嗜熱鏈球菌grx02 化學限定增殖培養(yǎng)基及變溫培養(yǎng)策略的研究

彭奎耀，關(guān)成冉，瓦云超，顧瑞霞

(揚州大學江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室，江蘇 揚州 225000）

0 引 言

嗜熱鏈球菌作為發(fā)酵劑，具有快速產(chǎn)酸凝乳和改善產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)的特征，被廣泛用于乳制品的發(fā)酵[1]。早在二十世紀初，人們利用嗜熱鏈球菌與德氏乳桿菌保加利亞亞種作為發(fā)酵劑菌株生產(chǎn)酸奶[2]。在發(fā)酵過程中，嗜熱鏈球菌可以產(chǎn)生許多功能性物質(zhì)，如胞外多糖、細菌素和維生素等，在降膽固醇、抗氧化、保護肝損傷、抑制腸道致病菌及抗炎癥等方面具有開發(fā)利用的潛力[3-7]。由此可見，嗜熱鏈球菌市場需求巨大，商業(yè)價值高。

目前用于培養(yǎng)嗜熱鏈球菌的培養(yǎng)基多采用M RS、M 17 等，這些商用培養(yǎng)基來源不同，培養(yǎng)效果重復性差，會造成批次間差異。此外，商用培養(yǎng)基中含有蛋白胨、牛肉膏和酵母提取物等復雜成分[8]，在代謝組學和蛋白質(zhì)組學研究中，會對特定營養(yǎng)素或選定分子的監(jiān)測帶來問題[9-10]?；瘜W限定培養(yǎng)基（chemically defined m edium,CDM）是一種營養(yǎng)均衡且化學成分已知的培養(yǎng)基，通常包含碳源、氮源、無機鹽及目標微生物所需的其他營養(yǎng)物質(zhì)，具有良好的培養(yǎng)重復性[11-12]。CDM 可排除未知成分的干擾，更準確有效的用于嗜熱鏈球菌代謝途徑、基因調(diào)控與蛋白質(zhì)表達的研究[13-14]。但利用化學限定培養(yǎng)基培養(yǎng)嗜熱鏈球菌獲得的最大生物量較低，限制其在嗜熱鏈球菌規(guī)模化培養(yǎng)中的應用。

研究表明，溫度是影響乳酸菌生長的重要因素[15-16]。大部分研究都是關(guān)于單一培養(yǎng)溫度對乳酸菌生長的影響，如ARmin T[17]探究溫度對8 株嗜熱鏈球菌生長的影響，發(fā)現(xiàn)37 ℃更適合嗜熱鏈球菌生長。僅有少部分研究變溫培養(yǎng)對乳酸菌生長的影響。馮鎮(zhèn)[18]發(fā)現(xiàn)與單一溫度培養(yǎng)相比，適合變溫培養(yǎng)能夠提高乳酸乳球菌的生物量與發(fā)酵活力。目前，未發(fā)現(xiàn)關(guān)于嗜熱鏈球菌變溫培養(yǎng)的研究。

本文優(yōu)化獲得嗜熱鏈球菌grx02 增殖的化學限定培養(yǎng)基及變溫培養(yǎng)條件，為嗜熱鏈球菌生產(chǎn)及其代謝與功能研究提供物質(zhì)基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

嗜熱鏈球菌grx02 為揚州大學江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室分離、篩選和保存的專利菌株。

1.1.2 試劑

乳糖、葡萄糖、蔗糖、氯化鎂、氯化鈣、乙酸鈉、檸檬酸銨、尿素、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、抗壞血酸鈉，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；鹽酸硫胺素、泛酸鈣、葉酸、生物素、煙酸、鹽酸吡哆醇、對氨基苯甲酸、核黃素、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、纈氨酸，均為分析純，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 儀器與設備

全自動高壓蒸汽滅菌鍋，TOM Y 公司；DNP-9272 恒溫培養(yǎng)箱、HZP-150 恒溫搖床培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設備有限公司；FP-110-C Bioscreen CTM 系統(tǒng)，Lab-system s 公司；101-1BS 恒溫鼓風干燥箱，力辰科技有限公司。

1.2 菌體生長曲線的繪制

Bioscreen C 系統(tǒng)可自動化進行測定并記錄菌體生長情況，該系統(tǒng)內(nèi)置的EZ Experim ent 軟件能夠持續(xù)地記錄菌體密度。本實驗參數(shù)設置：相應培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)時間24 h，測量間隔30 min，波長600 nm，測量前后震蕩時間30 s，震蕩完成靜止10 s 讀值。

每個加樣孔中加入294 m L 培養(yǎng)基與6 m L 二代菌懸液后混勻，將樣品板放入Bioscreen C 培養(yǎng)箱內(nèi)，每組樣品設置3 個平行，培養(yǎng)24 h 后記錄數(shù)據(jù)。

1.3 活菌數(shù)的測定

活菌數(shù)的測定采用平板計數(shù)法。

1.4 化學限定培養(yǎng)基的配制

預先配制46 種組分的濃縮液，成分及濃度如表1，按照濃縮比例再進一步配制各組分的預混液。采用121 ℃滅菌15 min。

表1 化學限定培養(yǎng)基配方

1.5 必需營養(yǎng)成分的確定

根據(jù)表1 所示，逐個缺失每一種因素（乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖及半乳糖除外），繪制生長曲線，確定菌體生長的必需營養(yǎng)成分，從而精簡CDM 成分。乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖及半乳糖分別進行單因素實驗，確定菌株的最佳碳源及濃度。

1.6 CDM 成分濃度優(yōu)化實驗

CDM 中每種因素的含量設置5 個水平，選取范圍如表2 所示。

表2 化學限定培養(yǎng)基組分以及單因素營養(yǎng)素水平選取

1.7 不同溫度培養(yǎng)

將菌體接種于CDM 中，培養(yǎng)溫度為42、39、37 ℃和35 ℃，利用全自動生長曲線儀繪制生長曲線，并在對數(shù)末期計活菌數(shù)，測定發(fā)酵pH 值。每組實驗設3 個平行，重復2 次。

1.8 變溫培養(yǎng)策略

將菌體接種于CDM 中，初始溫度39 ℃培養(yǎng)，延滯期末期培養(yǎng)溫度分別為42 、39 ℃和37 ℃，對數(shù)末期培養(yǎng)溫度分別為42 、39 ℃和37 ℃。測定菌體生長曲線，對數(shù)末期活菌數(shù)，發(fā)酵pH 值，每組實驗設3 個平行，重復2 次。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用軟件O rigin 2018 繪圖，Excel 2010 和SPSS 19.0 進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)通過單因素方差分析（ANOVA）統(tǒng)計，檢驗結(jié)果取平均值（P<0.05）作為統(tǒng)計學差異判斷標準。

2 結(jié)果與討論

2.1 嗜熱鏈球菌grx02 的CDM 碳源及其濃度的確定

為研究碳源對嗜熱鏈球菌grx02 生長的影響，在預配制的CDM 中，分別添加1%濃度的乳糖、葡萄糖、半乳糖、果糖及半乳糖，測定對數(shù)期末期OD600、計算生長速率，結(jié)果如圖1(a)所示。

圖1 碳源及乳糖濃度對嗜熱鏈球菌grx02 生長的影響

由圖1(a)可知，嗜熱鏈球菌grx02 在CDM-Lac中生物量和生長速率最優(yōu)，分別為每小時0.862、0.105，在CDM-Gal 中生長最差，生物量僅為0.220，表明乳糖為嗜熱鏈球菌grx02 生長最適碳源。進一步研究乳糖濃度對嗜熱鏈球菌grx02 生長的影響如圖1（b）所示，隨乳糖濃度的升高，嗜熱鏈球菌grx02 的生物量和生長速率呈先增長后降低的趨勢，在乳糖濃度為2%時達最大值，分別為每小時0.910、0.112 ，表明嗜熱鏈球菌grx02 生長最適的乳糖濃度為2%。在LIU G F[19]的研究中也發(fā)現(xiàn)乳糖最適合嗜熱鏈球菌的生長。

2.2 CDM 必需營養(yǎng)成分的確定

2.2.1 礦物質(zhì)成分的確定

礦物元素是微生物生長和代謝產(chǎn)物合成的重要影響因子，如M g2+參與許多酶促反應，影響核苷酸等的代謝[20-22]，M n2+能夠緩解氧氣對菌體的毒副作用[23]，Ca2+可以促使ADP 磷酸化為ATP，為微生物細胞的增殖代謝提供能量并促進菌株的生長[24]。通過單一扣除礦物元素，確定嗜熱鏈球菌grx02 生長需要的礦物質(zhì)，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 單一缺失礦物質(zhì)對嗜熱鏈球菌grx02 生長的影響

與對照組相比，缺少M n2+、M g2+時，嗜熱鏈球菌grx02 基本沒有生長（生物量＜0.1）；缺少Ca2+時，生物量明顯降低，Zn2+的缺少對生物量沒有顯著變化；而缺少Fe2+時，生物量明顯升高，表明M n2+、M g2+是嗜熱鏈球菌grx02 生長必需礦物質(zhì)，Ca2+促進菌體生長，F(xiàn)e2+抑制菌體生長。因此，選取M n2+、M g2+及Ca2+作為嗜熱鏈球菌grx02 生長CDM 中的礦物質(zhì)成分。

2.2.2 維生素成分的確定

在菌體生長過程中，B 族維生素作為輔助因子或輔酶在碳水化合物、蛋白質(zhì)及核酸的代謝中具有至關(guān)重要的地位，如核黃素、煙酸在菌體的代謝過程中參與輔酶Ⅰ和輔酶Ⅱ的合成，作用于胞內(nèi)的許多生物氧化反應[25-26]。本實驗通過單一缺失維生素，確定嗜熱鏈球菌grx02 生長需要的維生素，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 單一缺失維生素對嗜熱鏈球菌grx02 生長的影響

與對照組相比，缺少泛酸鈣、煙酸時嗜熱鏈球菌grx02 基本沒有生長（生物量＜0.1）；缺少鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、抗壞血酸時，嗜熱鏈球菌grx02 生長生物量降低；而對氨基苯甲酸、葉酸的缺少對于嗜熱鏈球菌grx02 生物量沒有顯著影響。結(jié)果表明：泛酸鈣、核黃素及煙酸是嗜熱鏈球菌嗜熱鏈球菌grx02 生長必需營養(yǎng)成分，鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、抗壞血酸有促進菌體生長的作用，對氨基苯甲酸、葉酸對于菌體生長是非必要成分。因此，選取泛酸鈣、核黃素、煙酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、抗壞血酸作為嗜熱鏈球菌grx02生長CDM 中的維生素成分。

2.2.3 氨基酸成分的確定

嗜熱鏈球菌是營養(yǎng)需求型菌株，需要氨基酸來維持最佳生長。如GARAU LT P C[27]發(fā)現(xiàn)亮氨酸、異亮氨酸及纈氨酸是嗜熱鏈球菌必需氨基酸。因此，本實驗通過單個缺失氨基酸，確定嗜熱鏈球菌grx02 生長需要的氨基酸，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 單一缺失氨基酸對嗜熱鏈球菌grx02 生長的影響

在缺少谷氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、亮氨酸及纈氨酸時，嗜熱鏈球菌grx02 基本不生長（生物量＜0.1），是嗜熱鏈球菌grx02 必需營養(yǎng)素。異亮氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺扣除后，生物量均減少。分別扣除丙氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、精氨酸、色氨酸、丙氨酸及谷氨酰胺時，生物量沒有明顯地變化，但延長了菌體生長延滯期，導致菌體生長速率的下降。當酪氨酸、甘氨酸、絲氨酸、脯氨酸缺乏時，菌體濃度高于對照組，表明嗜熱鏈球菌grx02 生長不需要這些氨基酸。因此，選取谷氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、精氨酸、色氨酸及谷氨酰胺作為嗜熱鏈球菌grx02 生長CDM 中的氨基酸成分。

2.2.4 其他必需成分的確定

在嗜熱鏈球菌生長過程中還需要其他營養(yǎng)物質(zhì)，如無機鹽、無機氮源等。通過單一扣除實驗，確定嗜熱鏈球菌grx02 生長需要的礦物質(zhì)成分，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 單一缺失其他營養(yǎng)物質(zhì)對嗜熱鏈球菌grx02 生長的影響

與對照組相比，尿素和檸檬酸銨被扣除后，嗜熱鏈球菌grx02 基本沒有生長（生物量＜0.1），是嗜熱鏈球菌grx02 必需營養(yǎng)素。因為尿素和檸檬酸銨為嗜熱鏈球菌grx02 提供氮源。缺少乙酸鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，菌體生物量均有減少，表明這些成分是嗜熱鏈球菌grx02 生長所需的。

2.3 CDM 成分濃度優(yōu)化

為了進一步研究除碳源以外其他營養(yǎng)物質(zhì)對嗜熱鏈球菌grx02 生長的影響，將32 種營養(yǎng)成分設置5個濃度梯度，測定對數(shù)期末期OD600，結(jié)果如表3 所示。

表3 營養(yǎng)成分濃度對嗜熱鏈球菌grx02 生長的影響

根據(jù)表3 結(jié)果，將32 種營養(yǎng)物質(zhì)分為3 類：第一類，隨著營養(yǎng)物質(zhì)濃度的升高，菌體濃度先顯著升高后顯著降低，包括K2HPO4、KH2PO4、N a2HPO4、N aH2PO4、尿素、乙酸鈉、煙酸、抗壞血酸、核黃素、半胱氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸共16 種成分，確定各物質(zhì)添加量分別為3、3、4.25、3.59、0.72、2、0.0025、1，0.0025、1.21、1.46、1.19、1.31、1.49、1.31、1.33 g/L。第二類，隨著成分濃度升高，菌體濃度先顯著升高后不變，包括組氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、丙氨酸、色氨酸、鹽酸吡哆醛、硫酸錳、檸檬酸銨共8 種成分，確定各物質(zhì)添加量分別為0.75、0.73、0.825、0.445、1.02、0.0125、0.056、0.6 g/L。第三類，濃度升高，菌體濃度一直不變，包括纈氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、鹽酸硫胺素、泛酸鈣、硫酸鎂、氯化鈣共8 種成分，添加物質(zhì)濃度為0.117、0.174、0.147、0.150、0.001、0.001、0.2、0.05 g/L。

2.4 溫度對菌體生長的影響

2.4.1 單一溫度培養(yǎng)研究

為研究溫度對嗜熱鏈球菌grx02 生長的影響，將嗜熱鏈球菌grx02 接入優(yōu)化后CDM 培養(yǎng)基中，分別在35、37、39 和42 ℃培養(yǎng)，測定生長曲線、pH 變化曲線及對數(shù)末期活菌數(shù)，結(jié)果如圖6 所示。

由圖6（a）可知，當嗜熱鏈球菌grx02 在不同溫度下培養(yǎng)時，其到達穩(wěn)定期的時間在8 ~12 h，其中42 ℃培養(yǎng)時，嗜熱鏈球菌grx02 能夠更快的進入穩(wěn)定期，但最終的生物量是39 ℃最高。圖6(b)也表明相同的結(jié)果，嗜熱鏈球菌grx02 在39 ℃下培養(yǎng)，活菌數(shù)最高為8.92 log CFU/m L。嗜熱鏈球菌grx02 在42 ℃培養(yǎng)時，嗜熱鏈球菌grx02 能夠快速產(chǎn)酸，發(fā)酵液pH 下降最快。

單一溫度培養(yǎng)時，嗜熱鏈球菌grx02 在39 ℃培養(yǎng)時，活菌數(shù)最高，而42 ℃培養(yǎng)時，發(fā)酵液pH 下降最快。這也表明在嗜熱鏈球菌grx02 發(fā)酵中，單一溫度培養(yǎng)不能滿足菌株更好的生長。為了獲得高活菌數(shù)、高活力的菌體，分別在延滯期末期與對數(shù)期末期改變培養(yǎng)溫度，以提高嗜熱鏈球菌grx02 活菌數(shù)和菌活力。

2.4.2 變溫培養(yǎng)研究

2.4.2.1 延滯期末期變溫培養(yǎng)

為研究延滯期末期變溫培養(yǎng)對嗜熱鏈球菌grx02生長的影響，將39 ℃作為起始培養(yǎng)溫度，延滯期末期變溫為37、42 ℃。測定生長曲線、pH 變化曲線及對數(shù)末期活菌數(shù)，結(jié)果如圖7 所示。

圖7 延滯期末期變溫培養(yǎng)對嗜熱鏈球菌grx02 生長及pH 的影響

由圖7 可知，延滯期末期改變培養(yǎng)溫度分別為37、39 、42 ℃時，進入穩(wěn)定期的培養(yǎng)時間有明顯差異，分別是10.5 、9.5 、8.5 h，表明變溫培養(yǎng)能夠有效的改變菌體的生長周期，且轉(zhuǎn)變較高溫度培養(yǎng)，能夠縮短培養(yǎng)周期，但不利于生物量的積累，相反37 ℃培養(yǎng)更有利于生物量的積累，活菌數(shù)顯著高于其他2 組，為8.99 log CFU/m L。根據(jù)pH 變化曲線可知，與其它2組相比，37 ℃變溫培養(yǎng)的pH 下降速率最快，表明其有助于提高嗜熱鏈球菌grx02 的發(fā)酵活力，活菌數(shù)與發(fā)酵活力呈正相關(guān)。因此，延滯期末期變溫至37 ℃培養(yǎng)更有利于嗜熱鏈球菌grx02 的生長。

2.4.2.2 對數(shù)期末期變溫培養(yǎng)

為研究對數(shù)期末期變溫培養(yǎng)對嗜熱鏈球菌grx02生長的影響，將39 ℃作為起始培養(yǎng)溫度，延滯期末期變溫為37 ℃，對數(shù)期末期分別變溫為39 ℃、42 ℃。測定生長曲線、pH 變化曲線及對數(shù)末期活菌數(shù)，結(jié)果如圖8 所示。

圖8 對數(shù)期末期變溫培養(yǎng)對嗜熱鏈球菌grx02 生長及pH 的影響

由圖8 可知，對照組進入對數(shù)末期后，菌體生長速率逐漸減少，而實驗組均出現(xiàn)不同程度的躍升，實驗組菌體密度均有所增加，實驗組的活菌數(shù)均高于對照組，其中對數(shù)末期變溫至39 ℃培養(yǎng)活菌數(shù)最高，為9.04 log CFU/m L。然而由pH 變化曲線可知，對數(shù)末期變溫培養(yǎng)對pH 變化沒有顯著的影響。

綜上，嗜熱鏈球菌grx02 最優(yōu)變溫培養(yǎng)策略是：初始溫度39 ℃，延滯末期改變培養(yǎng)溫度為37 ℃，到達對數(shù)末期時變溫為39 ℃，能夠顯著提高嗜熱鏈球菌grx02 活菌數(shù)及發(fā)酵活力。馮鎮(zhèn)等[18]在研究變溫對嗜熱鏈球菌生長時，也得到了相似的結(jié)果。

3 結(jié) 論

本研究通過對CDM 成分及濃度的優(yōu)化，確定了能夠促進嗜熱鏈球菌grx02 增殖的CDM，包括：1 種碳源、16 種氨基酸、6 種維生素、3 種礦物質(zhì)、4 種無機鹽、2 種有機鹽。又進一步研究溫度對嗜熱鏈球菌grx02 生長的影響，發(fā)現(xiàn)采用初始溫度39 ℃，延滯末期改變培養(yǎng)溫度為37 ℃，到達對數(shù)末期時變溫為39 ℃的培養(yǎng)方式，能夠顯著提高嗜熱鏈球菌grx02 生物量。優(yōu)化前嗜熱鏈球菌grx02 生物量達到0.862，通過對化學限定培養(yǎng)基的成分、濃度及菌株培養(yǎng)溫度策略的優(yōu)化，嗜熱鏈球菌grx02 生物量達到1.40，較優(yōu)化前提高了1.63 倍，活菌數(shù)達到9.04 log CFU/m L。