澳洲堅(jiān)果青皮不同提取物的總多酚及抗氧化能力測(cè)定

黃寶玲，陳海彬，李詠梅，劉 媛

（1. 中山市第一職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東中山 528478；2. 廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院，廣東廣州 510430）

澳洲堅(jiān)果屬山龍眼科、澳洲堅(jiān)果屬長(zhǎng)綠喬木果樹(shù)，其果實(shí)由外殼（青皮）、果殼（木質(zhì)硬殼） 和果仁組成[1]。澳洲堅(jiān)果的圓形果仁香脆可口，具有獨(dú)特奶香味，且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，被認(rèn)為是世界上品質(zhì)最佳的食用果。而青皮作為澳洲堅(jiān)果的副產(chǎn)物，一般僅有極少量用作飼料或者肥料，絕大部分青皮則被丟棄。但是，隨著澳洲堅(jiān)果種植規(guī)模不斷擴(kuò)大，越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始發(fā)現(xiàn)澳洲堅(jiān)果青皮的保健、藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，開(kāi)展了對(duì)澳洲堅(jiān)果青皮的研究。郭剛軍等人[2]采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇4 種不同極性溶劑對(duì)其提取物進(jìn)行分步萃取，測(cè)定提取物的總酚、黃酮、多糖含量及其抗氧化活性。張明等人[3]研究了超聲輔助提取澳洲堅(jiān)果青皮總黃酮工藝條件及抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)澳洲堅(jiān)果青皮總黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化活性。不同溶劑對(duì)天然產(chǎn)物的活性物質(zhì)含量和抗氧化活性有很大影響，目前常用提取澳洲堅(jiān)果青皮的溶劑主要有乙醇和水，但采用低共熔溶劑提取澳洲堅(jiān)果青皮的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。采用3 種不同溶劑分別提取澳洲堅(jiān)果青皮，比較不同溶劑提取物的總多酚含量及抗氧化能力差異，以期為澳洲堅(jiān)果青皮的高效提取和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1） 試驗(yàn)材料。澳洲堅(jiān)果青皮，市售。

（2） 試驗(yàn)試劑。氯化膽堿、1.3 -丁二醇、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、福林酚、1,1 -二苯基- 2 -三硝基苯肼（DPPH）、2,2 -聯(lián)氮-二（3 -乙基-苯并噻唑-6 -磺酸） 二銨鹽（ABTS）、碳酸鈉、甲醇、無(wú)水乙醇、三羥甲基氨基甲烷、濃鹽酸、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫溶液、水楊酸、過(guò)硫酸鉀，均為分析純。

（3） 試驗(yàn)設(shè)備。UC-9000 型超聲波清洗儀，深圳朗杰超聲電器有限公司產(chǎn)品；UV3000 型紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品；FA124 型萬(wàn)分電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；TG16-WS 型離心機(jī)，湖南湘儀儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 低共熔溶劑體系

基于前期試驗(yàn)結(jié)果，將氯化膽堿與1.3 -丁二醇按照摩爾比1∶3 比例混合，置于80 ℃水浴中溶解，配制成100%的低共熔溶劑，加入一定量的水將其配制成體積分?jǐn)?shù)為40%的低共熔溶劑，備用。

1.2.2 澳洲堅(jiān)果青皮多酚提取

基于前期試驗(yàn)基礎(chǔ)，澳洲兼顧青皮多酚提取方法為青皮干燥并研磨成細(xì)粉，過(guò)40 目篩后，置于4 ℃保存。稱取0.5 g 青皮粉，加入70 mL 體積分?jǐn)?shù)為40%的低共熔溶劑，在40 kHz 頻率下超聲提取60 min，將得到的粗提液以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心10 min，上清液過(guò)濾保存于4 ℃冰箱中，備用。

1.2.3 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過(guò)測(cè)定沒(méi)食子酸含量表示多酚含量。準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用無(wú)水乙醇配置質(zhì)量濃度為10，20，40，60，80 μg/mL 的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取不同質(zhì)量濃度的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL，加入去離子水1 mL 和體積分?jǐn)?shù)為10%的福林酚試劑5 mL，搖勻，靜置反應(yīng)5 min，加入2 mL 7.5%的碳酸鈉溶液，用去離子水定容至10 mL，于避光條件靜置1 h，以水為參比，測(cè)定反應(yīng)液于波長(zhǎng)765 nm 處的吸光度（A）。以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（C） 為橫坐標(biāo)，吸光度（A） 為縱坐標(biāo)，做出沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 澳洲堅(jiān)果青皮多酚提取量測(cè)定

用待測(cè)的澳洲堅(jiān)果青皮多酚提取上清液代替沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定吸光度，再代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，按照下式計(jì)算多酚提取量。

式中：C——待測(cè)液中多酚質(zhì)量濃度，μg/mL；

V——上清液的體積，mL；

N——容量瓶量程，mL；

W——稱取澳洲堅(jiān)果青皮粉末質(zhì)量，g；

M——提取液取液量，mL。

1.2.5 澳洲堅(jiān)果青皮多酚的體外抗氧化活性研究

采用體外試驗(yàn)方法研究澳洲堅(jiān)果青皮多酚的體外抗氧化活性，以水提取劑及體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇提取劑作對(duì)比，測(cè)定澳洲堅(jiān)果青皮中多酚粗提物分別對(duì)超氧陰離子自由基、羥基自由基、DPPH 自由基和ABTS+自由基的清除能力。

（1） 青皮多酚對(duì)超氧陰離子自由基清除能力的考查。參考李白存等人[4]的方法并稍作改動(dòng)。取2 mL樣品液，加入去離子水4.2 mL 與濃度為0.1 mol/L 的Tris-HCl 緩沖溶液（pH 值8.2） 4.5 mL，混勻后25 ℃水浴20 min，隨后加入濃度為3 mmol/L 的鄰苯三酚溶液0.3 mL，振蕩搖勻，立即在波長(zhǎng)325 nm 處測(cè)定吸光度，每30 s 記錄一次讀數(shù)，測(cè)定時(shí)間為5 min。以去離子水4.2 mL 加濃度為0.1 mol/L 且pH 值8.2的Tris-HCl 緩沖溶液4.5 mL 調(diào)零，空白組為去離子水代替樣品。作吸光度隨時(shí)間變化的回歸方程，斜率即為鄰苯三酚自氧化速率。

式中：D0——等體積去離子水代替樣品溶液光密度變化速率；

D——樣品溶液光密度變化速率。

（2） 青皮多酚對(duì)羥基自由基清除能力的考查。參考王凱等人[5]的方法并稍作改動(dòng)。試管中加入2 mL樣品溶液，依次加入濃度為6 mmol/L 的FeSO4溶液2 mL 與濃度為6 mmol/L 的H2O2溶液2 mL，振蕩搖勻后靜置10 min。隨后加入濃度為6 mmol/L 的水楊酸乙醇2 mL，充分混合后于37 ℃水浴靜置30 min，于波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)定吸光度（D1）。相同處理下，以水代替水楊酸測(cè)定相同樣品溶液本底光密度的吸光度（D2）。用等體積去離子水代替樣品，測(cè)定空白對(duì)照光密度的吸光度（D）。

（3） 青皮多酚對(duì)DPPH 自由基清除能力的考查。參考陶紫等人[6]的方法并稍作改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取10 mg DPPH，用100 mL 無(wú)水乙醇超聲輔助溶解，制得貯備液置于4 ℃冰箱避光保存。測(cè)量前，貯備液用無(wú)水乙醇稀釋4 倍，制備成6.5×10-5mol/L DPPH 溶液。于1 mL 樣品溶液中加入5 mL 6.5×10-5mol/L DPPH 溶液，搖勻并室溫避光30 min，于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度，記為D1。另外取1 mL 樣品溶液，用5 mL 無(wú)水乙醇代替DPPH 溶液，混合后搖勻室溫避光30 min，于波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定吸光度，記為D2。再用1 mL 去離子水代替樣品溶液，加入6.5×10-5mol/L DPPH 溶液5 mL，搖勻并置于室溫避光反應(yīng)30 min，測(cè)定波長(zhǎng)517 nm 吸光度，記為D。按下式計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：D——水代替樣品的空白組吸光度；

D1——樣品溶液與DPPH 反應(yīng)的吸光度；

D2——樣品溶液與無(wú)水乙醇吸光度。

（4） 青皮多酚對(duì)ABTS+自由基清除能力的考查。參照謝佳函等人[7]的方法并稍作改動(dòng)。將濃度為7 mmol/L 的甲醇ABTS 溶液1 000 mL 和濃度為140 mmol/L 的K2S2O8溶液20 mL 振蕩混勻后，于室溫避光靜置12~16 h，制得ABTS+儲(chǔ)備液。使用前用甲醇稀釋ABTS+儲(chǔ)備液，使其在波長(zhǎng)734 nm 處的吸光度為0.70+0.02，即為ABTS+工作液。吸取20 μL 樣品加入試管，再加入2 mL ABTS+工作液，振蕩均勻后于30 ℃保溫30 min，于波長(zhǎng)734 nm 處測(cè)吸光度D1，以蒸餾水為空白對(duì)照。按下式計(jì)算ABTS+自由基清除率。

式中：D1——樣品溶液吸光度；

D2——以甲醇代替ABTS+的吸光度；

D——以甲醇代替待測(cè)溶液的空白對(duì)照吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程Y=0.012 5X+0.114 2，R2=0.999 0。

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1 可知，沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為0~100 μg/mL，與吸光度線性關(guān)系良好。

2.2 多酚提取量的測(cè)定

分別用水、40%乙醇與40%低共熔溶劑在相同條件下提取澳洲堅(jiān)果青皮多酚，結(jié)果表明體積分?jǐn)?shù)40%低共熔溶劑作為澳洲堅(jiān)果青皮多酚提取劑時(shí)，多酚提取量顯著高于水、乙醇提取劑（p<0.05），40%低共熔溶劑組多酚提取量為423.85 mg/g，40%乙醇提取劑組多酚提取量為119.64 mg/g，而水提取劑組的多酚提取量?jī)H為22.26 mg/g，說(shuō)明低共熔溶劑具有良好的多酚提取能力。

2.3 清除超氧陰離子自由基能力的測(cè)定

不同提取液清除超氧陰離子自由基能力見(jiàn)圖2。

圖2 不同提取液清除超氧陰離子自由基能力

結(jié)合多酚提取量分析超氧陰離子自由基清除能力與多酚提取量關(guān)系。由圖2 可知，相同提取條件下，選用40%乙醇作為提取劑時(shí)，超氧陰離子清除能力最佳，清除率達(dá)到60%。低共熔溶劑提取青皮多酚含量最高，但超氧陰離子自由基清除能力較弱。綜合分析多酚量與超氧陰離子自由基清除能力，說(shuō)明在該體積分?jǐn)?shù)下，提取的多酚量與超氧陰離子清除能力沒(méi)有線性關(guān)系。

2.4 清除羥基自由基能力的測(cè)定

不同提取液清除羥基自由基能力見(jiàn)圖3。

圖3 不同提取液清除羥基自由基能力

由圖3 可知，水、40%乙醇、低共熔溶劑作為提取劑提取澳洲堅(jiān)果多酚后得到的提取液均具備清除羥基自由基的能力，并隨著提取液中多酚量的提高其清除活性隨之提升。與水、乙醇作為提取劑相比，低共熔溶劑提取多酚量高，清除羥基自由基能力最佳，清除率達(dá)到89.46%。

2.5 清除DPPH 自由基能力的測(cè)定

不同提取液清除DPPH 自由基能力見(jiàn)圖4。

圖4 不同提取液清除羥基自由基能力

單電子轉(zhuǎn)移和氫原子轉(zhuǎn)移是酚類物質(zhì)清除DPPH自由基的機(jī)理。由圖4 可知，澳洲堅(jiān)果青皮中的多酚類物質(zhì)具有良好的清除DPPH 自由基能力。低共熔溶劑作為提取劑時(shí)，其提取液DPPH 自由基清除能力顯著高于水、乙醇（p<0.05），清除率達(dá)到71.33%。

2.6 清除ABTS+自由基能力的測(cè)定

不同提取液清除ABTS+自由基能力見(jiàn)圖5。

圖5 不同提取液清除ABTS+自由基能力

氫原子轉(zhuǎn)移是酚類化合物清除ABTS+自由基的機(jī)理。由圖5 可知，低共熔溶劑提取澳洲堅(jiān)果多酚具有良好的ABTS+自由基清除能力。清除ABTS+自由基能力趨勢(shì)與清除DPPH 自由基能力、羥基自由基能力相似，清除率隨多酚量增大而提高。低共熔溶劑作為提取劑時(shí)，多酚提取量高，其提取液ABTS+自由基清除能力顯著高于水、乙醇（p<0.05），清除率達(dá)到98.81%。

3 結(jié)論

試驗(yàn)以水、乙醇為參照，探究青皮多酚的抗氧化活性。結(jié)果表明，相同制備條件下，低共熔溶劑提取得到的多酚量顯著多于水、乙醇提取劑，說(shuō)明低共熔溶劑提取方法高效，將此提取方法應(yīng)用于澳洲堅(jiān)果多酚物質(zhì)的提取具有較高的實(shí)用價(jià)值。同時(shí)，得到的提取液具有良好的羥基自由基、DPPH自由基、ABTS+自由基清除能力，該結(jié)果與前人結(jié)果相似[2]，說(shuō)明澳洲堅(jiān)果青皮多酚是一種良好的自由基清除劑，可作為開(kāi)發(fā)食品、化妝品、藥品等領(lǐng)域的天然抗氧化劑。