梔子TPS基因家族鑒定及與萜類物質(zhì)代謝的相關(guān)性分析

李金燃，張麒功，陳絲雨，陳淑穎，陳清海，鄒雙全

（1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福州 350002；2.南平市延平區(qū)東坑林業(yè)站，福建 南平 353000；3.自然生物資源保育利用福建省高校工程技術(shù)研究中心，福州 350002；4.泉州市城市森林公園發(fā)展中心，福建 泉州 362000）

梔子（Gardenia jasminoides）別名黃梔子、山梔子、紅果樹、林蘭，是茜草科（Rubiaceae）、梔子屬（Gardenia）常綠灌木。梔子花香濃郁，是我國著名的八大香花之一[1]，其揮發(fā)油帶有強(qiáng)甜味的水果香，屬名貴的花香香料之一，用于多種香型化妝品、香皂和香精中[2]。梔子有著重要的藥用及觀賞價值，其植株適應(yīng)性強(qiáng)，成活率高，植株內(nèi)含有多種經(jīng)濟(jì)價值較高的萜類（主要為環(huán)烯醚萜類、三萜類）、黃酮類、梔子苷、綠原酸、藏紅花素等藥用成分及可食用的色素，具有解熱鎮(zhèn)痛、保肝利膽等多種功效[3]。其花潔白精致，具有一定的觀賞及食用價值，以花入藥具有清肺涼血之功效，主治肺熱咳嗽鼻衄之癥[4]。

萜類化合物是一類結(jié)構(gòu)多樣的植物次生代謝產(chǎn)物[5]，是植物芳香物質(zhì)的重要組成成分，也是植物花器官吸引昆蟲傳粉、進(jìn)行自我防御的主要物質(zhì)[6]。萜類化合物是植物體內(nèi)數(shù)目和種類最豐富的一類化合物，究其原因，正是由于萜類合成酶（terpene synthase，TPS）的多樣性造成的[7]。萜類合成酶（TPS），是萜類化合物生物合成的末端關(guān)鍵酶，可催化不同的前體物質(zhì)最終生成不同的萜類化合物[8]，直接決定萜類產(chǎn)物生成的種類和數(shù)量[9]，在植物生長發(fā)育中起重要作用[10]。萜類合成酶的作用效果極其多樣，不但能夠調(diào)節(jié)花香、促進(jìn)生長調(diào)節(jié)等，同時對于植物的防御機(jī)制也有著巨大的意義[7]。萜類合成酶分別以牻牛兒基焦磷酸（GPP）、橙花基焦磷酸（NPP）、法呢基焦磷酸（FPP）和牻牛兒牻牛兒基焦磷酸（GGPP）為直接前體底物合成相應(yīng)的單萜、倍半萜、二萜等物質(zhì)[11]。TPS基因家族含有以RRX8R為基序的PF01397（N-末端）及以DDXXD 為基序的PF03936（C-末端）[12]，可分為TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-d、TPS-e/f、TPS-g、TPS-h[13]這7個亞家族。其中TPS-a、TPS-b、TPS-g為被子植物特有，TPS-h只在卷柏屬[13-14]中發(fā)現(xiàn)。近年來，全基因組TPS基因家族在擬南芥（Arabidopsis thaliana）[15]、大花蕙蘭（Cymbidium faberi）[16]、山茶（Camellia sinensis）[17]、月季（Rosa chinensis）[18]、竹葉花椒（Zanthoxylum armatum）[19]、葡萄（Vitis vinifera）[20]等植物中已鑒定，其中葡萄具有已知的最大TPS基因家族，多達(dá)69個TPS基因家族成員[18]。

萜類化合物在梔子花及花香揮發(fā)物占據(jù)主導(dǎo)地位[21]，其萜類合成酶TPS基因家族鑒定和分析還未見報(bào)道。隨著基因組測序技術(shù)的成熟，梔子基因組測序已經(jīng)完成[22]。因此，本研究對梔子TPS基因家族進(jìn)行鑒定，利用生物信息學(xué)的手段深入剖析梔子TPS基因家族的基因結(jié)構(gòu)、進(jìn)化模式等方面；通過外源激素噴施試驗(yàn)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，分析不同激素水平梔子花朵的表達(dá)情況，結(jié)合頂空固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，測定不同激素水平梔子花朵中萜類物質(zhì)含量；為今后探索梔子TPS基因結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)，深入研究TPS基因家族成員在梔子花香代謝調(diào)控中的作用提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 GjTPS基因家族成員鑒定

準(zhǔn)備擬南芥的TPS 蛋白序列（Tair：Arabidopsis.org）和梔子全基因組數(shù)據(jù)（NCBI：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。在InterPro 網(wǎng)站（https://www.ebi.ac.uk/interpro/）下載含有2 個特定的TPS結(jié)構(gòu)域（PF01397、PF03936）的種子文件，使用TBtools軟件篩選梔子TPS家族基因，保留含有2個結(jié)構(gòu)域且Evalue≤1×10-5的基因；通過本地Blast V3 程序（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/）獲得梔子同源蛋白序列。將以上兩個蛋白序列文件進(jìn)行合并后去重復(fù)，再進(jìn)一步用HMMER（https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/）在線網(wǎng)站進(jìn)行結(jié)構(gòu)域驗(yàn)證，去除不含TPS兩個結(jié)構(gòu)域的基因。GjTPS家族成員理化性質(zhì)由Expasy（https://web.expasy.org/protparam/）提供，亞細(xì)胞定位預(yù)測分析則采用Euk-mPLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/）的數(shù)據(jù)。

1.2 梔子系統(tǒng)發(fā)育樹、保守基序及基因結(jié)構(gòu)分析

使用MEGA5 軟件以muscle 將梔子GjTPS 蛋白序列進(jìn)行多序?qū)Ρ龋米畲笏迫环ㄒ訨TT+G 模型建樹，Bootstraps 設(shè)置重復(fù)次數(shù)1 000 次，其余參數(shù)為默認(rèn)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。MEME 網(wǎng)站（https://memesuite.org/meme/tools/meme）預(yù)測保守基序，TBtools 軟件繪制基因結(jié)構(gòu)圖。將GjTPS 保守基序、基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域結(jié)果按照系統(tǒng)發(fā)育樹順序用TBtools軟件分別進(jìn)行可視化。

1.3 梔子與不同物種的系統(tǒng)發(fā)育分析

從在線網(wǎng)站EnsemblPlants（https://plants.ensembl.org/index.html）中下載擬南芥、葡萄的基因序列；中粒咖啡[23]（Coffee canephora）基因序列于中?？Х然蚪M數(shù)據(jù)庫（https://coffee-genome-hub.southgreen.fr/）下載。將梔子、擬南芥、葡萄、中?？Х萒PS 家族蛋白序列集合，用MEGA5 軟件進(jìn)行多序?qū)Ρ?，采用最大似然法?gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用Adobe Illustrator CC 2020軟件進(jìn)行美化分類。

1.4 染色體定位、基因重復(fù)類型及物種間共線性分析

根據(jù)鑒定的GjTPS基因ID 名稱，使用TBtools 軟件進(jìn)行GjTPS基因染色體定位可視化及Blast 得到基因重復(fù)文件。于在線網(wǎng)站EnsemblPlants 下載月季與番茄（Solanum lycopersicum）[24]基因組，使用TBtools軟件對梔子與自身及擬南芥、中?？Х?、月季、番茄進(jìn)行一一比對，得到共線性分析結(jié)果，并在TBtools軟件中進(jìn)行可視化，高亮其產(chǎn)生共線性的基因連線。

1.5 啟動子順式作用元件分析

41 個GjTPS基因上游（2000 bp）的序列由TBtools 軟件得到，用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測啟動子元件，并進(jìn)行可視化。

1.6 外源激素噴施試驗(yàn)

于2022年12月選取長勢基本一致且健康的2年生梔子分關(guān)1 號進(jìn)行盆栽定植，2023年4月開始參考張?jiān)品錥25]、刑勇翔[7]的方法進(jìn)行外源激素噴施試驗(yàn)，具體用量見表1（IAA、MeJA 試劑購自上海麥克林生化科技有限公司）。試驗(yàn)共7 個處理，每個處理20 個重復(fù)；噴施用量每次每盆50 mL，每隔7 d噴1次，共噴施2次。于6月10日采取每個處理盛花期的梔子花朵，用液氮速凍后置冰箱（-80 ℃）中保存，用于測定不同外源激素濃度下梔子花朵TPS基因家族成員的表達(dá)量。

表1 試驗(yàn)處理水平Table 1 Experimental treatment level

1.7 不同外源激素濃度下梔子花朵萜類物質(zhì)含量測定

參考MARIE 等[26]的方法并作修改，采用頂空固相微萃?。℉S-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS），測定不同外源激素濃度下梔子花朵TPS基因?qū)?yīng)產(chǎn)物的含量。氣相色譜儀質(zhì)譜儀品牌為Agilent，型號為6890N-G5795B；色譜柱為HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。稱取適量樣品至20 mL頂空瓶中，加入內(nèi)標(biāo)2-辛醇，使其上機(jī)濃度為5 mg·L-1，加入飽和氯化鈉，放入80 ℃加熱30 min，30 min后用將頂空微萃取進(jìn)樣針扎入頂空瓶中繼續(xù)加熱30 min后，250 ℃進(jìn)樣口解析5 min。

色譜條件：初始柱溫50 ℃保持2 min，以5 ℃·min-1升至180 ℃保持5 min，再以10 ℃·min-1升至250 ℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；傳輸線溫度為280 ℃；載氣流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：離子源溫度為230 ℃，四級桿溫度為150 ℃，質(zhì)譜為EI源，全掃40~600 m/z。

1.8 梔子TPS基因家族成員表達(dá)模式及與萜類物質(zhì)相關(guān)性檢測

對外源激素噴施試驗(yàn)中保存的梔子花朵進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得不同外源激素濃度下梔子TPS基因家族成員的表達(dá)量，利用TBtools軟件繪制表達(dá)量熱圖，分析TPS基因家族成員在不同外源激素濃度下的表達(dá)模式；采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法分析外源激素噴施的最適濃度。根據(jù)梔子花朵中萜類物質(zhì)的含量變化和TPS成員的相對表達(dá)量，使用SPSS 27.0 軟件進(jìn)行相關(guān)性分析后再用Origin 2022軟件繪制相關(guān)性熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 GjTPS基因家族鑒定與蛋白質(zhì)特征

使用TBtools 軟件分別篩選出53 條和66 條基因序列、本地Blast V3 程序得到72 條基因序列；經(jīng)過手動篩選，最終一共鑒定并獲得GjTPS基因家族成員41 個，并依次命名為GjTPS01~GjTPS41（表2）。梔子41 個GjTPS家族成員編碼蛋白的理化性質(zhì)分析結(jié)果如表2。GjTPS基因編碼氨基酸數(shù)量為380~849 個，預(yù)測分子量范圍為43.93~97.05 kDA。理論等電點(diǎn)為5.09~6.48，全部成員被認(rèn)為酸性（pI<7）。不穩(wěn)定指數(shù)為37.71~55.68，具有不穩(wěn)定指數(shù)<40 的穩(wěn)定蛋白7 個及不穩(wěn)定指數(shù)>40 的不穩(wěn)定蛋白34個。脂肪族指數(shù)為82.75~98.06，平均疏水性為-0.466~-0.148，均表現(xiàn)為親水性。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示梔子GjTPS基因均定位在葉綠體上。

表2 梔子TPS基因家族特征信息Table 2 Characterization of TPS family identified in Gardenia jasminoides

2.2 梔子TPS基因家族保守基序、基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域分析

TPS基因家族成員基本含有保守的DDXXD、RRX8W 的結(jié)構(gòu)域。保守基序分析表明（圖1A），同一亞家族中motif 結(jié)構(gòu)大多相似，GjTPS基因家族蛋白含有基序9~17 個，其中GjTPS07含有基序17 個，GjTPS33、GjTPS34含有基序9 個；最保守的基序?yàn)閙otif1，除了GjTPS16、GjTPS17、GjTPS18不含此基序，其余GjTPS基因亞家族均含有，其基序含DDXXD結(jié)構(gòu)域（圖1B）；motif8同樣是TPS亞家族蛋白常見保守基序，其結(jié)構(gòu)域?yàn)镽RX8W（圖1C），多數(shù)TPS亞家族含有此基序，但TPS-c、TPS-e/f 亞家族大多數(shù)基因不含motif8。

圖1 梔子GjTPS基因家族成員保守基序分布Figure 1 Conserved motifs of GjTPS gene family members in G. jasminoides

由圖2 可知，GjTPS家族的外顯子數(shù)量在5~15 之間，內(nèi)含子僅存在于GjTPS18、GjTPS36中。同一亞家族具有相似的外顯子數(shù)目及結(jié)構(gòu)。其中TPS-a亞家族含有外顯子5~8個，TPS-b有6~10個，TPSc 有11~15 個，TPS-e/f 有12~14 個，TPS-g 有7 個，這與中粒咖啡的報(bào)道一致。對梔子TPS 家族的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TPS-a 與TPS-b 亞家族為Terpene_cyclase_plant_C1 結(jié)構(gòu)域，其余亞家族均有特定的結(jié)構(gòu)域。

圖2 梔子GjTPS基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域分析Figure 2 Structure analysis of GjTPS gene in G. jasminoides

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

使用梔子（41個）、擬南芥（32個）、葡萄（49個）與中?？Х龋?1個）TPS家族的蛋白序列構(gòu)建ML 樹（圖3）。其中擬南芥為草本植物，葡萄為藤本植物，中?？Х葹樾棠厩遗c梔子同為茜草科植物。依據(jù)擬南芥的TPS基因家族分類方法，將梔子、擬南芥、葡萄、中?？Х鹊?63 個蛋白序列劃分為5 個亞家族。在梔子中，TPS-b 亞家族成員最多，共有14個家族成員；TPS-a亞家族有12個成員，TPS-c亞家族有6個家族成員，TPS-e/f亞家族含有8個成員，而TPS-g亞家族僅有1個成員。與之相似，中粒咖啡中TPS-a、TPS-b 兩個亞家族占據(jù)29/41的CcTPS 家族成員[23]。從上述保守基序分析中可知，幾乎所有梔子TPS 家族成員具有高度保守的富含天冬氨酸的結(jié)構(gòu)域DDXXD；除了TPS-c、TPS-e/f 亞家族幾乎不存在RRX8W 結(jié)構(gòu)域，其余家族具有此結(jié)構(gòu)域。其中，DDXXD 在異戊烯基二磷酸底物的金屬依賴電離中是重要的，RRX8W在單萜合酶的環(huán)化中是必不可少的[16]。

圖3 梔子、擬南芥、葡萄、中?？Х鹊南到y(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 Phylogenetic tree of TPS in G. jasminoides,A. thaliana, V. vinifera and C. canephora

2.4 染色體定位及進(jìn)化類型分析

由圖4可知，在10條染色體上不均勻地分布著梔子的41個GjTPS基因。梔子GjTPS基因在9號染色體上分布最多，共有13 個。2 號、4 號、5 號、11 號染色體只有1 個GjTPS基因；1 號和6 號染色體有6個GjTPS基因；最短的3 號染色體有4 個GjTPS基因。這表明染色體長短和GjTPS基因的分布沒有明顯的相關(guān)性。根據(jù)Tbtools軟件Blast得到的基因重復(fù)文件，串聯(lián)重復(fù)（36.59%）、近端重復(fù)（26.83%）、分散重復(fù)（26.83%）、全基因組重復(fù)或片段重復(fù)（9.76%）是梔子GjTPS基因家族擴(kuò)張的主要驅(qū)動因素。其中串聯(lián)重復(fù)在1號、6號、8號、9號染色體中形成小型基因簇，除標(biāo)紅的幾個基因簇外，還有幾個與其距離很近的基因，可能是由比較古老的串聯(lián)重復(fù)形成[19]。

圖4 梔子GjTPS基因家族染色體定位分析Figure 4 Chromosome locations of GjTPS gene family members in G. jasminoides

為進(jìn)一步挖掘梔子TPS基因自身及與其他物種間的進(jìn)化關(guān)系，本研究構(gòu)建了梔子、擬南芥、中?？Х?、月季與番茄的共線性分析（圖5），分別產(chǎn)生2，4，17，6，5條共線性基因?qū)?。其中，梔子有5條染色體與中?？Х犬a(chǎn)生共線性關(guān)系，且存在的共線基因?qū)?shù)目將近為其他樹種的3 倍及以上。同時，在APGⅣ分類系統(tǒng)中，梔子與中?？Х榷紝儆谲绮菘浦参铮M(jìn)一步證明了梔子與中?？Х葥碛懈挠H緣關(guān)系。

圖5 梔子與4種不同物種的共線性分析Figure 5 Collinearity analysis of G. jasminoides and four other species

2.5 啟動子順式作用元件分析

使用PlantCARE網(wǎng)站分析梔子GjTPS基因起始密碼子上游2 000 bp的核苷酸序列，鑒定出1 056個與先前報(bào)道的植物生長發(fā)育、植物激素響應(yīng)和脅迫相關(guān)具有相似性的順式作用調(diào)控元件[18]（圖6A）。參與植物生長發(fā)育的元件（201 個），主要包括開花調(diào)控、種子特異性表達(dá)、胚乳特異性表達(dá)等元件（圖6B）；植物激素響應(yīng)元件（493 個），主要有赤霉素、茉莉酸甲酯、生長素等元件（圖6C）；脅迫響應(yīng)元件（362 個）包括防御和應(yīng)激反應(yīng)、創(chuàng)傷反應(yīng)、干旱反應(yīng)等元件（圖6D）。其中，大多數(shù)的順式元件在植物激素響應(yīng)（493/1056）類別中，且MYC 基序（185/493）的占比最大，與茉莉酸甲酯響應(yīng)相關(guān)。綜上，梔子GjTPS基因可能受到多種植物激素和非生物脅迫的調(diào)節(jié)[18]，梔子TPS基因家族參與植物生長發(fā)育、激素、脅迫響應(yīng)。

2.6 不同外源激素濃度下梔子TPS基因家族成員的表達(dá)模式

由圖7 可知，大部分的梔子TPS基因家族成員在不同外源激素濃度下表達(dá)量不高，但有6 個成員在不同外源激素濃度作用下出現(xiàn)高表達(dá)，這6個基因均為TPS-a與TPS-b亞家族成員。吲哚乙酸低濃度與茉莉酸甲酯高濃度，TPS基因家族成員表達(dá)量均出現(xiàn)上調(diào)現(xiàn)象；結(jié)合表3可見，吲哚乙酸25 mg·L-1與茉莉酸甲酯1.25 mmol·L-1這兩個濃度分別為兩種外源激素的最適噴施濃度。GjTPS02、GjTPS12、GjTPS14、GjTPS20、GjTPS21、GjTPS22在各個處理中均高度表達(dá)，推測這些TPS基因可能與梔子花香有關(guān)。

圖7 梔子TPS基因在不同外源激素濃度下的表達(dá)情況Figure 7 The expression of TPS family genes of G. jasminoides at different concentrations of exogenous hormones

表3 不同外源激素濃度下梔子TPS基因的隸屬函數(shù)平均值Table 3 Subordinate function values of TPS family genes of G. jasminoides at different concentrations of exogenous hormones

2.7 不同外源激素濃度下梔子花朵萜類物質(zhì)含量分析

對不同外源激素濃度下梔子花朵揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定分析，分析其中的萜類物質(zhì)，并繪制熱圖，使梔子花朵萜類物質(zhì)的釋放結(jié)果可視化。根據(jù)GC-MS檢測出的10種含量最多的萜類物質(zhì)分析，不同外源激素濃度下梔子花朵的萜類物質(zhì)釋放量不同。由圖8可知，在所有濃度下梔子萜類物質(zhì)釋放量中，芳樟醇釋放量最高；茉莉酸甲酯0.25 mmol·L-1和1.25 mmol·L-1時芳樟醇、α-松油醇和香葉醇的含量都較高，0.25 mmol·L-1時，未檢測出橙花醇。在對照組中只檢測出7種含量較大的萜類物質(zhì)；吲哚乙酸處理中，濃度從低到高分別檢測出8，9，10種萜類物質(zhì)，呈逐漸上升趨勢；茉莉酸甲酯處理中，濃度從低到高分別檢測出8，10，10種萜類物質(zhì)。說明茉莉酸甲酯1.25 mmol·L-1是本試驗(yàn)萜類物質(zhì)釋放的最適濃度。

圖8 不同外源激素濃度下梔子萜類物質(zhì)釋放Figure 8 The release of terpenoids in the flowers of G.jasminoides at different concentrations of exogenous hormones

2.8 TPS表達(dá)量與萜類物質(zhì)揮發(fā)量的相關(guān)性分析

梔子花朵TPS表達(dá)量與萜類物質(zhì)揮發(fā)量的相關(guān)性分析結(jié)果表明（圖9），GjTPS12、GjTPS14、GjTPS23、GjTPS31、GjTPS36與7 種萜類物質(zhì)呈正相關(guān)；GjTPS20、GjTPS21、GjTPS24與6 種萜類物質(zhì)呈正相關(guān)；GjTPS22與5種萜類物質(zhì)呈正相關(guān)；其余均與小于5種萜類物質(zhì)呈正相關(guān)。其中GjTPS08僅與橙花醇揮發(fā)量呈正相關(guān)，與其余萜類物質(zhì)均為負(fù)相關(guān)；橙花醇僅與GjTPS24呈負(fù)相關(guān)，其余TPS基因家族成員均為正相關(guān)；芳樟醇與GjTPS12、GjTPS14、GjTPS20、GjTPS21、GjTPS22的相關(guān)性較大，其余均較小或?yàn)樨?fù)相關(guān)；GjTPS23與2-（4-甲基-3-環(huán)己烯-1-基）丙醛呈顯著性負(fù)相關(guān)。結(jié)合梔子花朵轉(zhuǎn)錄組TPS 基因表達(dá)情況，最終得到5 個可能參與梔子花香調(diào)控的基因，分別為GjTPS12、GjTPS14、GjTPS20、GjTPS21和GjTPS22。

圖9 梔子TPS家族成員基因表達(dá)與揮發(fā)性萜類物質(zhì)含量相關(guān)性Figure 9 Correlation analysis of gene expression and content of volatile terpenoids in TPS family members of G. jasminoides

3 討論與結(jié)論

TPS基因家族是個中等規(guī)模的基因家族，其TPS基因數(shù)量范圍為20~150[15]。例如，江南卷柏有14個SmTPS，山茶有23 個CsTPS，擬南芥有32 個AtTPS，葡萄有69 個VvTPS。根據(jù)TPS N 端和C 端結(jié)構(gòu)域，本研究一共鑒定出41個GjTPS基因，分為5個亞家族，不含TPS-d與TPS-h亞家族。TPS-b是梔子最大的亞家族，本結(jié)果與鐵皮石斛、大花蕙蘭的結(jié)果一致，但與擬南芥、月季、中?？Х鹊慕Y(jié)果不一樣。在與擬南芥、中?？Х取⑵咸训谋容^分析中，梔子在TPS-b、TPS-c、TPS-e/f 亞家族發(fā)生了選擇性的擴(kuò)張，是由近端重復(fù)、分散重復(fù)與串聯(lián)重復(fù)導(dǎo)致?；蚣易宓臄U(kuò)張一般與植物的生物學(xué)特性相關(guān)，如葡萄TPS-a 亞家族的擴(kuò)張帶來巨大的旁系同源簇，使其與來自其他物種的TPS基因關(guān)系更密切。擬南芥與葡萄中TPS-b 亞家族是單萜合酶的主要來源，負(fù)責(zé)催化多種單萜化合物的形成。擬南芥中的AtTPS04被證實(shí)是香葉基芳樟醇合酶[27]；葡萄TPS-g 亞家族被證實(shí)與芳樟醇、香葉醇合成相關(guān)，TPS-b亞家族則可促進(jìn)松油醇的合成[18]。梔子花朵的揮發(fā)性萜類物質(zhì)鑒定中，單萜化合物芳樟醇、α-松油醇、香葉醇、橙花醇占比較大，其中芳樟醇是梔子花朵的主要揮發(fā)性成分之一；梔子含有更多的TPSb、TPS-e/f亞家族基因，能夠合成更多芳香類化合物。

生長素作為一種不可或缺的植物激素，在植物生長發(fā)育的諸多進(jìn)程中都發(fā)揮著重要的作用；柯艷果[28]發(fā)現(xiàn)使用吲哚乙酸處理后，姜花揮發(fā)性物質(zhì)釋放量均顯著升高。茉莉酸甲酯是由硬脂酸途徑產(chǎn)生的脂肪酸衍生物，也是茉莉中特殊香味的重要組成成分；姜一凡[29]發(fā)現(xiàn)茉莉酸甲酯長期處理（24 h）能顯著提高毛果楊葉中萜類物質(zhì)的釋放量。本研究采用吲哚乙酸與茉莉酸甲酯進(jìn)行噴施試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)吲哚乙酸低濃度與茉莉酸甲酯高濃度，TPS基因家族成員表達(dá)量均出現(xiàn)上調(diào)現(xiàn)象，GjTPS02、GjTPS12、GjTPS14、GjTPS20、GjTPS21、GjTPS22這6 個基因在各處理的表達(dá)量較高；1.25 mmol·L-1的茉莉酸甲酯對梔子花朵萜類物質(zhì)釋放影響較大，芳樟醇是梔子花朵的主要揮發(fā)性萜類物質(zhì)。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和GCMS 分析結(jié)果，對梔子TPS基因表達(dá)水平和萜類物質(zhì)含量進(jìn)行相關(guān)性分析，GjTPS12、GjTPS14、GjTPS20、GjTPS21、GjTPS22分別與7，7，6，6，5 種萜類物質(zhì)呈正相關(guān)，這5 個基因可能參與梔子花香代謝的調(diào)控。

RRX8W 在異戊烯基二磷酸底物的金屬依賴電離中和單萜合酶的環(huán)化中是必不可少的[16]。其中，TPS-a 家族的第2 個R 是不保守的[20]，在TPS-b 亞家族中是保守的，TPS-c 亞家族不含有RRX8W 結(jié)構(gòu)[13]，本研究結(jié)果與其保持一致。RRX8W 與單萜合酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)運(yùn)肽相關(guān)，擬南芥的TPS-b亞家族成員中的AtTPS10被表征為月桂烯與羅勒烯合酶[13]。在GjTPS基因的啟動子區(qū)域觀察到很多的順式作用元件，大多數(shù)在植物激素響應(yīng)類別中，茉莉酸甲酯響應(yīng)相關(guān)的MYC 基序占據(jù)大部分的位置。結(jié)果表明，梔子GjTPS基因的表達(dá)模式可以通過茉莉酸甲酯來調(diào)控，并且可以響應(yīng)多種環(huán)境脅迫調(diào)控。

萜類合成酶基因形成基因簇有助于基因組合的共遺傳和共表達(dá)，減少單一通路基因在重組后丟失的可能性[30]。染色體定位顯示，1，3，5，6，8，9號染色體都存在串聯(lián)重復(fù)，且8號和9號染色體的基因簇都為TPS-b家族成員，推測這加強(qiáng)了基因的共表達(dá)。共線性可以反映物種間的進(jìn)化關(guān)系，遠(yuǎn)緣物種經(jīng)歷更大程度的基因組重排，使得共線性區(qū)域的數(shù)量和范圍均減少，而近緣物種的基因組間往往蘊(yùn)藏著豐富的共線性區(qū)域[31]。共線性分析表明，梔子與其同科植物中?？Х扔懈挠H緣關(guān)系，兩者的共線性基因?qū)Ω哌_(dá)17 對；梔子GjTPS的基因中也存在2 條基因?qū)Γf明梔子這2 條GjTPS基因?qū)τ兄軓?qiáng)的親緣關(guān)系。

本研究通過對梔子TPS基因家族成員的鑒定及與功能分析，結(jié)合外源激素噴施試驗(yàn)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組與揮發(fā)性萜類物質(zhì)含量測定，發(fā)現(xiàn)梔子TPS基因在TPS-b亞家族發(fā)生了選擇性擴(kuò)張，家族成員達(dá)到擬南芥的2.3 倍；1.25 mmol·L-1的茉莉酸甲酯有助于梔子TPS基因家族成員的表達(dá)及萜類物質(zhì)的釋放；GjTPS12、GjTPS14、GjTPS20、GjTPS21和GjTPS22這5個基因可能與梔子萜類化合物的合成、釋放相關(guān)。本研究結(jié)果為后續(xù)研究梔子TPS家族基因調(diào)控花香提供了一定的理論依據(jù)，為進(jìn)一步解析梔子GjTPS基因功能提供了一定的方向。