響應面結合模糊數(shù)學制備奶酪美拉德反應物的研究

高鵬，張文遠，徐琛，趙曉璇，謝寧，王筠鈉，逄曉陽，張書文，呂加平

（中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

0 引 言

奶酪被譽為“奶黃金”，是牛奶或羊奶經(jīng)凝乳發(fā)酵、排乳清濃縮、成熟等獲得的高端營養(yǎng)食品[1]。奶酪富含蛋白質(zhì)，是蛋白水解的優(yōu)質(zhì)原料。通常情況下，直接酶解蛋白質(zhì)獲得的蛋白水解液存在風味寡淡等缺陷，而在此基礎上的美拉德增香反應可提高產(chǎn)品風味[2-3]。美拉德反應主要發(fā)生在氨基和羰基之間，且受反應工藝條件的影響[4-5]。在食品中，美拉德反應主要能用于功能性開發(fā)及食品增香，但此方面的研究主要集中在肉制品及植物基食品中[4,6-9]。在乳制品中對于美拉德反應的研究大多集中在不同熱處理乳、嬰幼兒配方奶粉等在熱加工過程及儲藏過程中的美拉德副產(chǎn)物的報道[10-12]，也有少數(shù)聚焦于褐色酸奶的制作及其風味特性研究[13]。目前，關于富含氨基化合物的奶酪酶解液在美拉德產(chǎn)香反應及改善顏色2 個方面的研究較少。其中，產(chǎn)物的褐變程度能集中體現(xiàn)美拉德反應進程，褐變度與美拉德反應程度呈正相關性，而風味評價主要包括感官評價、電子鼻、電子舌等模擬評價及風味成分檢測。感官評價依靠人體主觀味覺和嗅覺評價食品的風味品質(zhì)，具有一定的主觀性和不確定性，模糊數(shù)學方法能降低感官評價者的主觀偏差，使結果更加科學準確[14]。因此，本文以奶酪凝乳調(diào)配物的蛋白水解產(chǎn)物為基礎，結合D-木糖和D-葡萄糖設計單因素及響應面美拉德反應實驗，確定最佳生產(chǎn)工藝，制備得到最佳產(chǎn)物并分析其風味特征，為工業(yè)上制備奶酪風味香料提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬蘇里拉奶酪凝乳（水分48.0%、蛋白23.0%、脂肪26%、糖<0.5%），德國DM K 公司；乳化鹽（磷酸氫二鈉），北京萃鋒科技有限公司；三聚磷酸鈉，北京沃格東方科技有限公司；檸檬酸鈉，北京依珊匯通科技有限公司；蛋白酶Protease 2SD (100 000 U/g)，上海天野酶制造有限公司；木糖、葡萄糖，北京萃鋒科技有限公司。

1.2 儀器與設備

TS-25C 反式高溫蒸煮鍋，北京蘭德梅克科技開發(fā)有限公司；SPARK 20M 酶標儀，TECAN；DJ5-2012R 歐偌智能搖床，上海世平實驗設備有限公司；QP2010 Plus 氣相色譜-質(zhì)譜分析儀，日本島津。

1.3 實驗方法

1.3.1 奶酪酶解液的制備

按奶酪?！盟萌榛}=56.7∶41∶2.3 制備奶酪漿，邊加熱邊用組織分散機于80 ℃下剪切15 min，使奶酪粒乳化成均勻漿液，快速冷卻到45 ℃后，加入0.4%（占奶酪粒重量比例）的蛋白酶Protease 2SD 于45 ℃、250 r/min 搖床酶解4 h，無pH 控制。然后，將樣品置于90 ℃，20 min 滅酶，快速冷卻到室溫后用食用堿調(diào)節(jié)酶解液pH 至7.0，分別加入葡萄糖、木糖，攪拌并加熱使其反應，反應結束后取出物料，快速冷卻待分析。

1.3.2 美拉德反應條件單因素試驗設計

1.3.2.1 反應工藝條件單因素優(yōu)化選擇

控制葡萄糖∶木糖=1∶2，物料初始pH 為7.0，采用控制變量法設計美拉德反應溫度、反應時間及總糖添加量工藝條件，其中，總糖添加量范圍在2%～10%（占物料的百分比），反應溫度范圍在80～120 ℃，反應時間范圍在0～120 min。

1.3.2.2 單因素工藝優(yōu)化評價指標

（1）熒光強度的測定。待測樣品用實驗室超純水稀釋100 倍，于347 nm 的激發(fā)波長和415 nm 的發(fā)射波長處測定樣品熒光強度。

（2）褐變度的測定。褐變度常用于評估美拉德反應的劇烈程度，褐變度越大，反應越劇烈。褐變度的測定參考文獻[15] 并略微改動。樣品稀釋200 倍后用酶標儀記載294 nm 和420 nm 波長處分別測定不同糖基化樣品的吸光度。

（3）Friedm an 排序檢驗。感官評價由10 位（5 名女性，5 名男性，年齡分布在18～30 周歲）經(jīng)驗豐富的感官評價員進行評價，感官標準參考RHB301-2004。評分采用分值制（1～5 分，1 分最討厭，5 分最喜歡），并通過多重比較分析結果差異度。

1.3.3 美拉德反應條件優(yōu)化的響應面試驗設計

試驗設計如表1 所示，分別選取反應溫度、時間及總還原糖添加量3 個因素的3 個水平，通過軟件設計得到15 種實驗組合，計算模糊數(shù)學感官得分，進而確定最優(yōu)工藝。

表1 響應面試驗設計因素與水平

1.3.4 感官評價模糊數(shù)學模型的建立

1.3.4.1 因素集和評語集的建立

因素集U={u1，u2，u3}={滋味與氣味，組織狀態(tài)，色澤};評語集V={v1，v2，v3，v4，v5}={很好，較好，中，較差，很差}，評分時，v1=4 分，v2=3 分，v3=2 分，v4=1 分，v5=0 分。感官評價標準如表2。

表2 感官評價標準

1.3.4.2 感官評價因素權重系數(shù)的確立

采用用戶調(diào)查法結合RHB301-2004“全脂加糖煉乳感官質(zhì)量評鑒細則”確定奶酪美拉德反應液評價過程中各因素所占權重。最終確定權重W={滋味與氣味W1；組織狀態(tài)W2；色澤W3}，其中W1=0.80；W2=0.15；W3=0.05。

1.3.4.3 感官評分的計算

奶酪酶解液的美拉德反應產(chǎn)物感官指標綜合評判的結果用R表示，R=W×A，其中，W表示權重，A為模糊矩陣。固定賦值：很好，4 分；較好，3 分；中，2分；較差，1 分；很差，0 分。通過加和R的各個量與賦值的乘積，得到每個樣品的感官評分。

1.3.5 肽段分子量及揮發(fā)性物質(zhì)測定

測定方法均參考文獻[16] 。肽段分子量的測定方法如下：取適量樣品于9 000 r/min 離心10 min 去除脂肪，上清液加入等體積的10%的三氯乙酸沉淀去除蛋白，繼續(xù)在6 000 r/min 離心5 min，吸取上清液通過0.22 μm 的水系濾膜后放于進樣小瓶進樣。采用配有W aters 2487 紫外檢測器的超高效液相色譜分析奶酪酶解液及美拉德反應物的肽段分子量分布。色譜柱：2 000(300×7.8 mm)SW XL TSK(Tosoh Co.,Tokyo,Japan)。流動相為含0.1%三氟乙酸的55% (V/V)乙腈溶液，采用等梯度洗脫。樣品以0.5 m L/min 的流速洗脫，在214 nm、40 ℃下檢測。進樣體積10 μL。采用上海源葉生物技術有限公司的4 種標準品:抑肽酶(6 ku)、桿菌肽(1.5 ku)、四肽GGTA(450 u)和二肽GS(150 u)。

本研究使用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（SPM E-GC/M S）測定樣品揮發(fā)性風味物質(zhì)。頂空固相萃取條件：纖維頭PDM S/DVB；平衡溫度：50 ℃；震蕩萃取時間：30 min；色譜柱DB-W AX (30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度：250 ℃，載氣為氦氣，流速為1.0 m L/min。程序升溫條件：40 ℃保持3 min，以5 ℃/min升溫至200 ℃，保持5 min，繼續(xù)以10 ℃/min 升溫至230 ℃。質(zhì)譜條件：電離方式為EI，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃。采用全掃描方式，范圍為35 ～350 m/z。

化合物采用2 種方法定性：通過與質(zhì)譜文庫(N IST 17-1、17-2 和17 s)比對，并用保留指數(shù)(R I)進行鑒定。一系列的正構烷烴（C 7-C 40）為外部參比，測定各化合物的R I。R I 計算公式為:R I = 100 n + 100(ti- tn)/ (tn+1 - tn)，其中ti、tn和tn+1 分別為化合物i、烷烴n 和烷烴n+1 (tn

1.4 數(shù)據(jù)處理

Friedm an 排序檢驗結果的多重比較及數(shù)據(jù)間方差分析均采用SPSS 23 軟件完成，Duncan 法進行各組數(shù)據(jù)間差異性比較（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 總還原糖添加量對美拉德反應的影響

美拉德反應的中間產(chǎn)物具有熒光性，故通過測定反應體系的熒光強度可以反映奶酪酶解液的褐變反應程度。另外，美拉德反應中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物的累積可以由反應體系在294 nm 和420 nm 波長處的吸光度反映[4]。糖添加量對反應褐變度影響結果顯示如圖1所示，樣品熒光強度及吸光度受糖含量的影響，在一定糖含量范圍內(nèi)（2%～8%），熒光強度及吸光度（294 nm）逐漸增加，超出8%后，樣品整體褐變度略有下降。值得注意的是，糖添加量的增加對美拉德反應終產(chǎn)物的累積影響不大。糖、醛及小分子酮等主要是美拉德反應中產(chǎn)生的無色中間產(chǎn)物，主要反映在294 nm 波長處，420 nm 處吸光度代表了美拉德反應產(chǎn)生的一些終端產(chǎn)物（如類黑精）。

圖1 總糖添加量對美拉德反應產(chǎn)物褐變程度的影響

如表3 所示，統(tǒng)計量F=4.560 （SPSS）。對比Friedm an 秩和檢驗近似臨界值表可得，P，J，a（5，10，0.01）的臨界值為13.38 > F=4.560。由此可知不同糖量的添加對于產(chǎn)物感官評分影響在0.01 水平下不顯著。但由于RC=39 最大，確定以6%還原糖添加量為中心點進行響應面實驗設計。

表3 不同還原糖添加量下樣品的秩和

2.1.2 反應時間對美拉德反應的影響

由圖2 可知，在反應0～120 min 內(nèi)，樣品的熒光強度及294 nm 波長處的吸光度隨著反應時間的延長而逐漸增加，這表明一些糖、醛等無色中間產(chǎn)物隨著反應時間的延長而逐漸增加。

圖2 反應時間對美拉德反應產(chǎn)物褐變程度的影響

如表4 所示，統(tǒng)計量F=14.000 > 13.38，表明各組樣品存在顯著性差異。RC=39 達到最高，RC=15 為最低（120 min），即在其它條件固定不變下，樣品在反應60 min 后最理想，而反應時間過短或過長都不利于樣品風味的發(fā)展。

表4 不同反應時間下樣品的秩和

2.1.3 反應溫度對美拉德反應的影響

從圖3 可以看出，反應溫度在90 ℃時屬于美拉德反應拐點，在反應溫度從90 ℃上升到100 ℃時，奶酪酶解液的褐變度急劇增加。超過100 ℃后，美拉德反應進程緩慢，甚至熒光性中間產(chǎn)物略有下降，這可能是由于某些熒光性物質(zhì)轉變成其它非熒光性物質(zhì)。

圖3 反應溫度對美拉德反應產(chǎn)物褐變程度的影響

如表5 所示，F(xiàn)=17.840 > 13.38，差異性顯著。C 樣品整體風味協(xié)調(diào)，焦香味適中，具有類似薩姆奶茶及奶咖啡的味道。A 香氣略偏向牛奶，而D 和E 的糊味較重，而RC=40 得分最高，由此可見，美拉德反應溫度在100 ℃時較好。

表5 不同反應溫度下樣品的秩和

2.2 響應面試驗結果及最佳工藝驗證

根據(jù)響應面試驗設計得到15 組試驗方案，由10 名感官評定人員對試驗方案樣品的滋味和氣味、組織狀態(tài)、色澤進行感官評定選擇，統(tǒng)計匯總后結果如表6 所示。

表6 奶酪美拉德反應產(chǎn)物的感官評定票數(shù)統(tǒng)計分布

將票數(shù)折算成贊成的比率，得到模糊矩陣Aj。如下所示：試驗1 號的模糊矩陣為同理可得2 號～15 號。

依據(jù)模糊綜合評判數(shù)學模型原理，采用矩陣乘法計算規(guī)避因大取小算法產(chǎn)生的誤差。以試驗1 號樣品為例：R1=W×A1=（0.8，0.15，0.05）×(0.015，0.295，0.220，0.285，0.185)。

將綜合評判結果的每個量分別乘以其對應的分值相加可得出樣品的最后總得分，試驗1 號總得分為0.015×4+0.295×3+0.220×2+0.285×1+0.185×0=1.67。同理可得2 號～15 號感官評分。綜合評判結果如表7所示，模糊數(shù)學感官評分最高為R13=3.125。

表7 綜合評判結果和感官評分

利用設計軟件Design-Expert 對數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，獲得反應溫度（A）、反應時間（B）、糖添加量（C）的二次多項回歸方程為：R=-63.67375+1.18321A+0.113931B+1.11937C-0.000433AB-0.001625AC-0.000333BC-0.005667A2-0.000574B2-0.074792C2。對回歸方程進行方差分析，結果如表8。

表8 回歸模型方差分析及回歸方程系數(shù)顯著性檢驗

如表8 所示，回歸模型P<0.001（極顯著）；A、C在一次項中影響顯著。通過對3 個因素的F值大小進行比較，結果表明3 個因素對美拉德反應液感官評分影響的主次順序為酶解溫度（A）>糖添加量（C）>酶解時間（B）；AB相互作用顯著，R2=0.9859 說明回歸方程擬合度好，該模型成立，可進行預測分析。根據(jù)所建立的數(shù)學模型進行參數(shù)最優(yōu)化分析，得到最優(yōu)反應條件為反應溫度101 ℃，時間59 min，糖添加量6.25%。固定此條件不變，制備3 次平行試驗，實際得到綜合評分平均值為3.123 分，優(yōu)于預測值。由此可見，響應面結合模糊數(shù)學感官評價對于優(yōu)化奶酪蛋白水解物美拉德反應條件具有實用價值。

2.3 肽段分子質(zhì)量分析

圖4 展示了奶酪酶解液及美拉德反應過程中的肽段分子質(zhì)量分布變化，分別是<150 u，150～450 u，450～1 500 u，1 500～3000 u，3 000～6 000 u 以及>6 000 u。從圖中可以看出，奶酪美拉德反應液中<150 u 的肽段較奶酪酶解液顯著降低，這說明<150 u 的小肽及游離氨基酸可能是發(fā)生美拉德反應的主要原料。而發(fā)生美拉德反應后，150～450 u 范圍的肽段顯著增加，這可能是加熱過程中某些小肽發(fā)生交聯(lián)作用的結果[17]。據(jù)報道，美拉德反應中分子質(zhì)量較小的交聯(lián)產(chǎn)物能提高最終產(chǎn)物的持續(xù)感和醇厚感[18-19]。

圖4 奶酪酶解液及美拉德反應中肽段分子質(zhì)量分布變化

2.4 揮發(fā)性風味物質(zhì)分析

盡管美拉德反應程度可以通過反應液色澤及吸光度判斷，但樣品的關鍵香味成分仍有必要確定。對最優(yōu)工藝條件下的奶酪肽樣品及其美拉德反應產(chǎn)物進行GC-M S 定性分析，總共鑒定出30 種揮發(fā)性風味成分，包括酸、酮、醛及吡嗪等。圖5 展示了對奶酪酶解肽液及其美拉德反應產(chǎn)物的揮發(fā)性物質(zhì)分析結果。其中，圖5a 經(jīng)過列標準化處理及聚類分析，以便比較每一列中同一種化合物在奶酪肽及其美拉德反應產(chǎn)物中的含量差異，圖5b 經(jīng)過行標準化處理及聚類分析，可以比較各個化合物分別在奶酪肽及其美拉德反應產(chǎn)物中的分布差異。明顯地，在奶酪蛋白酶解液（P）中含有烷基、部分酸、內(nèi)酯和乙偶姻，呈現(xiàn)一定的奶油味。在奶酪美拉德反應液中（PH），吡嗪類化合物（9 種）及酮類化合物含量豐富，吡嗪類化合物存在于絕大多數(shù)的美拉德反應產(chǎn)物中并占主導地位。由圖5b 可知，在奶酪蛋白酶解液中，苯乙酮、癸酸、己酸、乙偶姻及辛酸為主要的揮發(fā)性風味物質(zhì)，苯乙酮有杏仁味和堅果味，乙偶姻有奶油香氣[20]。而在奶酪肽美拉德反應物中，2,5-二甲基吡嗪、2-庚酮、2-壬酮及三甲基吡嗪為主導揮發(fā)性風味物質(zhì)。據(jù)報道，2,5-二甲基吡嗪提供炒花香氣和巧克力、奶油氣味，是烏龍茶中的一種關鍵的烤花生味[21]。短鏈酮類具有脂肪香味及焦香氣味，而長鏈酮類具有花香，且酮類物質(zhì)也是美拉德反應中一類重要的揮發(fā)性組分。

圖5 奶酪酶解液及美拉德反應液的揮發(fā)性風味物質(zhì)熱圖

3 結 論

實驗以模糊數(shù)學感官評分、熒光強度及褐變度作為篩選美拉德反應條件的主要指標，確定了奶酪蛋白水解物美拉德反應的最佳工藝條件，此條件制得的樣品焙烤味與奶香味協(xié)調(diào)，風味宜人，以2,5-二甲基吡嗪、2-庚酮、2-壬酮為關鍵香氣化合物。結果表明，模糊數(shù)學結合分析感官評價是提升風味品質(zhì)感官評定方法準確性的有效模式。本實驗可為天然奶酪風味物質(zhì)制備提供理論指導和技術支持。