日本沼蝦樁蛋白基因的克隆與鎘脅迫對(duì)其表達(dá)的影響

彭佳誠,吳 越,徐潔皓,夏美文,齊天鵬,徐海圣,3,*

(1.浙江大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310058; 2.浙江萬里學(xué)院 生物與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,浙江 寧波 315100; 3.浙江大學(xué)湖州市南太湖現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技推廣中心,浙江 湖州 313000)

樁蛋白(paxillin, PXN)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種信號(hào)蛋白,主要位于細(xì)胞與胞外基質(zhì)的黏著斑內(nèi),是黏著斑蛋白的結(jié)合蛋白[1],廣泛參與黏著斑信號(hào)和激酶信號(hào)的傳導(dǎo),在細(xì)胞外信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起“腳手架”作用[2],調(diào)控細(xì)胞的存活、增殖、分化和遷移,在器官的發(fā)育、損傷和感染后修復(fù)過程中有重要作用[3-4]。目前關(guān)于鎘脅迫下PXN基因的相關(guān)研究較少,多聚焦于PXN基因在臨床腫瘤與癌癥中的作用[5]。

日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)又稱為青蝦、河蝦,廣泛分布于我國東部和亞洲其他國家的淡水水域中[6],具有個(gè)體小、繁殖快、易飼養(yǎng)等特點(diǎn),是研究水體重金屬生物毒理的較優(yōu)選擇。鎘(cadmium, Cd)是一種廣泛存在于水環(huán)境中的生物非必需重金屬元素,可在生物體內(nèi)積累[7],并可通過食物鏈進(jìn)行富集[8],引起水生生物的急性或慢性中毒[9],造成畸變甚至死亡,是水環(huán)境中的主要污染物之一,已引起全球的關(guān)注[10]。研究表明,鎘可導(dǎo)致生物體的形態(tài)破壞、生化改變和生理功能障礙等,還可引起機(jī)體活性氧積累,從而導(dǎo)致生物功能和細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損[11]。

本文采用分子生物學(xué)方法從日本沼蝦肝胰腺組織中克隆了樁蛋白基因,并研究了鎘脅迫對(duì)其表達(dá)的影響,研究結(jié)果將有助于更好地了解鎘污染對(duì)日本沼蝦的分子毒性作用,為水環(huán)境鎘污染的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警和評(píng)估提供生物標(biāo)志物選擇的基線信息。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

日本沼蝦購自浙江省杭州市某水產(chǎn)養(yǎng)殖公司,平均體重(1.97±0.72)g,平均體長(5.59±0.57)cm。實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)于配備循環(huán)水過濾系統(tǒng)的12 L塑料水桶中,用增氧泵充氧,水溫(20.9±0.7)℃,每隔24 h換水。暫養(yǎng)3 d后,隨機(jī)挑選健康且規(guī)格一致的個(gè)體備用。

1.2 RNA提取與cDNA合成

解剖后取肝胰腺組織,使用RNAiso Plus試劑盒(TaKaRa Bio, JPN)提取總RNA,使用Nanodrop 2000分光光度計(jì)和1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的純度和完整性,按照PrimeScriptTMRT-PCR Kit (TaKaRa Bio, JPN) 試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 MnPXN基因克隆與序列分析

在本實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)建的日本沼蝦肝胰腺轉(zhuǎn)錄組中找到相應(yīng)基因片段,利用Primer 5.0軟件分別設(shè)計(jì)MnPXN基因5′RACE和3′RACE特異性引物(表1),進(jìn)行5′和3′末端巢式PCR擴(kuò)增。PCR程序?yàn)?4 ℃ 30 s,68 ℃ 30 s,72 ℃ 3 min,30個(gè)循環(huán)。RACE實(shí)驗(yàn)所用的試劑盒為RACE試劑盒SMARTer? RACE 5′/3′ Kit(TaKaRa,Cat. No. 634858),以F1/R1的擴(kuò)增產(chǎn)物作為F2/R2的模板依次進(jìn)行擴(kuò)增;使用RACE試劑盒附帶的NuceloSpin Gel and PCR Clean-Up Kit試劑盒進(jìn)行膠純化。PCR產(chǎn)物利用pMDTM19T Vector Cloning Kit試劑盒連接至pMD19-T載體,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌后篩選陽性克隆,送杭州尚亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序。利用生物信息學(xué)在線工具分析MnPXN基因,在NCBI上查找開放閱讀框,分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),推導(dǎo)氨基酸序列,利用Clustal-Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)進(jìn)行氨基酸序列比對(duì),用Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1 基因克隆所用引物

1.4 MnPXN的組織表達(dá)分析

用加入50%抗凝劑(檸檬酸24.98 mmol·L-1,檸檬酸鈉51.15 mmol·L-1,葡萄糖81.59 mmol·L-1,NaCl 20.53 mmol·L-1)的注射器從日本沼蝦游泳足基部的血腔處共抽取血淋巴500 μL,4 ℃、4 000 r·min-1離心5 min,棄上清,即為血細(xì)胞;再分別取其心臟、肌肉、神經(jīng)、腸、肝胰腺、胃、鰓等組織,放入液氮中速凍并保存在-80 ℃冰箱中備用。

按照1.2節(jié)方法從組織中提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)克隆的MnPXN序列,使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR特異性引物(表1)。以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因,使用LightCycler480Ⅱ(Roche,480Ⅱ)進(jìn)行qRT-PCR,程序設(shè)置:95℃ 30 s,95℃ 15 s,60℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次。

1.5 鎘脅迫對(duì)MnPXN mRNA表達(dá)的影響

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得氯化鎘(99%,URChem,上海)處理日本沼蝦24 h和96 h的半致死濃度(LC50)分別為0.242 7 mg·L-1和0.027 7 mg·L-1。隨機(jī)選取450只健康日本沼蝦,平均分為6組,氯化鎘質(zhì)量濃度分別為0.242 7 mg·L-1(24 h-LC50組)、0.121 4 mg·L-1(1/2 24 h-LC50組)、0.061 0 mg·L-1(1/4 24 h-LC50組)、0.030 0 mg·L-1(1/8 24 h-LC50組)、0.015 0 mg·L-1(1/16 24 h-LC50組)和0 mg·L-1(對(duì)照組),每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。日本沼蝦養(yǎng)殖于配備增氧泵和循環(huán)水過濾系統(tǒng)的120 L塑料水箱中,水溫(20.9±0.7)℃,暫養(yǎng)3 d,每隔24 h換水。于脅迫24 h后,解剖取肝胰腺。另隨機(jī)選取150只健康日本沼蝦,平均分為2組,實(shí)驗(yàn)組加入CdCl2至終濃度為0.020 0 mg·L-1,對(duì)照組加入等量清水,每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。分別于0、3、6、12、24、48、72、96 h取樣,解剖取肝胰腺。按照1.2節(jié)方法從肝胰腺中提取總RNA,并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照1.4節(jié)方法進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。

1.6 體內(nèi)siRNA干擾

根據(jù)克隆的MnPXN基因序列,采用Promega公司的RNA干擾試劑盒T7 RiboMAXTMExpress RNAi System合成dsRNA,以綠色熒光蛋白(GFP)基因作為陰性對(duì)照。隨機(jī)選取100只健康日本沼蝦,平均分為2組,設(shè)置dsRNA-MnPXN注射組為實(shí)驗(yàn)組,dsRNA-GPF為對(duì)照組,利用100 μL微量注射器將上述基因的dsRNA分別從日本沼蝦第四、五腹節(jié)肌肉注射至體內(nèi),每只注射50 μL。注射48、72 h后,每組分別隨機(jī)取5尾日本沼蝦,取其肝胰腺組織,以β-actin作為內(nèi)參基因,利用qRT-PCR檢測(cè)的RNA干擾效率。RNA干擾48 h后,將dsRNA-MnPXN實(shí)驗(yàn)組與dsRNA-GFP對(duì)照組分別置于含0.020 0 mg·L-1氯化鎘的水體中,每隔6 h分別統(tǒng)計(jì)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組日本沼蝦的死亡個(gè)體數(shù),計(jì)算死亡率。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用2-ΔΔCT法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量,利用Origin8.0軟件的one-way analysis of variance(ANOVA)和t-test對(duì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著(*),P<0.01時(shí)認(rèn)為差異極顯著(**),P<0.001時(shí)認(rèn)為差異極顯著(***)。

2 結(jié)果與分析

2.1 MnPXN基因序列分析

使用RACE技術(shù)克隆得到日本沼蝦MnPXN的cDNA,其序列全長為3 655 bp(NCBI GenBank, MN728558),包括1 491 bp的編碼區(qū),235 bp的5′非編碼區(qū),1 885 bp的3′非編碼區(qū)和44 bp的poly(A)尾。MnPXN基因編碼496個(gè)氨基酸,蛋白質(zhì)分子量為54.02 ku,等電點(diǎn)為5.07,N末端無信號(hào)肽,具有6個(gè)低復(fù)雜區(qū)域(low complexity)和3個(gè)保守的LIM結(jié)構(gòu)域,LIM結(jié)構(gòu)域分別位于第311～362個(gè)氨基酸、第370～421個(gè)氨基酸和第429～480個(gè)氨基酸(圖1)。Phyre 2在線軟件分析發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)存在12%的α螺旋結(jié)構(gòu)和15%的β折疊結(jié)構(gòu)。

Clustal-Omega在線比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),MnPXN與凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)、家蠶(Bombyxmori)、智人(Homosapiens)、小鼠(Musmusculus)、斑馬魚(Daniorerio)的PXN序列高度保守,其中智人、小鼠、斑馬魚、凡納濱對(duì)蝦有4個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域,而日本沼蝦、家蠶只有3個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域。用neighbor-joining(NJ)法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果顯示,MnPXN與甲殼動(dòng)物(凡納濱對(duì)蝦)聚成一支,與昆蟲(家蠶、赤擬谷盜)的親緣關(guān)系較近,其次是魚類(斑馬魚)、鳥類(原雞)、兩棲類(高山倭蛙、非洲爪蟾)、哺乳類(小鼠、智人),與線蟲(秀麗隱桿線蟲)親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖2)。

圖2 MnPXN與其他物種PXN蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic analysis of MnPXN with PXN protein from other species

2.2 MnPXN基因的組織表達(dá)特征

qRT-PCR結(jié)果顯示,MnPXN基因在日本沼蝦的心臟、肌肉、神經(jīng)、腸、血細(xì)胞、肝胰腺、胃和鰓8種組織中均有分布,其中在肝胰腺、胃、鰓中表達(dá)水平較高,在心臟和肌肉中表達(dá)水平較低(圖3)。

“*”表示表達(dá)水平與心臟組相比差異顯著(P<0.05);“**”表示差異極顯著(P<0.01);“***”表示差異極顯著(P<0.001).“*” indicates that the expression level of this group is significantly different from that of the heart group (P<0.05); “**” indicates significant difference at 0.01 level; “***” indicates significant difference at 0.001 level.

2.3 鎘脅迫對(duì)MnPXN基因表達(dá)的影響

分別用0.242 7、0.121 4、0.061 0、0.030 0、0.015 0 mg·L-1CdCl2脅迫日本沼蝦24 h后,其肝胰腺中MnPXN基因表達(dá)水平較對(duì)照組均顯著升高,其中0.061 0 mg·L-1CdCl2和0.030 0 mg·L-1CdCl2處理的MnPXN基因表達(dá)水平最高,極顯著(P<0.001)高于對(duì)照組;0.121 4、0.015 0 mg·L-1CdCl2處理的MnPXN基因表達(dá)水平次之,也極顯著(P<0.01)高于對(duì)照組;0.242 7 mg·L-1CdCl2處理的MnPXN基因表達(dá)水平顯著(P<0.05)高于對(duì)照組(圖4-A)。

“*”表示差異顯著(P<0.05);“**”表示差異極顯著(P<0.01);“***”表示差異極顯著(P<0.001)。下同?！?” indicates significant difference at 0.05 level; “**” indicates significant difference at 0.01 level; “***” indicates significant difference at 0.001 level. The same as below.

用0.020 0 mg·L-1CdCl2(亞致死濃度)脅迫日本沼蝦,脅迫6 h后MnPXN基因表達(dá)水平顯著升高,24 h表達(dá)水平達(dá)到最高,極顯著(P<0.001)高于對(duì)照組,隨后逐漸下降,脅迫96 h時(shí),MnPXN基因表達(dá)水平與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)(圖4-B)。

2.4 體內(nèi)RNA干擾

RNAi持續(xù)48 h和72 h后,MnPXN基因mRNA表達(dá)水平均較GFP顯著下降(P<0.05),(圖5-A),表明dsRNA對(duì)MnPXN基因的干擾是有效的。注射dsRNA-MnPXN實(shí)驗(yàn)組日本沼蝦的死亡率顯著(P<0.001)高于注射dsRNA-GFP組,且于干擾后72 h全部死亡(圖5-B)。

圖5 RNA干擾對(duì)MnPXN基因表達(dá)和日本沼蝦存活率的影響Fig.5 Effect of RNA interference on MnPXN gene expression and survival rate of Macrobrachium nipponense

3 討論

PXN是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)銜接蛋白,主要位于黏著斑處,參與細(xì)胞附著、擴(kuò)散和遷移所需的黏著斑的組裝和拆卸,在整合素與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合后觸發(fā)的細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng)中起重要作用[1,2]。目前,PXN的同源基因在智人(H.sapiens)、小鼠(M.musculus)、斑馬魚(D.rerio)等物種中被克隆出來[12-14],在一些模式動(dòng)物如黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)的高通量測(cè)序中被報(bào)告[15],但在水生甲殼動(dòng)物中尚未見報(bào)道。

本研究中,我們克隆得到了日本沼蝦PXN基因(MnPXN)的cDNA序列,其全長為3 655 bp,編碼496個(gè)氨基酸,蛋白質(zhì)序列中含有6個(gè)低復(fù)雜區(qū)域和3個(gè)保守的LIM結(jié)構(gòu)域。不同物種PXN的LIM結(jié)構(gòu)域數(shù)目不同,日本沼蝦、家蠶有3個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域,而智人、小鼠、斑馬魚和凡納濱對(duì)蝦含有4個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域。LIM結(jié)構(gòu)域是高度保守的鋅指結(jié)合、半胱氨酸富集的基序,含有2個(gè)串聯(lián)的重復(fù)鋅指,不僅介導(dǎo)樁蛋白定位于黏著斑,而且介導(dǎo)多種蛋白質(zhì)之間的相互作用[16]。同源性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示,MnPXN與凡納濱對(duì)蝦相似度達(dá)到79%,與同為節(jié)肢動(dòng)物門的昆蟲如家蠶、赤擬谷盜的同源性為62%,與脊椎動(dòng)物中的哺乳類、鳥類、兩棲類、魚類的同源性也達(dá)到了57%以上,表明PXN蛋白在進(jìn)化上高度保守,物種之間具有高度同源性。

肝胰腺作為甲殼類體內(nèi)重要器官,參與體內(nèi)消化、貯存、分泌促生長物質(zhì)、解毒與免疫等多種生理功能[17]。0.015 0 mg·L-1CdCl2處理24 h,日本沼蝦肝胰腺M(fèi)nPXN基因轉(zhuǎn)錄水平較對(duì)照組顯著升高,0.061 0～0.242 7 mg·L-1CdCl2處理24 h后MnPXN轉(zhuǎn)錄水平呈下降趨勢(shì),但均顯著高于對(duì)照組,表明日本沼蝦肝胰腺M(fèi)nPXN基因能夠感知水體低濃度鎘離子刺激,而且其響應(yīng)模式與脅迫時(shí)間相關(guān)。在亞致死濃度鎘脅迫96 h后,肝胰腺中MnPXN的mRNA水平出現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢(shì),于6 h開始顯著高于對(duì)照組,并于24 h達(dá)到最高值,96 h恢復(fù)至起始水平,與對(duì)照組差異不明顯,表明在此濃度下脅迫24 hMnPXN響應(yīng)最強(qiáng)烈,后續(xù)的脅迫過程使該組織逐漸適應(yīng)了一定濃度的鎘離子環(huán)境。

為更好地理解鎘脅迫對(duì)MnPXN基因的影響,以GFP基因作為陰性對(duì)照,進(jìn)行了MnPXN基因的RNA干擾實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,肌肉注射MnPXN特異雙鏈RNA后,日本沼蝦肝胰腺中MnPXN基因表達(dá)水平顯著降低。MnPXN基因沉默后,用0.020 0 mg·L-1CdCl2脅迫72 h,日本沼蝦死亡率達(dá)到100%,而GFP對(duì)照組死亡率為36%,差異極顯著。已有研究表明,鎘脅迫可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生活性氧(ROS),過量的ROS導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化等氧化損傷[18]。脅迫下MnPXN基因表達(dá)水平呈在低濃度時(shí)升高、在高濃度時(shí)下降的特點(diǎn),引起這種現(xiàn)象的原因可能是輕度應(yīng)激引發(fā)刺激或有益的反應(yīng)[19],而重度應(yīng)激抑制了基因表達(dá)并對(duì)組織造成損傷或致使細(xì)胞壞死[20]。本實(shí)驗(yàn)中,0.015 0 mg·L-1CdCl2脅迫就能引起MnPXN基因表達(dá)水平上調(diào),表明MnPXN基因可作為日本沼蝦受水體中鎘脅迫的敏感生物標(biāo)志物。