β-胡蘿卜素高效降解菌株的篩選鑒定及產(chǎn)香研究

梁 偉，蔡聯(lián)合，蘇 贊，陳義昌，鄒克興，王明月，王 伊

（1.廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，廣西南寧 530001；2.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽 471023）

類胡蘿卜素是在分子兩端各有1 個(gè)不飽和己烯環(huán)的四萜化合物，其存在于植物和有光合作用的細(xì)菌中，是一類重要的香料前體物質(zhì)[1]。目前，已知的主要胡蘿卜素有α，β和γ共3 種同分異構(gòu)體，其中β-胡蘿卜素占主要地位[2]。β-胡蘿卜素被氧化分解產(chǎn)生α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯和β-大馬酮等多種揮發(fā)性致香物質(zhì)[3]。這類致香物質(zhì)具有較低的感官閾值，是許多香料的特征香味[4]。β-胡蘿卜素降解主要有熱降解、光氧化降解、化學(xué)氧化降解和生物降解[5]。熱降解和光氧化降解具有降解條件不夠溫和的缺點(diǎn)，化學(xué)氧化降解則選擇性差。盡管利用傳統(tǒng)的有機(jī)合成或從植物中提取的方法仍具有一定的可行性，但是近年來，通過生物技術(shù)制備的天然香料及其酶解-酶促反應(yīng)生成的天然香料正逐步成為其主要的降解模式，且研究也表明生物降解具有降解效率高、專一性強(qiáng)、催化條件溫和、產(chǎn)物中目標(biāo)化合物含量高等優(yōu)點(diǎn)，備受學(xué)者關(guān)注[6]。目前，研究發(fā)現(xiàn)酵母菌、芽孢桿菌和巴氏葡萄球菌等微生物能降解β-胡蘿卜素[7]。有研究以新鮮水果為樣本，篩選出一株降解β-胡蘿卜素產(chǎn)生香味物質(zhì)β-紫羅蘭酮的高效菌種。Zorn H 等人[8]篩選的絲狀真菌和酵母菌降解β-胡蘿卜素產(chǎn)生二氫獼猴桃內(nèi)酯和β-紫羅蘭酮香味物質(zhì)。蔡程晨[9]從土壤中篩選到一株降解類胡蘿卜素的枯草芽孢桿菌，并將其應(yīng)用于芒果汁發(fā)酵，結(jié)果顯示類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量有所增加。田爭福等人[10]使用具有類胡蘿卜素降解能力的庫特氏菌發(fā)酵液輔助枸杞酒發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后其香氣成分改善。這些研究也表明，通過生物降解類胡蘿卜素改良產(chǎn)品風(fēng)味特征是可行的。

以學(xué)校里常年落葉的土壤為樣本，通過形態(tài)觀察、生理生化和分子生物學(xué)鑒定等技術(shù)手段，篩選得到β-胡蘿卜素高效降解菌株TR-3，旨在為生物降解β-胡蘿卜素提供高效降解新菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土壤，采集自河南科技大學(xué)校園內(nèi)常年落葉的地塊；β- 胡蘿卜素，北京索萊寶科技有限公司提供；β-胡蘿卜素儲(chǔ)備液，避光條件下將β-胡蘿卜素（10 mg） 溶于二氯甲烷（20 mL） 中，溶解后，加入Tween-80（2 g） 進(jìn)行乳化，減壓濃縮除去二氯甲烷，將殘留物分散在蒸餾水（100 mL） 中，微孔濾膜過濾得橘黃色的儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱待用。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ9000 三重四極桿GC-MS，賽默飛世爾科技（中國） 有限公司產(chǎn)品；梯度PCR 儀，德國Eppendorf 公司產(chǎn)品；UV-2600 型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司產(chǎn)品。

1.3 篩選培養(yǎng)基[11]

（1） 富集培養(yǎng)基。蔗糖15 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸亞鐵0.01 g/L，氯化鉀0.5 g/L，硝酸鈉3 g/L，酵母粉2 g/L。初始pH 值調(diào)為7.2~7.4，于121 ℃條件下滅菌20 min。

（2） 分離培養(yǎng)基。富集培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂20 g/L，β-胡蘿卜素儲(chǔ)備液20 mg/L。β-胡蘿卜素經(jīng)微孔濾膜過濾除菌，加入冷卻至60 ℃的分離培養(yǎng)基中，倒平板，備用。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1β-胡蘿卜素高效降解菌的篩選

取1 g 土樣溶于100 mL 無菌水中，振蕩12 h，抽濾得菌懸液。用移液槍吸取2 mL 菌懸液加入100 mL富集培養(yǎng)基中，于30 ℃下以轉(zhuǎn)速150 r/min 避光振蕩培養(yǎng)12 h。

（1） 初篩。對振蕩12 h 的菌液進(jìn)行梯度稀釋，分別選取10-3，10-4，10-5濃度涂布于分離培養(yǎng)基上，設(shè)置空白對照，于30 ℃下避光培養(yǎng)24~48 h。觀察菌對β-胡蘿卜素的分解。

（2） 復(fù)篩。選取透明圈明顯的單菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃下以轉(zhuǎn)速150 r/min 避光培養(yǎng)24 h。β-胡蘿卜素降解能力較強(qiáng)的菌株通過測定溶液中β- 胡蘿卜素降解率和降解產(chǎn)物進(jìn)行篩選。

1.4.2β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用紫外可見分光光度計(jì)測定β- 胡蘿卜素溶液全波長得出，β-胡蘿卜素于波長460 nm 處有最大吸收峰，用石油醚分別配制質(zhì)量濃度為0，2.5，5.0，7.5，10.0 mg/L 的β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用石油醚作為空白對照，于波長460 nm 處對β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度進(jìn)行測量，將其記錄為OD460，將OD460作為縱坐標(biāo)（Y），將β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)（X），制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]。

1.4.3 菌種生長狀態(tài)測定

固定培養(yǎng)時(shí)間過后，取3 mL 降解菌液，以初始培養(yǎng)基為空白對照，在波長為600 nm 的紫外可見分光光度計(jì)中，對菌液的吸光度值進(jìn)行測定，作為菌種生長狀態(tài)的判定標(biāo)準(zhǔn)，記為OD600[13]。

1.4.4β-胡蘿卜素降解率測定

測得OD600后，發(fā)酵液在避光條件下，于4 ℃條件下以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 高速離心10 min，留下分離出的沉淀，加入與上清液等體積的石油醚，振蕩，使沉淀分散，讓沉淀中的β-胡蘿卜素完全溶解在石油醚中，靜置取上清液，將得到的β-胡蘿卜素溶液，用石油醚做空白對照，于波長460 nm 處測定溶液吸光度，根據(jù)計(jì)算公式計(jì)算降解率[14]。

1.4.5β-胡蘿卜素降解產(chǎn)物的萃取

（1） 頂空固相微萃取[15]。量取8 mL 避光培養(yǎng)24 h的β-胡蘿卜素降解菌液于20 mL 頂空瓶中，加入2 g NaCl 調(diào)節(jié)離子濃度，添加8 μL 的2 -辛醇作為內(nèi)標(biāo)溶液，封口，在40 ℃磁力攪拌器上平衡10 min，插入裝有50/30 μm 萃取頭的手動(dòng)進(jìn)樣手柄，吸附萃取40 min 后，收回萃取頭纖維部分再取出萃取頭，插入GC-MS 進(jìn)樣口于250 ℃下解析5 min，用于GC-MS 分析。

1.4.6β-胡蘿卜素降解產(chǎn)物的GC-MS 工作條件

（1） GC 條件。參照參考文獻(xiàn)[16]稍作修改，色譜柱為HP-5（30 m×0.32 mm×0.25 μm），載氣：高純度的He，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣維持250 ℃，程序升溫為起始溫度45 ℃，將此溫度儲(chǔ)存5 min，以5 ℃/min 的速率上升到280 ℃保持20 min，溶劑延遲6 min，進(jìn)樣量1.0 μL，分流比5∶1。

（2） MS 條件。電壓70 eV，離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度280 ℃，檢測器溫度280 ℃，掃描范圍為30~450m/z。

1.4.7β-胡蘿卜素高效降解菌的鑒定

（1） 菌落形態(tài)觀察。包括菌落大小、形狀、邊緣、光澤、質(zhì)地、顏色和透明程度等。

（2） 顯微形態(tài)觀察。采用革蘭氏染色和顯微鏡觀察。

（3） 16S rDNA 序列分析。

通過16S rDNA 測序?qū)Y選菌株進(jìn)行分子鑒定。采用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（BioFlux，Kyoto，Japan） 進(jìn)行DNA 的提取。以提取的DNA 為模板，進(jìn)行16S rDNA 擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴(kuò)增結(jié)果，PCR 產(chǎn)物送生工生物工程（上海） 股份有限公司進(jìn)行測序。將所測16S rDNA 序列在GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/） 中進(jìn)行BLAST 比對，選出相似性大于98%的部分序列，以16S rDNA同源性為基礎(chǔ)MEGA7 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 β -胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線

吸光度（Y） 與β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度（X） 的回歸方程為Y=0.200 32X-0.038，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 1，這表明在0~10 mg/L 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度與吸光度具有良好的線性關(guān)系。

2.2 β -胡蘿卜素高效降解菌的篩選

采用富集培養(yǎng)基和分離培養(yǎng)基篩選出具有明顯降解透明圈，且在培養(yǎng)過程中有明顯香味產(chǎn)生的菌株。

所篩選菌株在類胡蘿卜素培養(yǎng)基平板上的菌落形態(tài)和降解結(jié)果圖見圖2。

圖2 所篩選菌株在類胡蘿卜素培養(yǎng)基平板上的菌落形態(tài)和降解結(jié)果圖

2.3 β -胡蘿卜素降解率

β-胡蘿卜素降解率測定見圖3。

圖3 β -胡蘿卜素降解率測定

對初篩的菌株進(jìn)行β-胡蘿卜素降解率的測定。由圖3（a） 可知，含有β-胡蘿卜素的培養(yǎng)液接種后，于30 ℃條件下以轉(zhuǎn)速150 r/min 避光培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液的顏色明顯變淺且變透亮。對3 株菌的降解能力分析顯示，菌株TR-3 對β-胡蘿卜素降解能力最強(qiáng)，降解率達(dá)到86.65%；菌株TR-2 和TR-1 對β-胡蘿卜素的降解能力較弱。故接下來對菌株TR-3進(jìn)行進(jìn)一步的研究分析。

2.4 菌種鑒定

2.4.1 形態(tài)特征鑒定

菌株TR-3 在添加β-胡蘿卜素的固體培養(yǎng)基的菌落呈現(xiàn)出透明，形狀較規(guī)則，表面光滑且濕潤，邊緣整齊，容易挑起。革蘭氏染色結(jié)果為陰性，光學(xué)顯微鏡觀察菌體多為短桿狀。

菌株TR-3 的革蘭氏染色結(jié)果（400×） 見圖4。

圖4 菌株TR-3 的革蘭氏染色結(jié)果（400×）

2.4.2 生理生化試驗(yàn)

該菌株能利用表1 中的糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，且可看到紫色培養(yǎng)基全部變黃，與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中關(guān)于腸桿菌的描述基本一致，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，初步鑒定TR-3 為腸桿菌。

表1 菌株TR-3 生理生化試驗(yàn)結(jié)果

菌株TR-3 生理生化試驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.4.3 菌株TR-3 的16S rDNA 分子鑒定

將16S rDNA 測定序列于NCBI Blast 進(jìn)行同源序列檢索，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。菌株TR-3 與Enterobacter sp.strainAPCB2（ON564857.1）、Enterobacter hormaechei subsp.Xiangfangensis strainER48（MT124573.1） 同源性最高。綜合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果、生理生化試驗(yàn)結(jié)果及16S rDNA 分子系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定菌株TR-3為腸桿菌屬。

TR-3 菌株的16S rDNA 系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖5。

圖5 TR-3 菌株的16S rDNA 系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.5 β -胡蘿卜素降解產(chǎn)物分析

菌株TR-3 降解β-胡蘿卜素產(chǎn)生香氣物質(zhì)，對降解菌液進(jìn)行頂空固相微萃取后，樣品進(jìn)行GC-MS分析。

香氣成分GC-MS 圖見圖6，色譜峰對應(yīng)時(shí)刻的質(zhì)譜圖見圖7。

圖6 香氣成分GC-MS 圖

圖7 色譜峰對應(yīng)時(shí)刻的質(zhì)譜圖

該菌株降解β-胡蘿卜素后共檢出揮發(fā)性成分45 種，在這些產(chǎn)物中，仲辛酮相對含量最高（37.69%），其次是苯乙醇（13.88%）、磷酸三丁脂（5.55%）、癸酸乙酯（5.54%）、β-紫羅蘭酮（4.8%） 及月桂酸乙酯（3.73%），其他降解產(chǎn)物的相對含量較低，除β-紫羅蘭酮和月桂酸乙酯的相對含量在3%以上外，其余降解產(chǎn)物的相對含量均在3%以下。原本預(yù)測產(chǎn)物中二氫獼猴桃內(nèi)酯和β-紫羅蘭酮相對含量最高，但實(shí)際測得二氫獼猴桃內(nèi)酯含量僅有0.16%，其原因可能為該菌種降解β-胡蘿卜素的反應(yīng)不同，導(dǎo)致其他產(chǎn)物含量增高。

3 結(jié)論

從土壤中分離篩選出一株高效降解β- 胡蘿卜素的菌株TR-3，通過形態(tài)觀察、生理生化和分子生物學(xué)鑒定該菌株為腸桿菌屬；其對β-胡蘿卜素的降解能力較高，降解率達(dá)86.65%。菌株TR-3 對β-胡蘿卜素的降解產(chǎn)物中共檢出揮發(fā)性成分45 種，主要包括仲辛酮（37.69%）、苯乙醇（13.88%）、磷酸三丁脂（5.55%）、癸酸乙酯（5.54%）、β-紫羅蘭酮（4.80%） 及月桂酸乙酯（3.73%） 等致香物質(zhì)。試驗(yàn)為β-胡蘿卜素的生物降解提供了一株高效降解菌，研究結(jié)果對類胡蘿卜素生物法制備香精香料提供了理論基礎(chǔ)。