不同濾材對鹽酸小檗堿片含量測定結(jié)果的影響

張碧珊

（廣州市藥品檢驗所，廣東 廣州 510160）

鹽酸小檗堿（Berberine Hydrochloride），CAS 號為633-65-8，為5,6-二氫-9,10-二甲氧苯并[g]-1,3-苯并二氧戊環(huán)[5,6-α]喹嗪鹽酸鹽二水合物，為黃色結(jié)晶性粉末，無臭?，F(xiàn)行《中國藥典》2020 年版收載的相關(guān)制劑有鹽酸小檗堿膠囊和鹽酸小檗堿片[1]。其中，鹽酸小檗堿片作為抗菌藥，臨床上主要用于治療胃腸炎和痢疾桿菌、大腸桿菌引起的腸道感染[2-3]。同時，鹽酸小檗堿具有降低尿酸水平和緩解關(guān)節(jié)紅腫熱痛等癥狀的作用，臨床上也常作為聯(lián)合用藥用于治療痛風(fēng)[4]。經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，鹽酸小檗堿還有抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化、抗內(nèi)皮損傷、抗腫瘤、抗高血壓、降血糖和降血脂等確切的藥理作用[5]。

過濾是樣品進行液相色譜分析前的主要處理手段之一，其目的在于：一是獲得澄清液體，除去樣品中不溶顆粒，以免堵塞液相色譜系統(tǒng)管路和液相色譜柱；二是避免因顆粒物引起摩擦，導(dǎo)致液相色譜基線的波動，造成系統(tǒng)重復(fù)性差；三是除去樣品中的氣泡，避免造成儀器壓力波動和引入系統(tǒng)干擾，以確保樣品測定的準(zhǔn)確性。

目前，已有多篇文獻(xiàn)研究報道，過濾材質(zhì)對部分藥物存在吸附作用。經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，濾膜對部分藥物，包含利福平、阿司匹林、吡羅昔康、格列齊特、羅紅霉素、阿奇霉素、非洛地平緩釋片、克拉霉素片和黃芩苷等在內(nèi)，均存在一定的吸附作用，嚴(yán)重影響樣品測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性[6-9]。本文主要是考察雙圈濾紙、Whatman 濾紙和濾膜（孔徑0.8 μm）三種不同濾材對鹽酸小檗堿片含量測定結(jié)果的影響。

1 儀器與試劑

儀器：Agilent 1260 高效液相色譜儀，梅特勒XS105 DualRange 天平，Eppendorf Centrifuge 5810R 高速離心機，超聲波清洗機。

試劑：鹽酸小檗堿（來源：中檢院，批號：110713-202015，含量：85.9%），鹽酸小檗堿片（廠家A，來源：廣東華南藥業(yè)集團有限公司，批號：200602，規(guī)格：100 mg/片），鹽酸小檗堿片（廠家B，來源：東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，批號：2200511，規(guī)格：100 mg/片），鹽酸小檗堿片（廠家C，來源：四川森科制藥有限公司，批號：210202，規(guī)格：100 mg/片），超純水，三乙胺和磷酸二氫鉀購于廣州化學(xué)試劑廠，庚烷磺酸鈉購于上海安譜實驗科技股份有限公司。

過濾材質(zhì)：雙圈定量濾紙[來源：通用電氣生物科技（杭州）有限公司，型號：中速202，規(guī)格：12.5 cm，批號：16998173]（下文簡稱雙圈濾紙）， Grade 2V 濾紙（來源：Whatman 公司，型號：Grade 2V 1202-185，規(guī)格：18.5 cm，孔徑8 μm，批號：A10103604）（下文簡稱Whatman 濾紙），津騰濾膜（來源：津騰，型號：MICROPES 聚醚砜，規(guī)格：孔徑0.8 μm）（下文簡稱濾膜0.8 μm）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

按照《中國藥典》（2020 年版）鹽酸小檗堿片含量測定方法，色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱，流動相為磷酸鹽緩沖液[0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液和0.05 mol/L 庚烷磺酸鈉溶液（1:1），含0.2%三乙胺，用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至3.0]-乙腈（60:40），使用紫外檢測器，檢測波長263 nm，進樣體積為20 μL。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取鹽酸小檗堿對照品約20 mg，置500 mL 容量瓶中，加沸水，立即超聲處理5 分鐘，放冷，加水稀釋制成每1 mL中約含鹽酸小檗堿40 μg的溶液，搖勻即得。

2.3 空白溶液

取沸水放冷，作為空白溶液。

2.4 供試品溶液的制備

取廠家A、廠家B、廠家C 的供試品各4 片，分別置1000 mL 容量瓶中，加沸水，立即超聲處理30 分鐘，放冷，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取50 mL，置500 mL 容量瓶中，加水稀釋制成每1 mL 中約含鹽酸小檗堿40 μg 的溶液，搖勻，作為廠家A 供試品溶液、廠家B 供試品溶液和廠家C 供試品溶液。

創(chuàng)新是企業(yè)成功的關(guān)鍵，企業(yè)經(jīng)營的最佳策略就是搶在別人之前淘汰自己的產(chǎn)品，這種把創(chuàng)新與市場營銷有機的結(jié)合就是創(chuàng)新營銷觀念，包括營銷產(chǎn)品的創(chuàng)新、營銷組織的創(chuàng)新和營銷技術(shù)的創(chuàng)新，要做到這一點，市場營銷者就必須隨時保持思維模式的彈性，讓自己成為新思維的開創(chuàng)者，創(chuàng)新營銷的意義就在于先人一步，而不僅在于別人沒有，一旦發(fā)現(xiàn)是一種新技術(shù)，新的需求，就要及時捕捉。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗

取2.2 和2.4 中對照品溶液和供試品溶液，分別進樣20 μL，均滿足《中國藥典》（2020 年版）中鹽酸小檗堿片含量測定的系統(tǒng)適用性要求：（1）對照品溶液和供試品溶液中鹽酸小檗堿峰理論塔板數(shù)分別為15 439 和15 350（規(guī)定：應(yīng)不低于3000）；（2）對照品溶液和供試品溶液中鹽酸小檗堿峰與相鄰雜質(zhì)峰分離度分別為2.2和2.1（規(guī)定：應(yīng)不低于1.5）。

2.6 專屬性試驗

取2.3 中空白溶液，分別使用濾膜（0.8 μm）、雙圈濾紙和Whatman 濾紙濾過，分別棄去0 mL、10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL 和100 mL 的初濾液，取續(xù)濾液測定，記錄鹽酸小檗堿峰面積。結(jié)果顯示，空白溶液通過不同濾材，所得續(xù)濾液，鹽酸小檗堿含量測定結(jié)果均為0，對本次試驗結(jié)果無干擾。

2.7 精密度試驗

取2.2中對照品溶液，連續(xù)重復(fù)進樣6 次，記錄鹽酸小檗堿峰面積，RSD（n=6）為0.1%。

2.8 重復(fù)性試驗

取廠家A 的供試品按照2.4中供試品溶液的制備方法，平行配制6 份供試品溶液，離心，取上清液進樣，記錄鹽酸小檗堿峰面積，RSD（n=6）為0.2%。

2.9 穩(wěn)定性試驗

取2.4中室溫條件下保存的廠家A供試品溶液，離心，取上清液，分別在0 小時、1 小時、2 小時、4 小時、8小時和24 小時進樣20 μL。結(jié)果顯示，記錄的鹽酸小檗堿峰面積無明顯變化，RSD（n=6）為0.1%，說明供試品溶液在24 小時內(nèi)穩(wěn)定，本次試驗所有溶液均在24 小時內(nèi)進樣。

2.10 不同濾材對鹽酸小檗堿對照品溶液的吸附作用

取2.2中對照品溶液，分別使用濾膜（0.8 μm）、雙圈濾紙和Whatman 濾紙濾過，分別棄去0 mL、10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL和100 mL的初濾液，取續(xù)濾液測定，記錄鹽酸小檗堿峰面積。同時，取同一對照品溶液，離心，測定，記錄鹽酸小檗堿峰面積。按下列公式計算，得到不同濾材對鹽酸小檗堿的吸附率，結(jié)果見圖1。

圖1 不同濾材對鹽酸小檗堿的吸附率結(jié)果

式中，A 為對照品溶液，經(jīng)離心處理后，記錄所得鹽酸小檗堿峰面積；B 為對照品溶液，經(jīng)不同濾材過濾后，取續(xù)濾液，記錄所得鹽酸小檗堿峰面積。

2.11 不同濾材對鹽酸小檗堿片含量測定結(jié)果的影響

取2.2中對照品溶液，進樣20 μL，記錄鹽酸小檗堿峰面積，計算得出鹽酸小檗堿的校正因子（以濃度除以峰面積計算所得）。取2.4中廠家A 供試品溶液、廠家B 供試品溶液和廠家C 供試品溶液，分別使用離心、濾膜（0.8 μm）過濾、雙圈濾紙過濾和Whatman 濾紙過濾四種方式處理供試品溶液。其中使用濾膜（0.8 μm）、雙圈濾紙和Whatman 濾紙過濾時，分別棄去0 mL、10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL 和100 mL 的初濾液，取續(xù)濾液直接測定，記錄鹽酸小檗堿峰面積，以外標(biāo)百分比法，計算鹽酸小檗堿片的含量測定結(jié)果。三個廠家的含量測定結(jié)果曲線圖見圖2。

圖2 不同濾材對鹽酸小檗堿片含量測定結(jié)果的影響

3 討論

3.1 耐用性考察

3.2 供試品溶液制備方法的選擇

本次試驗前期，分別采用兩種溶液制備方法進行預(yù)試驗，（1）取本品4 片，置1000 mL 容量瓶中，加水400 mL，置磁力攪拌器上（120 轉(zhuǎn)/分鐘），攪拌45 分鐘，加水稀釋至刻度，精密量取50 mL，置500 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。（2）取本品4 片，置1000 mL容量瓶中，加沸水，立即超聲處理30 分鐘，放冷，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取50 mL，置500 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同廠家采用第一種溶液制備方法測得鹽酸小檗堿含量結(jié)果均低于第二種，最終，試驗擬定第二種供試品溶液制備方法。

3.3 濾材的選擇

按《中國藥典》（2020 年版）方法，鹽酸小檗堿片含量測定供試品溶液需采用過濾的方式，除去供試品溶液中不溶顆粒以得到澄清溶液后，進行液相色譜分析。在日常檢驗中，在含量測定供試品溶液過濾時，首選定量濾紙進行過濾，然而，多次實驗發(fā)現(xiàn)，濾紙對于鹽酸小檗堿可能存在吸附作用，經(jīng)常造成含量測定結(jié)果偏低甚至低于規(guī)定限度。因此，為了保證日常檢驗數(shù)據(jù)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重現(xiàn)性，筆者擬定試驗方案，以此驗證不同濾材對鹽酸小檗堿片含量測定結(jié)果的影響。

過濾材質(zhì)主要有濾紙和濾膜兩種。濾紙按灰分含量區(qū)分為定性濾紙和定量濾紙（又稱為無灰濾紙），按孔隙大小又可區(qū)分為快速濾紙（孔徑80 ～120 μm）、中速濾紙（孔徑30 ～50 μm）和慢速濾紙（1 ～3 μm）。濾膜按材質(zhì)主要區(qū)分為親水性濾膜和疏水性濾膜，孔徑包含0.1 μm ～75 μm。

濾材初選實驗室常用雙圈濾紙、Whatman 濾紙和不同規(guī)格濾膜若干（孔徑包含0.22 μm、0.45 μm 和0.8 μm），試驗初期發(fā)現(xiàn)，0.22 μm 和0.45 μm 濾膜過濾溶液不到10 mL時，已無法繼續(xù)過濾溶液，達(dá)不到試驗設(shè)計方案要求?？紤]到試驗開展的可行性和成本，最終選擇雙圈濾紙、Whatman 濾紙和濾膜（0.8 μm），考察對鹽酸小檗堿片含量測定結(jié)果的影響。

3.4 結(jié)果分析

從圖1 的三維柱形圖中可得到以下結(jié)論：（1）三種不同濾材中，對鹽酸小檗堿的吸附率（以最高計），Whatman 濾紙＞雙圈濾紙＞濾膜（0.8 μm）。（2）Whatman濾紙和雙圈濾紙對鹽酸小檗堿的吸附率變化趨勢相同，隨著棄去初濾液體積增大，可降低吸附率。但當(dāng)棄去初濾液體積高達(dá)100 mL 時，吸附率仍不符合相關(guān)要求，遠(yuǎn)大于2%。（3）濾膜（0.8 μm）對鹽酸小檗堿的吸附率，基本維持在1%～2%之間，符合《中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》[10]中對濾膜的要求。

按2.11 試驗，以離心結(jié)果作為參照，從圖2 可知，三個廠家的濾膜（0.8 μm）結(jié)果基本與離心結(jié)果一致，含量測定結(jié)果可靠性較高。而雙圈濾紙結(jié)果和Whatman濾紙結(jié)果，當(dāng)棄去初濾液體積低于60 mL 時，含量測定結(jié)果均低于93.0%（《中國藥典》要求含量測定限度為93.0%～107.0%）；當(dāng)棄去初濾液體積達(dá)到100 mL 時，其含量測定結(jié)果仍低于離心結(jié)果。

3.5 后期展望

因?qū)嶒炇覟V材資源所限，本次試驗僅考察三種不同濾材，數(shù)據(jù)樣本相對較少。同一濾材不同規(guī)格，對鹽酸小檗堿片含量測定結(jié)果的影響，尚有待后續(xù)驗證。過濾材質(zhì)的材料、孔徑、顆粒保留度等參數(shù)是否與吸附率存在一定的相關(guān)性，是后期試驗的重要考察內(nèi)容[10-14]。篩選出適合的濾材參數(shù)，可為今后鹽酸小檗堿片含量測定濾材選擇提供參考。

3.6 結(jié)論

綜上所述，不同濾材對鹽酸小檗堿的吸附率差異顯著，導(dǎo)致使用不同濾材時，鹽酸小檗堿片的含量測定結(jié)果差異較大，甚至?xí)?dǎo)致測定結(jié)果低于《中國藥典》（2020年版）規(guī)定限度。日常檢驗中，鹽酸小檗堿片含量測定項使用的濾材，建議應(yīng)進行吸附率考察，選擇合適的濾材處理樣品，保證檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。