高效液相色譜法—蒸發(fā)光檢測(cè)器測(cè)定復(fù)方石韋片中黃芪甲苷的含量

段樹(shù)卿,李秀玲,孫利,李云霞

復(fù)方石韋片由黃芪、石韋、苦參、萹蓄4味中藥材組成,處方來(lái)源于《證治匯補(bǔ)》中的石韋散[1]。藥效學(xué)試驗(yàn)表明,復(fù)方石韋片具有利尿、抗菌、抗感染、解痙作用[2-3]。臨床試驗(yàn)表明,復(fù)方石韋片具有清熱利濕、利尿通淋的功效,對(duì)上下尿路感染療效確切,臨床使用安全[4-5]。復(fù)方石韋片現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國(guó)藥典》[6],含量測(cè)定項(xiàng)下規(guī)定對(duì)黃芪中的黃芪甲苷進(jìn)行檢測(cè),黃芪甲苷一部分為游離黃芪甲苷,一部分為堿性條件下黃芪甲苷衍生物的轉(zhuǎn)化,其總和才是復(fù)方石韋片中黃芪甲苷的總含量[7-9]。因此,黃芪甲苷含量測(cè)定的結(jié)果與化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中其衍生物轉(zhuǎn)化的程度直接相關(guān),復(fù)方石韋片供試品的制備方法是黃芪甲苷測(cè)定的關(guān)鍵?；亓鲏A化衍生法具有堿性、強(qiáng)堿化溫度高和堿化時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn),預(yù)測(cè)此法可將黃芪甲苷衍生物完全轉(zhuǎn)化為黃芪甲苷[10-12]。本研究在《中華人民共和國(guó)藥典2020年版(一部)》[6](以下簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》)方法基礎(chǔ)上采用回流堿化衍生法建立復(fù)方石韋片中黃芪甲苷含量測(cè)定方法,以期提供一種更準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、高效的黃芪甲苷含量測(cè)定方法,同時(shí)為復(fù)方石韋片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器及試劑 Agilent 1260 Ⅱ型高效液相色譜儀(蒸發(fā)光檢測(cè)器,Aglient);DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋(泰斯特);XSE205DU十萬(wàn)分之一電子分析天平(梅特勒—托利多)。乙腈(色譜純,美國(guó)Merck公司);甲醇(分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);正丁醇(分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);水為三級(jí)返滲超純水。

1.2 試藥 黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào)：110781-202118,濃度：96.8%),購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院;復(fù)方石韋片(批號(hào)：730391、830223、830040、830225、030470、030443、030471、030475、030574、030045、030469、030473、130030、130023、130066、130068)為頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱Agilent 5-HC C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相為乙睛—水(34∶66),流速1.0 ml/min,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量20 μl;蒸發(fā)光檢測(cè)器參數(shù)：載氣流速1.6 L/min,漂移管溫度100 ℃,理論板數(shù)按照黃芪甲苷色譜峰計(jì)算應(yīng)≥4 000。

2.2 樣品

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)取黃芪甲苷對(duì)照品適量,用甲醇作為溶解劑進(jìn)行溶解,制成每1 ml含黃芪甲苷對(duì)照品200 μg的溶液,作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備：取復(fù)方石韋片樣品適量,除去包衣,研磨成細(xì)粉,精密稱(chēng)定2 g,放置于100 ml具塞錐形瓶中,精密加入含0.2%氫氧化鈉溶液的80%甲醇溶液50 ml, 密塞,稱(chēng)重,加熱回流1 h,放冷,再次稱(chēng)重,用含0.2%氫氧化鈉溶液的80%甲醇溶液補(bǔ)重,搖勻,濾過(guò),移液管精密吸取續(xù)濾液25 ml,水浴蒸干,殘?jiān)?0 ml的水溶解,再用水飽和的正丁醇萃取4次,每次20 ml,合并正丁醇萃取液,再次蒸干,殘?jiān)眠m量的甲醇充分溶解,移至5 ml的容量瓶中,用甲醇溶液定容至刻度,搖勻,用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,即為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備：取復(fù)方石韋片組方中其他三味中藥按比例及工藝制備樣品,按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備成不含黃芪的陰性樣品溶液。

2.3 空白試驗(yàn) 按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件,分別精密吸取“2.2.1”“2.2.2”“2.2.3”項(xiàng)下的對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液,進(jìn)行色譜分析檢測(cè),圖譜結(jié)果顯示,在此色譜條件下,黃芪甲苷峰形對(duì)稱(chēng),與相鄰色譜峰分離良好,陰性樣品對(duì)樣品檢測(cè)無(wú)干擾,見(jiàn)圖1。

A.對(duì)照品色譜圖

2.4 線性關(guān)系 取黃芪甲苷對(duì)照品適量,加甲醇制成2.043 mg/ml的對(duì)照品溶液。采用倍比稀釋法加甲醇分別制成1.021 5、0.510 75、0.204 3、0.051 07、0.020 43 mg/ml對(duì)照品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 μl,以對(duì)照品峰面積的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(X),以對(duì)照品進(jìn)樣質(zhì)量的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸分析并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出線性回歸方程為Y=0.788 6X-4.920 1,r=0.999 6。結(jié)果表明,黃芪甲苷在0.020 43～2.043 mg/ml范圍內(nèi),黃芪甲苷峰面積與黃芪甲苷進(jìn)樣質(zhì)量的對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取適量的復(fù)方石韋片樣品,按照上述方法制備供試品溶液,并按照上述色譜條件,分別于0、2、4、6、8、10、12 h時(shí)進(jìn)樣分析測(cè)定,記錄圖譜并計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示,黃芪甲苷峰面積的RSD值為2.7%,提示復(fù)方石韋片供試品溶液在12 h內(nèi)能保持穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取適量同批次復(fù)方石韋片樣品(批號(hào)：730391),按照上述方法制備供試品溶液,并按照上述色譜條件,記錄圖譜,計(jì)算樣品中黃芪甲苷含量及RSD值。結(jié)果顯示,本批復(fù)方石韋片黃芪甲苷的平均含量為704.8 μg/g,RSD值為1.7%,提示該方法重復(fù)性良好。

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下黃芪甲苷(0.202 4 mg/ml)對(duì)照品溶液,按照上述方法制備供試品溶液,并按照上述色譜條件,記錄圖譜并計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示,黃芪甲苷峰面積的RSD值為1.2%,提示儀器精密度符合要求。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 稱(chēng)取9份已知含量的復(fù)方石韋片樣品(批號(hào)：730391),均分為3組,分別加入3組不同濃度的黃芪甲苷對(duì)照品溶液,按照上述方法制備供試品溶液,并按照上述色譜條件,記錄圖譜,計(jì)算加樣回收率及RSD值,結(jié)果顯示,黃芪甲苷的平均加樣回收率為97.3%,RSD值為2.4%,回收率良好,見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 檢測(cè)限 取標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)工作液中最低濃度的對(duì)照品溶液稀釋,按上述色譜條件進(jìn)樣,然后按倍數(shù)稀釋對(duì)照品溶液,測(cè)得信噪比為3∶1時(shí),黃芪甲苷對(duì)照品溶液濃度為0.002 553 5 mg/ml,確定檢測(cè)限為0.051 07 μg。

2.10 定量限 取標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)工作液中最低濃度的對(duì)照品溶液稀釋,按上述色譜條件進(jìn)樣,然后按倍數(shù)稀釋對(duì)照品溶液,測(cè)得信噪比為10∶1時(shí),黃芪甲苷對(duì)照品溶液濃度為0.001 02 mg/ml,確定定量限為0.020 43 μg。

2.11 樣品測(cè)定 取待測(cè)的16批復(fù)方石韋片樣品,按照上述方法制備供試品溶液,并按照上述色譜條件,按《中國(guó)藥典》[6]復(fù)方石韋片項(xiàng)下黃芪甲苷含量測(cè)定方法檢測(cè),分別計(jì)算樣品含量。結(jié)果,采用回流堿化衍生法測(cè)得的16批復(fù)方石韋片樣品中黃芪甲苷含量為0.60～0.98 mg/g,平均值0.75 mg/g,采用藥典方法測(cè)得的16批復(fù)方石韋片樣品中黃芪甲苷含量為0.55～0.93 mg/g,平均值0.67 mg/g,同批次復(fù)方石韋片樣品采用回流衍生法的含量測(cè)定結(jié)果均略高于采用藥典方法的含量測(cè)定結(jié)果,見(jiàn)表2。

表2 復(fù)方石韋片樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論

3.1 色譜條件的優(yōu)化 參照相關(guān)文獻(xiàn)[13-15],考察不同的流動(dòng)相體系及不同的流動(dòng)相比例(乙腈—水、甲醇—水、乙腈—0.2%甲酸水溶液、甲醇—0.2%甲酸水溶液),經(jīng)比較采用結(jié)果顯示選用乙腈—水(34∶66)等度洗脫時(shí),基線平穩(wěn),黃芪甲苷分離效果好。同時(shí)考察了不同的漂移管溫度(80、90、100 ℃)和不同的載氣體積流量(1.6、2.0、2.6 L/min),結(jié)果當(dāng)漂移管溫度100 ℃,載氣體積流量1.6 L/min時(shí),待測(cè)色譜峰達(dá)到基線分離,色譜圖較理想。

3.2 采用不同提取溶劑進(jìn)行比較 參照相關(guān)文獻(xiàn)[16-20],本研究考察了不同提取液：80%甲醇溶液(含4%濃氨試液)、80%甲醇溶液(含10%濃氨試液)、80%甲醇溶液(含0.1%氫氧化鈉溶液)、80%甲醇溶液(含0.2%氫氧化鈉溶液)、80%甲醇溶液(含0.4%氫氧化鈉溶液),結(jié)果顯示采用80%甲醇溶液(含0.2%氫氧化鈉溶液)提取液可以把樣品提取完全。

3.3 采用不同量的提取溶劑進(jìn)行比較 本研究考察了不同提取液(含0.2%氫氧化鈉溶液的80%甲醇溶液)體積：25、50、100 ml,結(jié)果顯示提取液體積為50 ml與100 ml時(shí)測(cè)得樣品黃芪甲苷含量無(wú)明顯差別,且均高于提取液體積為25 ml時(shí),說(shuō)明加入50 ml的提取液已把樣品提取完全。

3.4 采用不同提取時(shí)間進(jìn)行比較 本研究考察了不同加熱回流時(shí)間：30、60、90 min,結(jié)果顯示加熱回流60 min與90 min時(shí)測(cè)得樣品黃芪甲苷含量無(wú)明顯差別,且均高于加熱回流30 min,說(shuō)明提取時(shí)間為60 min時(shí)已把樣品提取完全。

綜上所述,本研究以藥典法測(cè)定復(fù)方石韋片中黃芪甲苷的原理為基礎(chǔ), 采用回流堿化衍生法建立的方法操作更加簡(jiǎn)便、結(jié)果穩(wěn)定、黃芪甲苷衍生物轉(zhuǎn)化效率高、可重復(fù)性好,可用于測(cè)定復(fù)方石韋片中黃芪甲苷的含量,同時(shí)也為其他含黃芪制劑的質(zhì)量控制提供參考。

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