和LsFLS的表達情況來看,兩個基因分別具有一定的組織特異性,但總體來講均在花藥、子房的表達量較高,在花蕾發(fā)育的過程中LaFLS表達量處于動態(tài)變化,LsFLS隨著花蕾發(fā)育其表達量逐漸增加,表明隨著呈色過程可能有黃酮醇的大量積累。已有的報道中,FLS在不同植物中的表達模式差異較大。擬南芥中AtFLS被歸為早期基因,在幼嫩組織中表達量較高,而在成熟葉片中表達較低,在植物發(fā)育的早期階段發(fā)揮功能[39]。在溫州蜜柑(CitrusunshiuBlanco)[40]、覆盆子(Rubusidaeus)[41]等果樹研究中表明,FLS基因的表達受發(fā)育調(diào)控,未成熟果實中FLS酶活性及黃酮醇的積累高于成熟果實,黃酮醇在幼嫩組織中表達量較高,這可能是因為黃酮醇有抵擋紫外線傷害的作用,可以減少紫外線對幼嫩組織的傷害[34]。葡萄(Vitisvinifera)中VvFLS基因在各個組織部位均有表達,隨著生長發(fā)育不同組織中FLS的表達量產(chǎn)生變化,其中在葉子、花蕾花朵及漿果皮中表達量較高[42];葡萄風信子中MaFLS基因在白色品種的花蕾發(fā)育早期表達量逐漸升高,到花蕾變色中后期又降低,而粉色和藍色品種中FLS基因在晚期表達量最高[22-23],這與天香百合和藥百合FLS基因的表達模式幾乎一致。黃酮醇作為主要輔色素之一,不僅和二氫黃酮醇-4-還原酶(DFR)競爭底物二氫黃酮醇,還需要其合成黃酮醇以穩(wěn)定花色[8]。將牡丹(Paeoniasuffruticosa)中正向調(diào)控花青苷生物合成的轉錄因子PsMYB12L在蘋果愈傷組織過表達,發(fā)現(xiàn)FLS的表達下調(diào),同時上調(diào)內(nèi)源性參與花青素生物合成的基因如DFR、ANS等表達[32],推測在百合中黃酮醇合成酶基因也有類似的表現(xiàn)。因此,LaFLS和LsFLS的基因表達差異、底物偏好性及催化活性等可能關系到天香百合和藥百合黃酮醇合成支路對代謝流的競爭能力和黃酮醇積累,進而可能會對花青素苷的積累和花色產(chǎn)生影響,從而使花被片出現(xiàn)不同的表型顏色,這些作用機制和調(diào)控機制需要深入研究。