催乳素對(duì)奶牛RANKL 基因啟動(dòng)子活性的研究

毛永盡，楊慧琳，馬曉聰，趙鋒，崔英俊

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 哈爾濱 150030）

0 引 言

核因子κB 受體活化因子配體（R eceptor activator of the N F-κB ligand，RANKL），俗稱TRANCE、ODF、OPGL、TN FSF11。RANKL 是國(guó)際上普遍接受的名字。T 淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、乳腺上皮細(xì)胞等都能夠表達(dá)RANKL。RANKL與其同源性受體RANK 相互作用，能夠活化下游的信號(hào)通路，從而對(duì)骨重建，促進(jìn)乳腺發(fā)育，T、B 細(xì)胞的早期分化，淋巴結(jié)形成，體溫調(diào)節(jié)等重要生理過(guò)程發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[1-2]。在乳腺中，RANKL 能夠以自分泌或旁分泌的方式影響乳腺上皮細(xì)胞的增殖分化及腺泡腔的形成過(guò)程[3-5]。研究表明RAN KL 缺陷會(huì)使妊娠期小鼠乳腺組織中乳腺上皮細(xì)胞增殖受到抑制、細(xì)胞凋亡增加、導(dǎo)管側(cè)枝和腺泡發(fā)育受損，從而導(dǎo)致分娩時(shí)泌乳過(guò)程受阻[6]。已有研究表明RAN KL 是催乳素（Prolactin, PR L）信號(hào)途徑重要的下游調(diào)節(jié)者，參與PR L 調(diào)節(jié)的乳腺組織發(fā)育過(guò)程。在體內(nèi)及體外PR L 都能夠誘導(dǎo)RANKL 的表達(dá)[7-8]。敲除研究表明PR LR 缺陷會(huì)導(dǎo)致RANKL 表達(dá)量下降，小鼠乳腺組織呈現(xiàn)出與RANKL/RANK 功能缺陷相同的表型[9]。而PR L 調(diào)控RANKL 表達(dá)的分子機(jī)制還未見報(bào)道。本研究以奶牛乳腺上皮細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探索PR L 調(diào)節(jié)RANKL表達(dá)的分子機(jī)制，旨在進(jìn)一步豐富和完善PR L 調(diào)控奶牛乳腺組織發(fā)育及泌乳的調(diào)控機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

DM EM/F12 培養(yǎng)基粉末、0.25% T rypsin-EDTA，Gibco；Dual-Luciferase Reporter Assay System，Prom ega；RANKL 抗體、STAT 5a 抗體、p-STAT 5a 抗體，Cell Signaling Technology；Lipofectamine 2000，Invitrogen；Kpn Ι 和Bgl Ⅱ限制性內(nèi)切酶，Takara；CK-18 抗體，F(xiàn)ITC 標(biāo)記山羊抗兔二抗，Bioss；Pro lactin，Peprotech。

激光共聚焦掃描顯微鏡，德國(guó)Leica；PCR 儀、CO-150 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)Eppendorf；G lo－M ax 20/20 Luminom eter，Prom ega。

1.2 方法

1.2.1 乳腺上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定

取泌乳期荷斯坦奶牛健康新鮮乳腺組織，剔除多余脂肪和結(jié)締組織，采用酶消化法從組織中分離乳腺上皮細(xì)胞。將得到的原代乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)在鼠尾膠原包被的培養(yǎng)瓶中，使用DM EM/F12 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，100 μg/m L 鏈霉素，100 U/m L 青霉素），37 ℃，5% CO2條件下，進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。使用胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞傳代及純化處理，將純化后得到的乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行CK-18 鑒定。

1.2.2 奶牛RANKL 啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建

采用DN A 提取試劑盒以奶牛乳腺上皮細(xì)胞中提取基因組DNA。以NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)提供的牛源RANKL基因啟動(dòng)子序列為模板，采用Prim er 5 軟件設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物序列如表1 所示。將PCR 擴(kuò)增得到的基因片段與PGL3-Basic 載體，分別使用KpnΙ 和BglⅡ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切反應(yīng)。將酶切后DN A 片段與質(zhì)粒載體進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，構(gòu)建重組PGL3質(zhì)粒，分別命名為：P-RAN KL-1428（L-1428）、PRAN KL-883（L-883）、P-RAN KL-239（L-239）、PRANKL-90（L-90）。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切及San-ger 測(cè)序驗(yàn)證。

表1 RANKL 基因啟動(dòng)子引物序列

1.2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

將乳腺上皮細(xì)胞接種在12 孔板中，細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理。采用Lipo fectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑將PGL3-Basic（陰性對(duì)照）、PGL3-CM V（陽(yáng)性對(duì)照）、L-1428、L-883、L-239、L-90 6 種質(zhì)粒與pR LTK 質(zhì)粒按照50∶1 的比例共轉(zhuǎn)染至乳腺上皮細(xì)胞中，具體實(shí)驗(yàn)操作按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染6 h，在相應(yīng)組中添加PR L 處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。采用Dual-Luciferase R eporter Assay System 來(lái)檢測(cè)熒光素酶活性。

1.2.4 W estern Blot

采用R IPA 裂解液從處理后的乳腺上皮細(xì)胞中提取總蛋白，并使用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定，具體操作按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。每孔40 μg 總蛋白用10%SDS-PAGE 進(jìn)行電泳，然后將其轉(zhuǎn)移到NC 膜上。將NC 膜用5%脫脂乳封閉2 h、37 ℃，用相應(yīng)一抗4 ℃孵育過(guò)夜。將NC 膜充分清洗后，HRP 標(biāo)記的二抗37 ℃孵育1 h。加入ECL發(fā)光液檢測(cè)蛋白條帶，并使用Im ageJ 對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用G raphpad Prism 8.0 對(duì)3 組獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理并作圖。所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，“*”表示P< 0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異“**”表示P<0.01，有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；“ns”表示P> 0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳腺上皮細(xì)胞的鑒定

采用免疫熒光染色法對(duì)乳腺上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物角蛋白18（CK-18）進(jìn)行鑒定，激光共聚焦顯微鏡掃描結(jié)果如圖1 所示。圖中藍(lán)色物質(zhì)代表DAPI 染色的細(xì)胞核；綠色物質(zhì)則代表FITC 染色的CK-18。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分離純化得到的細(xì)胞為奶牛乳腺上皮細(xì)胞。

圖1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞CK-18 鑒定結(jié)果

2.2 PRL 對(duì)RANKL 蛋白表達(dá)的影響

1 μg/m L PR L 處理乳腺上皮細(xì)胞48 h，采用W estern Blot 方法檢測(cè)PRLR、p-STAT 5a 以及RANKL 蛋白水平變化，結(jié)果如圖2 所示。與對(duì)照組相比，PRL 能夠顯著提高PR LR、p-STAT 5a 以及RANKL蛋白的表達(dá)（P< 0.05），而STAT 5a 蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著變化（P> 0.05）。

圖2 PRL 對(duì)RANKL 蛋白表達(dá)的影響

2.3 RANKL 啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建

采用KpnΙ 和BglⅡ限制性內(nèi)切酶對(duì)L-1428、L-883、L-239 及L-90 重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖3 所示。電泳結(jié)果顯示，在預(yù)期位置都出現(xiàn)相應(yīng)大小的DNA 條帶，結(jié)果說(shuō)明L-1428、L-883、L-239及L-90 雙熒光素酶載體構(gòu)建成功。

圖3 RANKL 啟動(dòng)子雙熒光素酶載體雙酶切結(jié)果

2.4 PRL 對(duì)RANKL 啟動(dòng)子活性的影響

將PGL3-Basic、PGL3-CM V、L-1428、L-883、L-239 及L-90 載體與pR L-TK 共轉(zhuǎn)染至乳腺上皮細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染6 h 后，添加PR L 刺激，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)RANKL 啟動(dòng)子不同長(zhǎng)度區(qū)段的熒光素酶活性，結(jié)果如圖4 所示。與對(duì)照組相比，PR L 處理后，L-1428 和L-883 啟動(dòng)子活性顯著增加（P< 0.05），而L-239，L-90 啟動(dòng)子活性無(wú)顯著變化（P> 0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在RANKL 基因啟動(dòng)子在-883~ -239 bp 區(qū)段存在著PR L 響應(yīng)元件。

圖4 PRL 對(duì)RANKL 啟動(dòng)子活性的影響

采用JASPAR 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)RANKL基因啟動(dòng)子-883~-239 bp 區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，在-826~-814 bp 位置存在GAS 位點(diǎn)（5′-GGTTCCTATAAGC-3′）。為驗(yàn)證潛在的GAS 位點(diǎn)，采用定點(diǎn)突變的方法將該位點(diǎn)突變?yōu)?′- ATGATGATAGTCA-3′，構(gòu)建突變型L-883-M ut 熒光素酶載體。分別將野生型L-883-W t 和突變型L-883-M ut 載體轉(zhuǎn)染至乳腺上皮細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染6 h后，添加PR L 刺激，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)RANKL 啟動(dòng)子熒光素酶活性，結(jié)果如圖5 所示。與對(duì)照組相比，PR L 能夠顯著增加野生型L-883-W t 啟動(dòng)子活性（P< 0.05），而突變型L-883-M ut 對(duì)PR L 刺激無(wú)顯著變化（P> 0.05）。

圖5 PRL 對(duì)突變型RANKL 啟動(dòng)子活性的影響

3 討論與結(jié)論

乳腺是一個(gè)動(dòng)態(tài)發(fā)育器官，其發(fā)育過(guò)程主要發(fā)生在出生后[10]。新出生時(shí)乳腺組織中只有少量初步形態(tài)的導(dǎo)管，在甾體類激素、多肽類激素和一些細(xì)胞因子的控制下，乳腺組織逐漸發(fā)育完善[11-12]。PR L 是由垂體前葉催乳激素細(xì)胞分泌的多肽類激素，能夠促進(jìn)乳腺發(fā)育生長(zhǎng)，啟動(dòng)且維持泌乳過(guò)程，并提高乳產(chǎn)量[13-15]。PR L 既能夠通過(guò)間接調(diào)控孕酮的分泌來(lái)調(diào)控乳腺導(dǎo)管分支，也能夠直接作用于乳腺上皮細(xì)胞，來(lái)促使腺泡結(jié)構(gòu)的形成[9]，因此在青春期及妊娠期，PR L 能夠以旁分泌、自分泌和內(nèi)分泌的形式調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)的相互作用，從而控制著乳腺上皮細(xì)胞的增殖、乳腺導(dǎo)管延伸及分支和腺泡腔結(jié)構(gòu)的形成[14-16]。PR L 與其受體PR LR 是乳腺上皮細(xì)胞增殖分化以及腺泡腔形成的重要驅(qū)動(dòng)力[17]。RAN KL 是乳腺上皮細(xì)胞增殖和分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，RANKL能夠促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖、存活及小葉腺泡發(fā)育過(guò)程，特別是腺泡發(fā)育后期所必需[18-19]。已有研究發(fā)現(xiàn)，RANKL 是PR L 途徑主要的下游信號(hào)分子，是PRL誘導(dǎo)乳腺發(fā)育關(guān)鍵調(diào)控因子[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中，PRL 能夠顯著提高RANKL 蛋白的表達(dá)。

轉(zhuǎn)錄因子STAT 5 在泌乳期乳腺組織中被首次發(fā)現(xiàn)，是PRL 途徑最重要的轉(zhuǎn)錄因子[20]。PR L 與其受體PR LR 結(jié)合引起受體二聚化，從而激活JAK 2，導(dǎo)致STAT 5 發(fā)生磷酸化[21-22]。一旦被激活，磷酸化的STAT 5蛋白分子會(huì)形成同源或者異源活性二聚體轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核，與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域GAS 位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄水平[23-25]。研究發(fā)現(xiàn)PR LR 和STAT 5a 是乳腺上皮細(xì)胞增殖分化所必需的[26-27]，STAT 5a 缺失會(huì)引起引起乳腺上皮細(xì)胞凋亡增加[28]。在乳腺組織中，STAT 5a不僅調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的增殖分化和存活[29]，還參與泌乳期乳蛋白的合成過(guò)程[30]，例如STAT 5a 直接調(diào)節(jié)β-casein啟動(dòng)子活性來(lái)促進(jìn)β-casein的表達(dá)。PR L 刺激引起STAT 5 被迅速招募到Cyclin D1啟動(dòng)子區(qū)域，增強(qiáng)Cyclin D1啟動(dòng)子活性[31-32]。本研究發(fā)現(xiàn)，PRL 刺激能夠顯著增加RANKL L-1428 和L-883 片段啟動(dòng)子活性，而對(duì)L-239 和L-90 片段啟動(dòng)子活性無(wú)影響。由此推測(cè)潛在PR L 響應(yīng)元件位于RANKL 基因啟動(dòng)子-883~-239 bp 區(qū)域。早期研究也發(fā)現(xiàn)在小鼠內(nèi)源性RANKL啟動(dòng)子中含有能夠被PR L 激活的GAS 位點(diǎn)[33]。本研究采用定點(diǎn)突變的方法證明在奶牛RAN KL 基因啟動(dòng)子-826~-814 bp 位點(diǎn)存在一個(gè)GAS 位點(diǎn)，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的核心區(qū)段，該位點(diǎn)能夠響應(yīng)PR L 刺激。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中，PRL 通過(guò)調(diào)控RANKL 啟動(dòng)子活性，促進(jìn)RANKL 的表達(dá)。該結(jié)果為PRL 參與奶牛乳腺組織發(fā)育及泌乳過(guò)程提供了理論基礎(chǔ)，進(jìn)一步豐富和完善了PR L 在乳腺組織中的分子調(diào)控機(jī)制。