POR基因敲除、回補(bǔ)及過(guò)表達(dá)LO2細(xì)胞株的構(gòu)建及作為AFB1染毒模型的初步應(yīng)用

王 琳,袁建林,繆 昌,馬玉晗,曹三杰,趙 勤,*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 豬病研究中心,四川 成都 611130; 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與獸醫(yī)診斷技術(shù)四川科學(xué)觀測(cè)站,四川 成都 611130)

細(xì)胞色素P450氧化還原酶(cytochrome P450 oxidoreductase),簡(jiǎn)稱POR,或CPR、CYPOR、OR、NCPR、P450R等。POR最先是作為單個(gè)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)特異性細(xì)胞色素C還原酶被發(fā)現(xiàn)的,是所有肝微粒體中細(xì)胞色素P450微粒體氧化酶系(cytochrome P450 monooxygenases, CYP450s)的唯一電子供體[1]。肝臟作為機(jī)體異生素代謝的主要器官,POR在其中發(fā)揮了不可替代的代謝作用。POR對(duì)多種代謝過(guò)程至關(guān)重要,參與由CYP450s催化的類固醇激素、藥物和異生素等代謝反應(yīng)[2-3]。POR不僅可作為電子供體參與由CYP450s介導(dǎo)的異生素代謝,也是構(gòu)成幾種加氧酶復(fù)合物的基本成分,包括血紅素氧化酶、鯊烯單加氧酶、7-脫氫膽固醇還原酶[4],在機(jī)體中發(fā)揮代謝作用。如Reczek等[5]進(jìn)行了基于CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)的陽(yáng)性選擇篩選,確定POR基因是百草枯誘導(dǎo)活性氧(ROS)產(chǎn)生的來(lái)源,是百草枯誘導(dǎo)細(xì)胞死亡所必需的代謝基因。POR還能直接介導(dǎo)一些致癌毒性物質(zhì)的代謝和轉(zhuǎn)化,故已作為抗癌治療的目標(biāo)。Pedersen等[6]也研究發(fā)現(xiàn),POR是三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)的獨(dú)立預(yù)后生物標(biāo)志物,評(píng)估POR的表達(dá)變化能夠更有效地對(duì)TNBC患者進(jìn)行監(jiān)測(cè)和治療。

黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)對(duì)肝毒性的損傷巨大,肝臟作為AFB1的靶器官,機(jī)體攝入AFB1后,經(jīng)過(guò)CYP450s作用將AFB1代謝為AFB1-8,9-環(huán)氧化物(AFB1-8,9-epoxide,AFBO),繼而在體內(nèi)與DNA、RNA和蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合形成DNA加合物,攻擊機(jī)體內(nèi)的DNA等生物大分子,引發(fā)DNA損傷、細(xì)胞凋亡等毒效應(yīng),進(jìn)而引起細(xì)胞惡變,引發(fā)機(jī)體腫瘤[7]。其中POR對(duì)CYP450s有重要的調(diào)控作用,在AFB1的代謝及毒性過(guò)程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用,但具體的毒性作用機(jī)制還需要作深入研究。人肝細(xì)胞LO2是目前研究AFB1導(dǎo)致肝毒性損傷的一種常用體外細(xì)胞模型[8],但POR基因在LO2細(xì)胞中的敲除、回補(bǔ)或過(guò)表達(dá)細(xì)胞系的研究還未見(jiàn)報(bào)道。為深入研究POR在AFB1所致肝毒性中的功能和作用,急需構(gòu)建LO2 PORKO、LO2 PORCO、LO2 POROE等細(xì)胞系作為相關(guān)毒理研究的細(xì)胞模型。

目前CRISPR/Cas9技術(shù)在基因編輯領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用。在此之前,利用鋅指核酸酶 (ZFN)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶(TALEN)進(jìn)行基因編輯是常見(jiàn)的手段[9]。相較于ZFN與TALEN的蛋白質(zhì)引導(dǎo)DNA切割方法,CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的兩個(gè)基本組件:靶向目標(biāo)基因引導(dǎo)RNA和切割雙鏈DNA的Cas9內(nèi)切酶,使得CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯具有簡(jiǎn)單、高效、低成本、高特異性等優(yōu)點(diǎn)。

在采用 CRISPR/Cas9技術(shù)定點(diǎn)敲除LO2細(xì)胞中POR基因構(gòu)建LO2 PORKO細(xì)胞株,以及采用同源重組技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒后經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選分別構(gòu)建穩(wěn)定的LO2 PORCO和LO2 POROE細(xì)胞株的基礎(chǔ)上,再用AFB1染毒處理各細(xì)胞株后觀察細(xì)胞形態(tài)變化及測(cè)定細(xì)胞存活率,以驗(yàn)證LO2 PORKO、LO2 PORCO和LO2 POROE細(xì)胞株的增殖功能,為后續(xù)將其作為相關(guān)毒理研究細(xì)胞模型并深入開(kāi)展POR基因功能的研究提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料

293T及人肝細(xì)胞LO2株(均為ATCC來(lái)源)、lentiCRISPR v2質(zhì)粒和pcDNA3.1(+)/myc-His B質(zhì)粒等均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院豬病研究中心保藏并提供;黃曲霉素B1(純度≥ 98%)購(gòu)自上海麥克林生化科技股份有限公司;人源POR抗體和HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG (H+L)均購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司;GAPDH抗體購(gòu)自Proteintech公司;無(wú)縫克隆試劑盒與增強(qiáng)型CCK-8試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組處理辦法

LO2細(xì)胞分為正常細(xì)胞對(duì)照組(細(xì)胞+DMEM培養(yǎng)液)和不同濃度的AFB1染毒組。AFB1需用二甲基亞砜(DMSO)溶解后配制成5 mmol·L-1的母液后,再用DMEM高糖培養(yǎng)液稀釋成不同濃度,并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行規(guī)定時(shí)間的染毒處理。

1.2.2POR基因編輯靶位點(diǎn)的選擇設(shè)計(jì)和sgRNA引物的合成

通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)搜索人源POR基因序列(ID:5447),再通過(guò)CRISPR設(shè)計(jì)工具網(wǎng)站(http://chopchop.cbu.uib.no/)設(shè)計(jì)POR的sgRNA,在待選的sgRNA中選擇綜合排名靠前且預(yù)測(cè)無(wú)脫靶效應(yīng)的2條sgRNA,它們均靶向同一外顯子exon5。故分別設(shè)計(jì)了靶向POR-exon5的2個(gè)sgRNA,sgRNA及相應(yīng)引物序列如表1。預(yù)期在exon5靶位點(diǎn)之后的基因序列發(fā)生突變,使POR基因自sgRNA靶位點(diǎn)后氨基酸翻譯錯(cuò)碼從而導(dǎo)致POR蛋白不能正常表達(dá)。

1.2.3 lentiCRISPR v2-sgRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建

取靶向POR基因的兩個(gè)sgRNA的引物,通過(guò)降落PCR退火,形成雙鏈DNA。取經(jīng)BsmB I限制性內(nèi)切酶線性化后的lentiCRISPR v2質(zhì)粒,使用T4 DNA連接酶連接,16 ℃過(guò)夜,第2天進(jìn)行轉(zhuǎn)化及克隆。使用lentiCRISPR v2通用引物對(duì)轉(zhuǎn)化后平板上菌落挑單,進(jìn)行菌落PCR鑒定。擴(kuò)大培養(yǎng)陽(yáng)性菌落,交由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。將測(cè)序正確菌落擴(kuò)大,抽提質(zhì)粒保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 慢病毒包裝和病毒感染

293T細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)將質(zhì)粒lentiCRISPR v2-sgRNA、psPAX2和pMD2.G按比例(質(zhì)量比10∶6∶3)混合,根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明,將質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合物進(jìn)行轉(zhuǎn)染,36 h后收集細(xì)胞上清液,4 ℃保存。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集全部細(xì)胞液,兩次收集的上清液離心并過(guò)濾后置于-80 ℃?zhèn)溆?。使用凍存的慢病毒?病毒液∶培養(yǎng)液體積比1∶1)感染LO2細(xì)胞,加入總濃度為8 μg·mL-1的Polybrene增加病毒感染效率。感染36 h后換液,使用嘌呤霉素(1.5 μg·mL-1)篩選14 d后獲得陽(yáng)性細(xì)胞株。其間產(chǎn)生的廢棄物均無(wú)害化處理,統(tǒng)一回收。

1.2.5 LO2 PORKO單克隆細(xì)胞系的篩選

使用有限稀釋法均勻接種約50個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,培養(yǎng)約一周后,挑取單克隆細(xì)胞團(tuán)至24孔板中,逐漸擴(kuò)大培養(yǎng)。收集細(xì)胞,提取基因組DNA,利用表2中的引物進(jìn)行擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)回收純化進(jìn)行測(cè)序鑒定。

表2 POR基因敲除鑒定引物序列

1.2.6POR基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

POR目的片段的獲取:根據(jù)RNA抽提試劑盒的說(shuō)明提取LO2細(xì)胞總RNA,隨后反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA進(jìn)行POR基因擴(kuò)增。POR同源擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表3。擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為2 088 bp。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。線性化載體的制備:提取載體pcDNA3.1(+)/myc-His B質(zhì)粒,使用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、HindⅢ對(duì)其進(jìn)行雙酶切,切膠純化獲得線性化載體,保存?zhèn)溆谩?/p>

表3 POR同源擴(kuò)增引物序列

無(wú)縫克隆構(gòu)建重組質(zhì)粒:將擴(kuò)增正確的POR基因PCR產(chǎn)物和線性化pcDNA3.1(+)/myc-His B載體,按片段∶載體摩爾比=5∶1的比例混合,加入2×Seamless Cloning Mix,終體積為10 μL,50 ℃連接30 min,隨后將重組連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。使用pcDNA3.1(+)/myc-His B載體通用引物T7和BGH rev,對(duì)轉(zhuǎn)化后平板上菌落挑單,進(jìn)行菌落PCR鑒定。擴(kuò)大培養(yǎng)陽(yáng)性菌落,抽提質(zhì)粒交由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。將測(cè)序正確的菌落擴(kuò)大培養(yǎng),抽提質(zhì)粒備用。

1.2.7POR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及篩選

依照Lipofectamine 3000試劑盒說(shuō)明向LO2細(xì)胞及LO2 PORKO細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/myc-His B-POR。轉(zhuǎn)染48 h后,采用500 μg·mL-1遺傳霉素(G-418)對(duì)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞進(jìn)行抗性篩選,14 d為一個(gè)篩選周期,獲取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的LO2 POROE、LO2 PORCO細(xì)胞系。

1.2.8 LO2 PORKO、LO2 PORCO、LO2 POROE細(xì)胞系的蛋白質(zhì)印跡鑒定

收集野生型LO2、LO2 PORKO、LO2 PORCO及LO2 POROE細(xì)胞,分別提取總蛋白。通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,然后轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,室溫封閉1 h后,使用POR(1∶1 000稀釋)和GAPDH(1∶5 000稀釋)抗體孵育過(guò)夜,再用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h后,用ECL發(fā)光法進(jìn)行顯色并拍照。

1.2.9 AFB1染毒LO2細(xì)胞及IC50值測(cè)定

野生型LO2細(xì)胞按密度為每孔每100 μL 3×104個(gè)細(xì)胞接種。根據(jù)CCK-8試劑盒的檢測(cè)方法,設(shè)置6個(gè)試驗(yàn)組,分別為4 μmol·L-1、8 μmol·L-1、16 μmol·L-1及32 μmol·L-1的AFB1染毒組,試劑孔組和對(duì)照孔組。每個(gè)組設(shè)定6個(gè)復(fù)孔,重復(fù)3次。處理24 h或48 h后測(cè)定D450,根據(jù)式(1)計(jì)算存活率,繪制劑量-效應(yīng)曲線,并使用SPSS 27.0軟件計(jì)算IC值,為后續(xù)研究中確定合適的AFB1染毒濃度和時(shí)間提供依據(jù)。

細(xì)胞存活率(%)=

(1)

1.2.10 光鏡下細(xì)胞形態(tài)觀察

將野生型LO2、LO2 PORKO、LO2 PORCO及LO2 POROE細(xì)胞分別以每孔每2 mL含1×106個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,融合度為90%時(shí)進(jìn)行AFB1染毒,然后于光學(xué)顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化并拍照記錄。

1.2.11 AFB1染毒后細(xì)胞存活率測(cè)定

將野生型LO2、LO2 PORKO、LO2 PORCO、LO2 POROE細(xì)胞以每孔每100 μL含3×104個(gè)細(xì)胞的密度接種。參照1.2.9節(jié)中的分組辦法及確定的染毒條件進(jìn)行染毒處理與細(xì)胞存活率檢測(cè)。

1.2.12 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析方法

（1）評(píng)價(jià)主體多元化。參與課程考核評(píng)價(jià)活動(dòng)的主體除了教師外，還應(yīng)該包括學(xué)生、企業(yè)行業(yè)專家、課程研究學(xué)者、專職評(píng)價(jià)機(jī)構(gòu)等人員。

采用GraphPad Prism 9.0與Microsoft Office 2016中Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及繪圖。所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式呈現(xiàn),根據(jù)需要采用t檢驗(yàn)或雙因素方差分析(Two-way ANOVA)進(jìn)行差異顯著性分析,P<0.05被認(rèn)為差異有顯著性。*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,****表示P<0.000 1,ns表示P>0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 lentiCRISPR v2-sgRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果

lentiCRISPR v2質(zhì)粒信息部分示意圖及sgRNA插入位置見(jiàn)圖1-A;兩條sgRNA序列,分別為sgRNA-1和sgRNA-2,其序列信息見(jiàn)圖1-B,序列末端“TGG”為PAM識(shí)別位點(diǎn);lentiCRISPR v2-sgRNA重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖1-C,其中v2-sgRNA-2結(jié)果為反義鏈序列(5′→3′)。

A,lentiCRISPR v2質(zhì)粒信息部分示意圖及sgRNA插入位置;B,sgRNA序列及靶位點(diǎn)示意圖;C,lentiCRISPR v2-sgRNA重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果。A, lentiCRISPR v2 plasmid information partial schematic diagram and sgRNA insertion location; B, sgRNA sequence and target site diagram; C, lentiCRISPR v2-sgRNA recombinant plasmid sequencing results.

2.2 LO2 PORKO單克隆細(xì)胞株的鑒定

對(duì)分別采用sgRNA-1與sgRNA-2靶位點(diǎn)得到的LO2 PORKO單克隆細(xì)胞株進(jìn)行測(cè)序鑒定,并與POR基因序列和靶序列進(jìn)行比對(duì)。測(cè)序峰圖如圖2-A所示;圖2-B為序列比對(duì)結(jié)果。結(jié)果顯示:與LO2細(xì)胞相比,細(xì)胞株sgRNA-1-POR基因靶位點(diǎn)序列中第18位單堿基“T”敲除;而細(xì)胞株sgRNA-2-POR的基因靶位點(diǎn)序列的最后3個(gè)堿基發(fā)生突變(由“C”突變?yōu)椤癟”),而后導(dǎo)致靶位點(diǎn)后連續(xù)10個(gè)堿基(TGGTGGTTTT)敲除,編輯效率較靶位點(diǎn)sgRNA-1高。此后選取靶位點(diǎn)sgRNA-2的POR敲除細(xì)胞進(jìn)一步檢測(cè)POR蛋白表達(dá)水平(圖4)。

A,LO2 PORKO細(xì)胞測(cè)序峰圖;B,LO2 PORKO細(xì)胞序列比對(duì)圖。A, LO2 PORKO cell sequencing peak map; B, LO2 PORKO cell sequence comparison map.

2.3 pcDNA3.1(+)/myc-His B-POR重組質(zhì)粒的構(gòu)建

圖3-A為pcDNA3.1(+)/myc-His B質(zhì)粒部分信息及POR目的片段插入位點(diǎn)示意圖;圖3-B為以LO2細(xì)胞cDNA為模板擴(kuò)增的POR同源片段電泳結(jié)果,片段大小約為2 088 bp;圖3-C為重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后菌落PCR鑒定的電泳結(jié)果;圖3-D為陽(yáng)性菌落測(cè)序峰圖及測(cè)序后與POR序列比對(duì)的結(jié)果。

A,pcDNA3.1(+)/myc-His B質(zhì)粒部分信息示意圖及POR片段插入位點(diǎn);B,以LO2細(xì)胞cDNA為模板擴(kuò)增的POR同源片段,1為DNA marker,2為目的片段;C,菌落PCR鑒定電泳圖,1為DNA marker,2～4為陽(yáng)性菌落;D,陽(yáng)性菌落測(cè)序比對(duì)結(jié)果。A, pcDNA3.1(+)/myc-His B plasmid partial information schematica and insertion site of POR target fragment; B, POR homologous fragment amplified in LO2 cell cDNA as template,1 is DNA marker,2 is the target fragment; C, PCR electrophoretic map of colony identification, 1 is DNA marker, 2-4 is positive colony; D, Sequencing results of positive colonies.

2.4 LO2 PORKO、LO2 PORCO、LO2 POROE細(xì)胞系的蛋白質(zhì)印跡鑒定

以野生型LO2細(xì)胞為對(duì)照,用蛋白質(zhì)印跡(Western blot, WB)技術(shù)鑒定各細(xì)胞系中POR蛋白表達(dá)情況。GAPDH蛋白大小為36 ku。對(duì)于LO2 PORKO細(xì)胞,根據(jù)2.2節(jié)中所得測(cè)序結(jié)果,整理獲得野生型LO2細(xì)胞的POR序列及編輯后的序列,使用在線網(wǎng)站(http://www.bio-soft.net/sms/)對(duì)序列進(jìn)行翻譯,得到氨基酸序列并比對(duì)(圖4)。POR靶位點(diǎn)處發(fā)生3個(gè)堿基的突變(C→T)及后續(xù)產(chǎn)生了10個(gè)堿基的缺失,導(dǎo)致了POR基因無(wú)法正常翻譯,自sgRNA靶位點(diǎn)后氨基酸翻譯錯(cuò)碼,同源性極低,因此LO2 PORKO細(xì)胞泳道中未見(jiàn)蛋白條帶。pcDNA3.1(+)/myc-His B-POR重組質(zhì)粒由于其所帶myc與6×His標(biāo)簽,經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后表達(dá)的POR蛋白大小為80.4 ku,而內(nèi)源性POR蛋白大小為77 ku。因此,LO2 PORCO細(xì)胞中POR蛋白條帶位置略高于野生型LO2細(xì)胞,LO2 POROE細(xì)胞泳道中則為80.4 ku與77 ku大小的POR蛋白同時(shí)存在。

以LO2細(xì)胞為對(duì)照,WB檢測(cè)LO2 PORKO、LO2 PORCO及LO2 POROE細(xì)胞中POR蛋白表達(dá)情況,并對(duì)LO2 PORKO細(xì)胞中氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。With LO2 cells as the control, WB detected the expression of POR protein in LO2 PORKO, LO2 PORCO and LO2 POROE cells, and the amino acid sequences in LO2 PORKO cells were analyzed.

2.5 AFB1染毒LO2細(xì)胞后的IC50值

用4 μmol·L-1、8 μmol·L-1、16 μmol·L-1及32 μmol·L-1AFB1分別處理LO2細(xì)胞24 h及48 h后,與對(duì)照組相比,隨著AFB1濃度與作用時(shí)間的增加,LO2細(xì)胞存活率降低(圖5);表明AFB1染毒后會(huì)引起LO2細(xì)胞死亡,且LO2細(xì)胞存活率與AFB1呈染毒濃度及時(shí)間依賴關(guān)系。

圖5 AFB1對(duì)野生型LO2細(xì)胞劑量效應(yīng)曲線Fig.5 The toxic dose-effect curve of AFB1on the relative cell viability of wild-type LO2 cell lines

AFB1處理LO2細(xì)胞后分析所得IC值見(jiàn)表4。24 h時(shí)IC50值為339.97 μmol·L-1;48 h時(shí)IC50值為4.28 μmol·L-1。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,在綜合考慮AFB1對(duì)LO2細(xì)胞有明顯的毒性效應(yīng),又保證細(xì)胞有一定的存活率且不采用過(guò)高的染毒濃度的情況下,后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用48 h時(shí)的近似IC50值(4 μmol·L-1)及2倍IC50值(8 μmol·L-1)的AFB1處理細(xì)胞48 h。

表4 IC值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.6 AFB1處理后的細(xì)胞形態(tài)

根據(jù)2.5節(jié)所確定的AFB1染毒濃度與時(shí)間,以0 μmol·L-1、4 μmol·L-1及8 μmol·L-1AFB1處理48 h后觀察細(xì)胞形態(tài)。如圖6所示,0 μmol·L-1AFB1處理后的野生型LO2細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,大小均一,生長(zhǎng)正常,只有少量細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)液中死亡后漂浮。而隨著AFB1濃度的升高,細(xì)胞形態(tài)改變,間隙擴(kuò)大,數(shù)量與密度減少,貼壁性減弱;胞間連接逐漸消失變圓、空泡化、脫落等,有大量死亡細(xì)胞漂浮,與對(duì)照組相比變化明顯。LO2 POROE對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,經(jīng)AFB1處理后同樣出現(xiàn)形態(tài)改變、死亡及漂浮現(xiàn)象,貼壁細(xì)胞相較于同濃度下的野生型LO2細(xì)胞更少。而LO2 PORKO細(xì)胞在AFB1處理前后并無(wú)明顯差別,4 μmol·L-1與8 μmol·L-1AFB1處理組之間也無(wú)明顯變化。相較于LO2 PORKO細(xì)胞,LO2 PORCO在AFB1處理后死亡,呈濃度依賴性;但相比于野生型LO2細(xì)胞,同濃度下AFB1處理后的LO2 PORCO細(xì)胞死亡數(shù)量較少,貼壁細(xì)胞更多。結(jié)果表明POR基因能夠?qū)FB1在LO2細(xì)胞上的毒性產(chǎn)生影響,并再次證明LO2 PORKO、LO2 PORCO、LO2 POROE細(xì)胞構(gòu)建成功。

圖6 AFB1作用48 h對(duì)細(xì)胞形態(tài)特征的影響(100×)Fig.6 Effect of morphological characteristics on cells after 48 h treated with AFB1under optical microsope (100×)

2.7 細(xì)胞存活率

AFB1處理48 h后野生型LO2、LO2 PORKO、LO2 PORCO及LO2 POROE細(xì)胞存活率。各濃度下不同細(xì)胞株組與各自陰性對(duì)照組比較,**,P<0.01;***,P<0.001;ns, P>0.05;各濃度下不同細(xì)胞株組與同等濃度AFB1作用下的LO2細(xì)胞組相比,*,P<0.05;**,P<0.01;****,P<0.000 1。The cell viability of LO2, LO2 PORKO, LO2 PORCO and POROE cells treated with AFB1for 48 hours. Different cell lines at different concentrations were compared with negative control groups, **, P<0.01; ***, P<0.001; ns, P>0.05. Compared with LO2 cell group under the same concentration of AFB1, *, P<0.05; **, P<0.01; ****, P<0.000 1.

各濃度下不同細(xì)胞株組與同等濃度AFB1作用下的LO2細(xì)胞組相比:相比于同等濃度AFB1作用下的野生型LO2細(xì)胞,LO2 PORKO細(xì)胞各濃度組細(xì)胞存活率均顯著高于野生型LO2細(xì)胞染毒組(P<0.000 1)。表明POR基因敲除后,AFB1對(duì)LO2細(xì)胞毒性作用減弱。而LO2 PORCO細(xì)胞存活率變化趨勢(shì)與野生型LO2細(xì)胞相同,但仍顯著高于野生型LO2細(xì)胞(P<0.05),表明POR基因回補(bǔ)后,LO2細(xì)胞經(jīng)AFB1處理后致死的效應(yīng)部分恢復(fù)。與同等濃度AFB1作用下的野生型LO2細(xì)胞相比,LO2 POROE細(xì)胞各濃度組細(xì)胞存活率均顯著降低。表明在LO2細(xì)胞中,POR基因確實(shí)參與了AFB1的肝細(xì)胞毒性效應(yīng),且POR的表達(dá)量與AFB1對(duì)LO2細(xì)胞的毒性作用呈正相關(guān)關(guān)系。

3 討論

為深入研究POR蛋白功能,近年來(lái)已有一些POR基因敲除的動(dòng)物及細(xì)胞模型報(bào)道。動(dòng)物模型中,可能是由于小鼠體內(nèi)參與生物合成和代謝膽固醇的P450酶缺少電子轉(zhuǎn)移體,POR基因敲除的小鼠在胚胎期即致死,限制了在動(dòng)物整體水平上對(duì)POR功能進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究[10]。在細(xì)胞模型方面,目前已有報(bào)道的肝POR基因敲除細(xì)胞系包括人肝癌HepG2細(xì)胞[11-12]、小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1c1c7[13]等,為肝臟異生素代謝的研究提供了材料。但常用于研究肝細(xì)胞癌代謝與治療的肝癌細(xì)胞系HepG2不僅在基因與蛋白表達(dá)方面不同于正常肝細(xì)胞系[14-15],在藥物及異生素代謝方面也存在相當(dāng)大的差異[3,16-17]。在肝功能體外細(xì)胞研究中,選用正常肝細(xì)胞,如人肝細(xì)胞LO2比癌細(xì)胞株更能模擬體內(nèi)環(huán)境,符合生理特點(diǎn),能夠得到更為準(zhǔn)確的數(shù)據(jù),但POR基因在LO2細(xì)胞上的敲除模型尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,選擇CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建POR基因敲除LO2細(xì)胞株,對(duì)于研究POR在肝細(xì)胞中的功能具有重要意義。

目前CRISPR/Cas9技術(shù)已在堿基編輯、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和表觀遺傳編輯、基因組規(guī)模篩選等方面得到廣泛應(yīng)用[18-19]。同時(shí),利用CRISPR/Cas9技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)許多應(yīng)用,包括快速生成細(xì)胞和動(dòng)物模型、功能基因組篩選和細(xì)胞基因組的實(shí)時(shí)成像[20]。如在體內(nèi)動(dòng)物模型和體外在體細(xì)胞和生殖系統(tǒng)細(xì)胞中成功調(diào)節(jié)致病等位基因,為臨床治療性基因組編輯作出貢獻(xiàn)[21]。目前已有許多應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行基因編輯的研究報(bào)道:如耿夢(mèng)雅等[22]利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除人肝臟細(xì)胞HL7702的Sidt2基因;Hendriks等[23]描述了在人類胎兒肝細(xì)胞中使用CRISPR/Cas9生成基因敲除細(xì)胞的方法;Lv等[24]在研究中使用了Nrf2基因敲除的HepG2肝癌細(xì)胞株;Lee等[25]利用CRISPR/Cas9下調(diào)了Huh7和Hep3B細(xì)胞株中的HGF基因。

本實(shí)驗(yàn)利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建敲除POR基因的LO2細(xì)胞,參考基因組信息,利用在線工具網(wǎng)站,對(duì)POR的15個(gè)外顯子序列進(jìn)行sgRNA引物設(shè)計(jì)打分,選擇兩個(gè)綜合排名靠前的序列設(shè)計(jì)引物并構(gòu)建慢病毒質(zhì)粒,并預(yù)測(cè)無(wú)脫靶效應(yīng)。在嘌呤霉素篩選陽(yáng)性細(xì)胞后直接進(jìn)行單克隆細(xì)胞篩選,后續(xù)再進(jìn)行測(cè)序鑒定及蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證敲除結(jié)果,極大地縮短了實(shí)驗(yàn)周期和節(jié)省試劑耗材,并且蛋白水平上的變化更能反映POR的敲除效果。lentiCRISPR v2-sgRNA-2質(zhì)粒經(jīng)克隆測(cè)序及蛋白質(zhì)印跡法鑒定顯示敲除效果較好,該組細(xì)胞的DNA與野生型LO2細(xì)胞對(duì)比,發(fā)生了3 bp堿基突變及靶位點(diǎn)后10 bp堿基敲除,導(dǎo)致POR基因無(wú)法正常轉(zhuǎn)錄,自sgRNA靶位點(diǎn)后氨基酸翻譯錯(cuò)碼,POR蛋白不能正常表達(dá),POR抗體難以識(shí)別。說(shuō)明sgRNA-2精準(zhǔn)靶向了POR基因,在基因及蛋白水平上均實(shí)現(xiàn)了POR的成功敲除,成功構(gòu)建了POR敲除LO2細(xì)胞模型。此外,相較于條件敲除小鼠模型,利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建POR敲除的LO2細(xì)胞體外模型,更符合“3R”(減少Reduction、替代Replacement、優(yōu)化Refinement)原則,且排除了其他哺乳動(dòng)物與人體的反應(yīng)差異問(wèn)題,得到的結(jié)果更為科學(xué)客觀[26]。

在基因敲除的基礎(chǔ)上,基因回補(bǔ)在理論上能夠恢復(fù)由基因敲除帶來(lái)的表型變化,基因過(guò)表達(dá)則能正向驗(yàn)證基因的功能,進(jìn)行某種基因的回補(bǔ)及過(guò)表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建,對(duì)深入研究該基因的功能至關(guān)重要。在成功構(gòu)建LO2 PORKO細(xì)胞株的基礎(chǔ)上,通過(guò)同源重組法構(gòu)建pcDNA3.1(+)/myc-His B-POR重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染至LO2及LO2 PORKO細(xì)胞株中,經(jīng)G-418篩選及蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)POR蛋白表達(dá)水平,得到穩(wěn)定表達(dá)POR重組蛋白的LO2 PORCO及LO2 POROE細(xì)胞株。pcDNA3.1(+)/myc-His B-POR重組蛋白因pcDNA3.1(+)/myc-His B載體所帶myc及6×His等標(biāo)簽,其蛋白大小(80.4 ku)比LO2野生型細(xì)胞中POR蛋白(77 ku)大3.4 ku。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果表明,POR蛋白成功回補(bǔ)進(jìn)LO2 PORKO細(xì)胞中,蛋白大小與預(yù)期相符合;POR蛋白在LO2細(xì)胞中成功過(guò)表達(dá),說(shuō)明LO2 PORCO及LO2 POROE細(xì)胞系均構(gòu)建成功。

AFB1作為被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)列入的Ⅰ類致癌物,與癌細(xì)胞的增殖和侵襲密切相關(guān)[27]。已有的證據(jù)表明,肝臟是AFB1毒性和生物轉(zhuǎn)化的主要場(chǎng)所,AFB1對(duì)機(jī)體的損傷主要集中在肝臟,可導(dǎo)致肝臟急性或慢性肝細(xì)胞損傷[28]。AFB1的毒性作用和致癌作用與其經(jīng)代謝活化形成活性中間代謝產(chǎn)物AFBO有關(guān),而其在體內(nèi)代謝活化過(guò)程中最主要的代謝酶CYP450s活性的發(fā)揮需要POR、NADPH等輔酶為其提供電子,顯示出POR對(duì)AFB1的細(xì)胞毒性作用有十分重要的影響。因此,以AFB1為例,測(cè)定AFB1處理后的POR基因敲除、回補(bǔ)及過(guò)表達(dá)的LO2細(xì)胞存活率變化以驗(yàn)證各細(xì)胞株的增殖功能,能夠?yàn)楦嘀赂味拘韵嚓P(guān)的毒理研究提供細(xì)胞模型。

選取4 μmol·L-1、8 μmol·L-1、16 μmol·L-1及32 μmol·L-1AFB1分別處理LO2細(xì)胞24 h及48 h,測(cè)定AFB1對(duì)LO2細(xì)胞的劑量效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果表明,AFB1對(duì)LO2細(xì)胞具有明顯的毒性效應(yīng),且LO2細(xì)胞存活率隨著AFB1作用濃度與作用時(shí)間的增加而降低。這符合Liu等[29]及Zhu等[30]對(duì)AFB1在LO2細(xì)胞上的毒性研究結(jié)果。但不同濃度AFB1作用48 h時(shí)細(xì)胞存活率變化比24 h時(shí)更明顯,計(jì)算發(fā)現(xiàn)24 h時(shí)AFB1的IC50值(339.97 μmol·L-1)也遠(yuǎn)高于AFB1處理48 h時(shí)(4.28 μmol·L-1),這與Pauletto等[31]在牛胎肝細(xì)胞衍生細(xì)胞系 (BFH12)中對(duì)AFB1的IC50值測(cè)定結(jié)果一致,即暴露于濃度不斷增加的AFB124 h的細(xì)胞表現(xiàn)出較低的死亡率,而處理48 h后BFH12細(xì)胞的IC50值為6.34 μmol·L-1。因此,根據(jù)IC值測(cè)定的結(jié)果,選取了AFB1濃度4 μmol·L-1及8 μmol·L-1,作用時(shí)間48 h進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn),LO2細(xì)胞經(jīng)AFB1處理后變形、脫落、死亡并漂浮。LO2 PORKO細(xì)胞形態(tài)在AFB1染毒前后并未觀察到明顯變化,初步判定POR基因參與AFB1對(duì)LO2細(xì)胞的毒性作用,且POR基因與AFB1毒性效應(yīng)存在正相關(guān)關(guān)系,隨后對(duì)LO2 PORCO及LO2 POROE細(xì)胞的形態(tài)觀察結(jié)果也表明了這一點(diǎn)。各細(xì)胞株AFB1處理后存活率變化與形態(tài)觀察的結(jié)果相符合:野生型LO2細(xì)胞存活率隨AFB1濃度增加而降低;LO2 PORKO細(xì)胞在4 μmol·L-1及8 μmol·L-1AFB1處理后存活率與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05);LO2 POROE細(xì)胞存活率變化趨勢(shì)與野生型LO2細(xì)胞一致,隨AFB1濃度的增加而降低,但其細(xì)胞存活率比同濃度下野生型LO2細(xì)胞更低,這可能是由于POR蛋白過(guò)表達(dá)后進(jìn)一步促進(jìn)了AFB1對(duì)LO2細(xì)胞的毒性作用;LO2 PORCO細(xì)胞存活率變化趨勢(shì)也與野生型LO2細(xì)胞一致,表明POR基因回補(bǔ)后恢復(fù)了基因敲除帶來(lái)的AFB1對(duì)LO2細(xì)胞毒性的表型變化,但其存活率仍顯著高于野生型LO2細(xì)胞(4 μmol·L-1時(shí)P<0.000 1,8 μmol·L-1時(shí)P<0.01),這可能是因?yàn)長(zhǎng)O2 PORCO細(xì)胞中POR蛋白的回補(bǔ)表達(dá)量未達(dá)到野生型LO2細(xì)胞水平所致,這也顯示了POR基因?qū)FB1所致細(xì)胞毒性的影響巨大。

總之,鑒于POR在參與由細(xì)胞色素P450蛋白催化的類固醇激素、藥物和異生素代謝反應(yīng)方面的重要作用,LO2 PORKO、LO2 PORCO、LO2 POROE細(xì)胞株的成功構(gòu)建及AFB1對(duì)各細(xì)胞株的增殖功能驗(yàn)證,有望為POR基因功能及更多致肝毒性風(fēng)險(xiǎn)因素相關(guān)研究的開(kāi)展提供必備的細(xì)胞模型。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成功敲除LO2細(xì)胞中的POR基因,構(gòu)建LO2 PORKO細(xì)胞株;并通過(guò)同源重組方法構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/myc-His B-POR,經(jīng)轉(zhuǎn)染篩選后分別建立了LO2 PORCO及LO2 POROE細(xì)胞株;最后以AFB1處理各細(xì)胞株,通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞存活率和細(xì)胞形態(tài)的變化初步驗(yàn)證POR基因在AFB1所致LO2細(xì)胞毒性中的影響,為后續(xù)LO2 PORKO、LO2 PORCO、LO2 POROE細(xì)胞株作為相關(guān)毒理研究細(xì)胞模型并深入開(kāi)展POR基因功能的研究提供了相應(yīng)的生物材料。