新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品調(diào)研及其發(fā)酵微生物種質(zhì)資源分析

蔡擴(kuò)軍，妥彥峰，徐敏,4，羅曉紅,吳林英，尤宏，寇曉萌，牟光慶，鄭志強(qiáng)，李新玲,4*

（1.烏魯木齊市動(dòng)物疾病控制與診斷中心，烏魯木齊 830063；2.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034 ；3.新疆天潤乳業(yè)股份有限公司，烏魯木齊 830000; 4.烏魯木齊市奶業(yè)協(xié)會(huì)，烏魯木齊 830000, 5.新疆旺源駝奶實(shí)業(yè)有限公司，新疆 福海 836400）

0 引 言

我國傳統(tǒng)發(fā)酵乳歷史悠久，在新疆、西藏、內(nèi)蒙古等地區(qū)都具有風(fēng)味豐富、質(zhì)地優(yōu)良、營養(yǎng)價(jià)值頗高的傳統(tǒng)發(fā)酵乳。由于乳源、地區(qū)氣候以及發(fā)酵菌種等因素使得我國各地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳的品質(zhì)具有較大差異。新疆為山脈與盆地相間排列、盆地與高山環(huán)抱，被喻稱為“三山夾二盆”[1]，不同區(qū)域內(nèi)的氣候條件差異很大[2]。新疆也是多民族聚居的省區(qū)[3]，多數(shù)少數(shù)民族喜居于水土豐沃的綠洲和山地草原等地區(qū)，這里的人們一直保留著飼養(yǎng)牛、羊、馬、驢和駝等動(dòng)物的習(xí)慣，靠自留“引子”自制發(fā)酵乳制品[4]。自制發(fā)酵乳制品的“引子”歷經(jīng)牧民世代接種傳承，“引子”中的微生物在長期的自然進(jìn)化和演變后蘊(yùn)藏著豐富的發(fā)酵菌種資源，是“天然菌種庫”[5]。

但是，隨著鄉(xiāng)村城鎮(zhèn)化和工業(yè)科技的發(fā)展，傳統(tǒng)工藝不斷被新技術(shù)取代，其中極具價(jià)值的微生物資源也可能會(huì)逐漸消失，因此挖掘并保存新疆地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的微生物菌種資源具有重要意義。鑒于此，本研究對新疆轄區(qū)內(nèi)主要地州及烏魯木齊周邊的鄉(xiāng)村主要飼養(yǎng)牛、馬、驢和駝的牧民自制的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品進(jìn)行了調(diào)研，同時(shí)采集樣品，并對其中的微生物菌種進(jìn)行了多樣性分析和初步篩選，以期為后續(xù)新疆傳統(tǒng)發(fā)酵制品微生物菌種資源的開發(fā)和利用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 調(diào)研與樣品采集

對新疆轄區(qū)內(nèi)12 個(gè)地州及烏魯木齊周邊共45個(gè)縣165 個(gè)鄉(xiāng)村飼養(yǎng)牛、馬、驢和駝的牧民家庭進(jìn)行了采訪調(diào)研，調(diào)研內(nèi)容主要包括咨詢牧民自制發(fā)酵乳制品的時(shí)間、“引子”的來源、制備材料和方法、用途等內(nèi)容。采集了483 份連續(xù)使用5 年以上“引子”的傳統(tǒng)發(fā)酵乳樣品，液體樣品使用250 m L 無菌采樣瓶（200 m L 左右）采集，固體樣品使用無菌采樣袋采集。做好標(biāo)記，用冰袋和車載冰箱低溫保藏運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行微生物多樣性分析以及菌株的篩選和分離。

1.2 試劑及藥品

M RS 肉湯培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；DN easy Pow erSoil Pro Kit 試劑盒，美國Q IAGEN 公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 試劑盒，美國Axyen 公司；E.Z.N.A. soil DN A 試劑盒，美國Om ega Bio-tek 公司；瓊脂糖，西班牙Biow est 公司；1,2-二氟苯，上海阿拉丁有限公司；FastPure Bacteria DNA Iso lation Mini Kit、溶菌酶、2 × Phanta M ax M aster Mix、U ltra GelRed，南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 儀器

ABI GeneAm p 9700 PCR 儀，美國ABI 公司；Illumina Miseq 測序儀，美國Illumina 公司；SW-CJ-1FD 超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Agilent 7890B-5977A 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫科技公司；M upid 2 p lus 水平電泳儀，日本M upid 公司；C 300 化學(xué)發(fā)光成像儀，美國Azure biosystem s 公司；DYY-6C 電泳儀，北京市六一儀器廠。

1.4 發(fā)酵乳菌群分析

對新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳中細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析，使用E.Z.N.A. soil DNA 試劑盒對發(fā)酵乳中的細(xì)菌進(jìn)行DNA抽提。并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的提取質(zhì)量，使用N anoD rop2000 測定DN A 的濃度和純度。使用通用引物338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R (GGACTACHVGGGTW TCTAAT) 對16S rRNA 基因V 3-V 4 可變區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min，27 個(gè)循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s），然后72℃穩(wěn)定延伸10min，最后在4℃進(jìn)行保存。利用Illumina 公司的Miseq PE300/N ovaSeq PE250 平臺(tái)進(jìn)行測序。通過fastp[6]（https://github.com/O penGene/fastp，version 0.20.0）軟件對原始測序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH[7]（http://www.cbcb.um d.edu/so ftw are/flash，version 1.2.7） 軟件進(jìn)行拼接：UPARSE[8]軟件（http://drive5.com/uparse/，version 7.1），根據(jù)97%的相似度對序列進(jìn)行O TU 聚類，并使用Silva 16S rRN A 數(shù)據(jù)庫（version 138）進(jìn)行數(shù)據(jù)比對。

采用M o lPure Fungal DNA Kit 提取試劑盒對新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳中真菌DNA 進(jìn)行提取。使用通用引物ITS1F（CTTGGTTCATTTAGAGGAAGTAA）和ITS2F（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min，35 個(gè)循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），72 ℃穩(wěn)定延伸10 min。使用ITS 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)比對。

2 結(jié)果與討論

2.1 新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳制作環(huán)境條件

調(diào)研中發(fā)現(xiàn)，新疆轄區(qū)內(nèi)12 個(gè)地州及烏魯木齊周邊環(huán)境條件存在差異，即此次調(diào)研的不同地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品制作的原料環(huán)境條件不同。表1 列出了本次調(diào)研的新疆12 個(gè)地區(qū)的主要地理?xiàng)l件和制作發(fā)酵乳奶源的主要畜種。所調(diào)研的不同牧區(qū)，環(huán)境溫度存在一些差異，會(huì)使發(fā)酵過程中微生物的代謝產(chǎn)物存在差異。以牛、羊、馬或駝乳作為發(fā)酵的原料乳，參與發(fā)酵的微生物會(huì)存在差異。

表1 新疆不同地區(qū)氣候條件和發(fā)酵乳特點(diǎn)

表2 新疆不同地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳篩選主要乳酸菌菌株數(shù)量/株

2.2 新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳制作方法

新疆12 個(gè)不同地州傳統(tǒng)發(fā)酵乳的發(fā)酵方法有所不同，而發(fā)酵乳所用的“引子”均主要為當(dāng)?shù)啬撩袷来鷤鞒邢聛淼模⑽床捎萌魏紊虡I(yè)發(fā)酵劑。塔城地區(qū)額敏縣邊境某牧區(qū)的多戶牧民表示，發(fā)酵用的“引子”源自出生幾天內(nèi)剛死亡的犢牛/羊胃中的乳糜；烏什縣某戶農(nóng)牧民表示發(fā)酵酸奶的初始“引子”為發(fā)面酵頭；阿勒泰富?？h有牧民表示“引子”就是把擠出的新鮮奶加入洋蔥放在帳篷內(nèi)，待其自然變酸。

新疆不同地州傳統(tǒng)發(fā)酵乳，其原料乳基本來自家養(yǎng)的牛、馬、駝和驢乳，且發(fā)酵乳基本自用，制作時(shí)間5~80 年。

新疆不同地州傳統(tǒng)發(fā)酵乳的制作方法差別不大，共同特征為：飼養(yǎng)乳畜經(jīng)手工擠奶后先用紗布過濾，鮮奶在鍋里進(jìn)行加熱煮沸，待冷卻至不燙手，倒入專門容器內(nèi)；再加入前一次發(fā)酵成熟的發(fā)酵乳作為發(fā)酵劑，用勺子攪拌勻，蓋上蓋子，天冷時(shí)蓋上棉被置于火爐旁，通常在室溫下發(fā)酵，待凝乳后，即可食用。馬、駝和驢擠奶經(jīng)過濾后直接加入上次“引子”常溫自然發(fā)酵，前兩天常攪拌，發(fā)酵5~7 d 后待酸香味適宜時(shí)，即可飲用。在阿勒泰也有部分牧民將駝乳和馬乳經(jīng)過濾后再煮沸，待冷卻至室溫后，加入上次“引子”在常溫下自然發(fā)酵。

專業(yè)理論知識(shí)與工程實(shí)踐結(jié)合的課堂教學(xué) 在實(shí)際的專業(yè)課教學(xué)中，為了將理論知識(shí)與工程實(shí)踐相結(jié)合，并引入實(shí)際課堂教學(xué)中，采用以下步驟進(jìn)行。

草原上不同少數(shù)民族制作的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的感官差異很大。發(fā)酵牛乳通?？雌饋砟榧?xì)膩、且輕輕攪拌后呈豆花狀、黏稠提拉呈絲狀、或糊狀有微量氣泡，很少有乳清析出現(xiàn)象；聞起來有焦香味、花香味、或醇香味、多數(shù)為常見酸奶的發(fā)酵風(fēng)味；喝起來呈焦香味、有些許尖酸刺激味，多數(shù)酸味柔和，少有膻腥、飼草味。存放過程中少有發(fā)霉現(xiàn)象，有些牧民家的酸奶存放半年仍可正常食用，存放滿1 年仍無霉變、香味濃郁，嘗微苦。阿勒泰地區(qū)的酸駝乳和酸馬乳呈液體狀態(tài)，不同于牛羊乳的凝乳狀態(tài)。

2.3 微生物多樣性分析

2.3.1 細(xì)菌和真菌多樣性分析

采用焦磷酸測序的方法對南疆三地州喀什（KS）、和田（HT）、阿克蘇（AKS）、哈密地區(qū)（HM）、與北疆地區(qū)塔城（TCEM）、博州（BZ）、伊犁（YL）等地的代表性樣品進(jìn)行細(xì)菌和真菌的生物多樣性分析。

從圖1 中可以看出，新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中南疆地區(qū)的HM 21 及北疆地區(qū)TC_19 地區(qū)的細(xì)菌微生物多樣性高于其他組。

圖1 細(xì)菌香農(nóng)指數(shù)分析

從圖2 中可以看出，新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中南疆地區(qū)的HM 21、北疆地區(qū)的YL_GL_5 組的真菌微生物多樣性同樣高于其他組。

圖2 真菌香農(nóng)指數(shù)分析

從圖3 中可以看出，在多個(gè)傳統(tǒng)發(fā)酵乳樣品中檢測到的Lactobacillus_delbrueckli_subsp_bulgaricus（HTYT、YJS 35、AKSW S4、HM 19、YC 37、KSSL30、YL_CX、YL_YN、YL_ZS、TC_15）和Lactobacillus_helveticus（HM 13、HM 1、HM 4、HM 12、HM 14、HM 17、HM 19、YL_TKS、BZ_W Q_7、TC_10、BZ_W Q_2），是新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳的主要優(yōu)勢菌株；其次含有一定量的Streptococcus_salivarius_subsp_themophilus（HTYT 39、HTYT 42、YJS36、YJS35、AKSW S4、YC 37、KSSL30、YL_CX、TC_15）。

圖3 細(xì)菌菌群種水平Bar 圖

從圖4 中可以看出，在多個(gè)傳統(tǒng)發(fā)酵乳樣品中檢測到的Kluyveromyces_marxianus（HTYT 42、HM 13、AKSW S4、HM 19、YC 37、KSSL30、YL_TKS、YL_ZS）和Geotrichum_bryndzae（YL_CX、YL_GL、YL_YN、YL_ZS、BZ_W Q_7、TC_15、TCEM_19、YJS35、HM 1 和HM 4），是新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳的主要優(yōu)勢菌株；另外一些地區(qū)發(fā)酵乳中檢測到的Saccharomyces_sp（TC_10、YL_YN）、Dekkera_bruxellensis（YL_TKS）、Issatchenkia_orientalis（HM 12、HM 14）和Candida_sake（HTYT 41、HTYT 42）并不具有普遍性。

圖4 真菌菌群種水平Bar

2.3.2 細(xì)菌和真菌差異性分析

圖5 細(xì)菌種水平組間差異分析

伊犁（YL_GL_5） 地區(qū)的Lactococcus-raffinolactis（P<0.05）、博州兩地區(qū)Lactobacillus-kefir（P<0.05）以及塔城地區(qū)（TCEM 19）Acetobacter-orientalis（P<0.05）相對豐度明顯多于其他地區(qū)。

乳酸菌和酵母菌是傳統(tǒng)發(fā)酵乳中發(fā)酵劑的主要微生物組成。由乳酸菌主導(dǎo)的乳酸發(fā)酵與酵母菌主導(dǎo)的乙醇發(fā)酵及其發(fā)酵副產(chǎn)物對傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品風(fēng)味的形成具有顯著影響。從圖6 中可看出，各新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳樣品中普遍存在Geotrichum_bryndzae，而在塔城兩地區(qū)的Saccharomyces_sp（TCEM 10）和Candida_sake（TCEM 15） 的相對豐度顯著高于其他地區(qū)（P <0.05）；在伊犁（YL_TKS_3、YL_YN_1、YL_ZS_4）地區(qū)的Kluyveromyces_marxianus相對豐度顯著高于其他地區(qū)（P<0.05）。乳酸菌與酵母共存的模式賦予新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳醇厚、清新的口感，使其與商業(yè)發(fā)酵乳的風(fēng)味具有明顯差異[9]。乳酸菌通過乳酸發(fā)酵途徑水解乳糖產(chǎn)生乳酸，使乳酸化[10]；YL_YN_1 含有豐富的乳桿菌，可促進(jìn)乳的酸化；Lactobacillus_delbrueckli_subsp_bulgaricus，具有良好的產(chǎn)酸能力，是商業(yè)發(fā)酵乳的首選發(fā)酵劑之一[11-12]。Lactobacillus_helveticus為同型乳酸發(fā)酵菌種，具有良好的產(chǎn)酸及蛋白水解能力[13]。酵母菌具有良好的蛋白水解能力，對發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味具有積極影響[14-15]。與乳酸菌相比，酵母菌對營養(yǎng)要求相對較低，糖、氨基酸、微生物、礦物質(zhì)、氧氣等基本化合物的存在即可支持酵母菌的生長代謝[16]；而乳酸菌的生長代謝有更多的營養(yǎng)物質(zhì)需求，這也使得在乳酸菌酵母菌共生的體系中，酵母菌代謝產(chǎn)生的各類氨基酸能夠有效促進(jìn)乳酸菌生長代謝[17]，乳酸菌與酵母菌在傳統(tǒng)發(fā)酵乳中復(fù)雜的共生關(guān)系和碳、氮代謝途徑相互作用的結(jié)果是形成豐富風(fēng)味的原因。

圖6 真菌種水平組間差異分析

通過以上分析，確定了新疆不同地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中主要的優(yōu)勢微生物，包括德氏乳桿菌保加利亞亞種、嗜熱鏈球菌、瑞士乳桿菌、植物乳桿菌和馬克斯克魯維酵母菌。

2.4 樣品中篩選出的代表性菌株

基于微生物表型技術(shù)和糖代謝特性結(jié)合基因技術(shù)，利用改良培養(yǎng)基M RS 和PDA 從采集的樣品中篩選出乳桿菌、乳球菌、明串珠菌和乳源性腸球菌4 大類菌，其中以植物乳桿菌、瑞士乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、乳酸乳球菌、腸膜明串珠菌、假腸膜明串珠菌、腸膜明串珠菌亞種、乳源腸球菌中的屎腸球菌、糞腸球菌和耐久腸球菌為代表的乳酸細(xì)菌等497 株；篩選出以發(fā)酵乳糖的馬克斯克魯維酵母為代表的乳酸酵母及非乳糖釀酒酵母、發(fā)酵畢赤酵母、東方伊莎酵母、膠紅酵母、膜醭畢赤酵母、戴爾有孢酵母、漢遜得巴利酵母、乙醇假絲酵母、清酒假絲酵母和白地霉等真菌；并于國內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)現(xiàn)未命名的Kazachstania servazzi、Pichia cactophila、Coniocheataceae sp.和Meyerozyma guilliermondil等菌株，共364 株。

從樣品中篩選出的菌屬與微生物多樣性分析結(jié)果基本相符，且部分菌株已在企業(yè)開始應(yīng)用研究，將發(fā)酵乳桿菌、副干酪乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種和馬克斯克魯維酵母應(yīng)用于乳的發(fā)酵，獲得了風(fēng)味、感官及營養(yǎng)較好的發(fā)酵乳產(chǎn)品[14,18]。對未篩選出優(yōu)勢菌種中的嗜熱鏈球菌，分析可能是由于嗜熱鏈球菌不耐酸以致失活或在35 ℃溫度下培養(yǎng)的嗜熱鏈球菌的菌落過小且特征不明顯所致。

一些發(fā)酵乳制品存在多菌株參與發(fā)酵。副干酪乳桿菌、耐久腸球菌和發(fā)酵乳桿菌等普遍應(yīng)用于希臘奶酪[19]、乳扇[20]和發(fā)酵牦牛乳[5]等傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中，使其具有豐富的風(fēng)味成分和有益代謝產(chǎn)物。鼠李糖乳桿菌與德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌共同發(fā)酵羊乳時(shí)，有利于提高發(fā)酵乳的質(zhì)地、并降低乳中的羊膻味[21]。新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳中多樣的微生物構(gòu)成，正是形成其獨(dú)特風(fēng)味的原因。

2.5 新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品及發(fā)酵菌株的安全性

以上所分離的植物乳桿菌、瑞士乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、乳酸乳球菌、馬克斯克魯維酵母均在國家衛(wèi)生健康委員會(huì)（衛(wèi)生部）發(fā)布的可用于食品的菌種名錄中。對新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳中的微生物進(jìn)行了分離保藏，并對部分地區(qū)的發(fā)酵乳制品中的相應(yīng)的部分微生物進(jìn)行了安全性評(píng)價(jià)，包括對細(xì)胞毒性的評(píng)價(jià)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌胃實(shí)驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)所研究菌株和發(fā)酵乳具有毒性[14, 18,22]。

在對新疆不同牧區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品進(jìn)行調(diào)研和采集過程中，發(fā)現(xiàn)新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳是當(dāng)?shù)厝嗣竦娜粘Ｊ称?，具有長期的食用史，因此認(rèn)為其是具有安全性的傳統(tǒng)食品，同時(shí)也是開發(fā)食品有益微生物的良好資源[23-24]。

3 結(jié) 論

對新疆12 個(gè)地州及烏魯木齊周邊共45 個(gè)縣165個(gè)鄉(xiāng)村的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品展開了調(diào)研，進(jìn)一步證明了新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中蘊(yùn)含豐富的食品用微生物菌種資源。新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳制作過程中不涉及任何商品發(fā)酵劑。從新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳中共篩選出497 株乳酸菌和364 株酵母菌，并首次發(fā)現(xiàn)了假腸膜明串珠菌、漢遜德巴利酵母和巴氏醋桿菌等菌。部分菌株已在企業(yè)開始應(yīng)用研究，開發(fā)新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的優(yōu)質(zhì)菌種資源可為我國發(fā)酵乳制品生產(chǎn)提供具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的菌株。