藤黃健骨膠囊對PMOP大鼠RANKL/c-Fos/NFATc1通路的影響

安方玉 顏春魯 柳穎 王霞霞 孫柏 汪春梅 常偉榮 宋佳眙 王玉潔 張捷 肖志攀 高鵬

甘肅中醫(yī)藥大學(xué),甘肅 蘭州 730000

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是由于女性絕經(jīng)后卵巢分泌雌激素的功能下降導(dǎo)致破骨細(xì)胞(osteoclast,OC)介導(dǎo)的骨吸收大于成骨細(xì)胞(osteoblast,OB)介導(dǎo)的骨形成而引起的一種全身代謝障礙性疾病[1-2]。其疼痛、骨折嚴(yán)重威脅了女性的生活質(zhì)量[3]。如何有效治療PMOP成為醫(yī)學(xué)研究者關(guān)注的焦點。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為PMOP的病機(jī)多為“本虛標(biāo)實”:腎虛為本,血瘀為標(biāo),治則當(dāng)以“標(biāo)本兼治、補腎活血”為治療大法。本課題組前期動物實驗結(jié)果已證實,補腎活血方藤黃健骨膠囊能夠通過調(diào)控卵巢模型鼠OPG/RANK/RANKL調(diào)節(jié)軸去來影響其Ga2+、P代謝[4]。臨床試驗研究結(jié)果也進(jìn)一步證實藤黃健骨膠囊能夠通過明顯升高老年性骨質(zhì)疏松癥患者BGP、OPG、BMD含量來發(fā)揮治療作用[5],但具體機(jī)制尚未闡明。

近年來研究發(fā)現(xiàn),驅(qū)動骨代謝的免疫調(diào)節(jié)分子IL-33能夠通過抑制RANKL誘導(dǎo)的OC形成防止炎癥性骨丟失的發(fā)生[6]。也有研究發(fā)現(xiàn)c-fos在骨代謝相關(guān)疾病中對OB-OC動態(tài)平衡產(chǎn)生著重要影響[7-8]。此外也發(fā)現(xiàn)抑制活化T細(xì)胞c1核因子(nuclear factor of activated T-cells,NFATc1)蛋白表達(dá)的同時可抑制去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠的OC分化[9]。由此推測免疫調(diào)節(jié)分子IL-33對RANKL/c-Fos/NFATc1骨代謝信號軸的影響可能是PMOP發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制。因此,本課題通過觀察藤黃健骨膠囊對PMOP大鼠免疫調(diào)節(jié)因子IL-33、IL-1、IL-31變化及RANKL/c-Fos/NFATc1骨代謝信號軸關(guān)鍵調(diào)控分子OPG、RANKL、RANK、c-Fos、NFATc1的表達(dá)變化,初步探尋補腎活血方藤黃健骨膠囊防治骨質(zhì)疏松尋找關(guān)鍵靶點,以期為中醫(yī)藥治療PMOP提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:60只SPF級SD雌性大鼠由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研中心供應(yīng),體重(180±20)g,動物質(zhì)量合格證號為SCXK(甘)2020-0001。飼養(yǎng)于環(huán)境溫度為20 ℃、濕度為42%～52% SPF級實驗室中,常規(guī)飼養(yǎng)。本實驗經(jīng)過甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會的批準(zhǔn)(批號:2021-809)。

1.1.2藥物、試劑及儀器:藤黃健骨膠囊(甘肅省西峰制藥有限責(zé)任公司,批號:210108);戊酸雌二醇片(法國DELPHARM Lille S.A.S.公司,批號:676A);IL-33、IL-1、IL-31含量測定盒(江蘇菲亞生物科技有限公司,批號:2212R36、2212R31、2212R37);OPG一抗(美國GeneTex公司,批號:822005891);RANK、RANKL、c-Fos一抗(美國ImmunoWay Biotech,批號:B8101、B0401、B8401);NFATc1一抗(美國Abclonal公司,批號:0073810201)。Multiskan Sky型酶標(biāo)儀(北京昊諾斯科技有限公司);EXPERT-XL型雙能X線骨密度儀(美國GE公司);Chemi Doc XRS型凝膠成像儀(美國BIO-RAD公司);Ds-fi3顯微鏡(日本Nikon)。

1.2 方法

1.2.1分組:60只SD雌性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham group,Sham)、模型組(postmenopausal osteoporosis model group,PMOP),陽性對照組(estradiol valerate group,ESV)、藤黃健骨膠囊高劑量(Tenghuang Jiangu capsule high-dose group,TJCH)、中劑量(Tenghuang Jiangu capsule medium-dose group,TJCM)、低劑量(Tenghuang Jiangu capsule low-dose group,TJCL)組,每組10只。

1.2.2PMOP大鼠模型構(gòu)建與干預(yù):依據(jù)參考文獻(xiàn)[10-11],在每組動物術(shù)前禁水、禁食12 h后給予戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射。仰臥位固定每組動物,剔除其側(cè)腹周圍毛發(fā),常規(guī)碘伏消毒后沿背部后正中線作一1.0～1.5 cm縱形切口,逐層切開皮膚、筋膜、肌肉,鈍性分離進(jìn)入腹腔找到棕黃色呈菜花樣的卵巢將其切除并止血,再逐層縫合切口。假手術(shù)組只切除卵巢附近的脂肪組織。術(shù)后給予每組動物青霉素以防感染,常規(guī)飼養(yǎng)。卵巢摘除8周后于每天上午9點開始進(jìn)行灌胃干預(yù),TJC治療組給予TJC 0.36、0.18、0.09 g/kg灌胃(藤黃健骨膠囊劑量設(shè)置依據(jù)參考文獻(xiàn)[12],人臨床用量為2 g,按照人與大鼠的體表面積換算法:人用劑量2 g×0.018×5≈0.18 g/kg作為中劑量),ESV組給予戊酸雌二醇0.09 mg/kg灌胃,Sham組和PMOP組大鼠給予等量蒸餾水灌胃,連續(xù)干預(yù)8周[13-14]。

1.2.3體質(zhì)量檢測:動物干預(yù)結(jié)束后次日用電子天平測定各組動物的體質(zhì)量變化。

1.2.4骨密度檢測:動物干預(yù)結(jié)束后次日將其麻醉,通過雙能X線吸收測量儀測量各組動物股骨的骨密度(bone mineral density,BMD),具體操作程序的設(shè)置根據(jù)儀器使用說明書進(jìn)行。

1.2.5股骨組織病理形態(tài)學(xué)改變觀察:BMD檢測結(jié)束后通過股動脈采血處死每組動物,摘取每組動物完整的右側(cè)股骨并剔除其股骨表面的軟組織,浸潤于4 %的多聚甲醛中過夜,第二日用PBS沖洗后EDTA脫鈣處理,每隔24 h更換1次EDTA脫鈣液,1個月后常規(guī)制作石蠟切片,切片厚度為5 μm切片,HE染色后封片并鏡檢,觀察股骨形態(tài)改變情況。

1.2.6血清中免疫調(diào)節(jié)因子的含量檢測:采集大鼠股動脈血液5 mL,3 000 r/min離心5 min,收集上層血清做ELISA檢測,通過ELISA測試盒測定IL-33、IL-1、IL-31含量的表達(dá)變化。

1.2.7股骨組織OPG、RANKL、RANK、c-Fos、NFATc1基因表達(dá)檢測:TRizol裂解液股骨RNA,以RNA為模板,在反應(yīng)條件和時間分別為25 ℃ 5 min、55 ℃ 15 min和85 ℃ 5 min中逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,接著進(jìn)行OPG、RANKL、RANK、c-Fos、NFATc1等目的基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng),反應(yīng)條件設(shè)置為預(yù)變性過程95 ℃ 5 min,變性過程95 ℃ 10 s,退火過程55 ℃ 20 s和延伸過程72 ℃ 20 s。目的基因相對表達(dá)量以2-△△Ct來表示。所有引物序列見表1。

表1 RT-PCR的引物序列Table 1 Primer sequence of RT-PCR

1.2.8股骨組織OPG、RANKL、RANK、c-Fos、NFATc1蛋白表達(dá)檢測:加入RIPA裂解液提取股骨組織總蛋白,將蛋白樣品電泳、轉(zhuǎn)膜,封閉后加入一抗OPG、RANKL、RANK、c-Fos、NFATc1等孵育過夜(設(shè)置溫度為4 ℃),二抗孵育1 h(設(shè)置溫度為37 ℃)后顯色、曝光。最后以GAPHD蛋白為內(nèi)參測定各組動物股骨組織目的蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 六組動物體質(zhì)量和BMD指標(biāo)比較

與Sham組比較,PMOP組和TJCL組大鼠體質(zhì)量顯著升高,BMD顯著降低(P<0.05或P<0.01);與PMOP組比較,TJCH組和ESV組大鼠體質(zhì)量顯著減輕,TJCH、TJCM、TJCL組和ESV組大鼠BMD顯著增加(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 六組動物體質(zhì)量和BMD指標(biāo)比較

2.2 六組動物股骨組織病理形態(tài)學(xué)變化

Sham組大鼠股骨組織形態(tài)及結(jié)構(gòu)正常,骨小梁排列規(guī)則,骨髓腔內(nèi)有極少量脂滴沉積;PMOP組、TJCM組和TJCL組大鼠股骨組織骨小梁稀疏斷裂、數(shù)目明顯減少,不能連接成網(wǎng),PMOP組和TJCL組骨髓腔內(nèi)有大量脂滴沉積;TJCH組和ESV組大鼠骨小梁數(shù)量增加,連接完整、排列較整齊、連續(xù)性好,而TJCH組、TJCM組和ESV組骨髓腔內(nèi)有脂滴沉積,但脂滴沉積數(shù)量明顯減少。見圖1。

圖1 各組大鼠股骨組織病理形態(tài)改變(HE,×20)Fig.1 Pathological changes of femoral tissue in each group (HE, ×20)

與Sham組比較,PMOP組大鼠BMAT明顯升高(P<0.01);與PMOP組比較,TJCH組、TJCM組和ESV組大鼠BMAT明顯降低(P<0.01)。見表3。

表3 六組動物骨髓脂肪組織相對面積比較

2.3 六組動物血清免疫調(diào)節(jié)因子含量變化

與Sham組比較,PMOP組大鼠血清IL-33含量明顯降低,IL-1和IL-31含量明顯升高(P<0.01);與PMOP組比較,TJCH組和ESV組大鼠血清IL-33含量均顯著增加,TJCH、TJCM、TJCL組和ESV組大鼠血清IL-1及IL-31含量均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。見表4。

表4 六組動物免疫調(diào)節(jié)因子含量比較

2.4 六組動物股骨組織OPG、RANKL、RANK、c-Fos、NFATc1基因表達(dá)變化

與Sham組比較,PMOP組大鼠股骨組織OPG基因表達(dá)顯著降低,RANKL、RANK、c-Fos、NFATC1基因表達(dá)顯著升高(P<0.01);與PMOP組比較,TJCH、TJCM組和ESV組大鼠股骨組織OPG基因表達(dá)均顯著增加、RANK基因表達(dá)均顯著降低,TJCH、TJCM、TJCL組和ESV組大鼠股骨組織RANKL、c-Fos、NFATc1的基因表達(dá)也均顯著降低(P<0.01)。見圖2。

圖2 六組動物OPG、RANKL、RANK、c-Fos、NFATc1基因表達(dá)結(jié)果比較Fig.2 Comparison of gene expression of OPG, RANKL, RANK, c-Fos, NFATc1 among six groups

2.5 六組動物股骨組織OPG、RANKL、RANK、c-Fos、NFATc1蛋白表達(dá)變化

與Sham組比較,PMOP組大鼠股骨組織OPG蛋白表達(dá)及蛋白表達(dá)灰度值顯著降低,RANKL、RANK、c-Fos、NFATc1蛋白表達(dá)及蛋白表達(dá)灰度值顯著升高(P<0.01);與PMOP組比較,TJCH、TJCM組和ESV組大鼠股骨組織OPG蛋白表達(dá)及蛋白表達(dá)灰度值均顯著增加、RANK蛋白表達(dá)及蛋白表達(dá)灰度值均顯著降低,TJCH、TJCM、TJCL組和ESV組大鼠股骨組織RANKL、c-Fos、NFATc1的蛋白表達(dá)及蛋白表達(dá)灰度值也均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。見圖3～圖4。

圖3 六組動物OPG、RANKL、RANK、c-Fos、NFATc1蛋白表達(dá)變化(Western-blot)Fig.3 The protein expression changes of OPG, RANKL, RANK, c-Fos, NFATc1 among six groups (Western-blot)

圖4 六組動物OPG、RANKL、RANK、c-Fos、NFATc1蛋白表達(dá)灰度值結(jié)果比較Fig.4 Comparison of the gray value radio of protein expression of OPG, RANKL, RANK, c-Fos, NFATc1 among six groups

3 討論

祖國醫(yī)學(xué)將PMOP歸屬于“骨痿”范疇,臨床患者多以“腎虛血瘀”為主要證型。其發(fā)病主要是由于PMOP患者長期腎精虧虛致使骨髓充盈不足,后者誘發(fā)骨骼失養(yǎng)而致“痿”;此外,腎為先天之本,PMOP患者長期腎精不足則無以化生血而致“瘀”。因此,PMOP的防治方法側(cè)重于“補腎活血”。

藤黃健骨膠囊主要組成是熟地黃、骨碎補、肉蓯蓉、鹿銜草、淫羊藿、雞血藤、萊菔子。諸藥合用,具有“補腎壯骨,活血止痛”之效。從中醫(yī)的角度來說,藤黃健骨膠囊與PMOP“腎虛精虧,瘀血阻絡(luò)”的病機(jī)相契合,符合PMOP“補腎壯骨、活血通絡(luò)”的治療原則。周霖等[14]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)GO富集分析發(fā)現(xiàn)藤黃健骨膠囊主要涉及炎癥反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白磷酸化等生物過程,胞質(zhì)、包膜等細(xì)胞組分及酶活性、能量活性等分子功能?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),中藥骨碎補可能通過下調(diào)Notch1和抑制NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥來顯著改善老年P(guān)MOP患者的血脂水平脂質(zhì)狀況[15]。骨碎補有效成分柚皮苷通過靶向JAK2/STAT3信號傳導(dǎo)促進(jìn)BMSC成骨分化,也可以減緩PMOP大鼠的骨丟失[16]。淫羊藿及其生物活性成分[17]均可抑制骨轉(zhuǎn)換,增加鼠的骨密度,改善骨小梁厚度來逆轉(zhuǎn)去卵巢大鼠誘導(dǎo)的骨丟失,延緩PMOP的發(fā)生發(fā)展。臨床試驗結(jié)果也證實藤黃健骨膠囊可顯著升高腎虛血瘀型原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者的骨密度,降低骨代謝,促進(jìn)骨鈣化形成,增加骨強度[18]。臨床試驗研究結(jié)果進(jìn)一步證實藤黃健骨膠囊能夠明顯升高老年性骨質(zhì)疏松癥患者BGP、OPG含量,明顯降低其ALP、U-Ca/Cr、U-HoP/Cr含量,從而通過抑制老年性骨質(zhì)疏松癥患者的骨吸收和促進(jìn)骨生成來提高其BMD,進(jìn)而發(fā)揮治療作用[5]。本實驗結(jié)果也證實藤黃健骨膠囊能夠提高PMOP模型鼠的體重,降低BMD和BMAT,且TJCH組大鼠骨小梁數(shù)量、排列及髓腔內(nèi)脂滴沉積接近于假手術(shù)組,提示藤黃健骨膠囊治療PMOP是有效的,但具體機(jī)制未明。

研究發(fā)現(xiàn),破骨細(xì)胞因子主要屬于T輔助因子1(Th1)型,而T輔助因子2(Th2)型細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子則可以抵消Th1型介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)對OC功能的影響[19-20]。IL-33作為一種新發(fā)現(xiàn)的Th2型細(xì)胞因子,一方面通過刺激OB成熟來減少OC生成[21];另一方面還可直接促進(jìn)人單核細(xì)胞前體分化為OC,獨立誘導(dǎo)骨吸收[22]。相反,也有研究證明,IL-33還可通過激活T細(xì)胞胞質(zhì)1核因子(NFATc1)的失活(FATc1是RANKL誘導(dǎo)的OC形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子)和RANKL途徑對OC分化發(fā)揮抑制作用[23]。此外,另有研究發(fā)現(xiàn),IL-33也可通過誘導(dǎo)Th2細(xì)胞分泌IL-31,抑制RANKL依賴性O(shè)C生成,從而抵消骨丟失[24]。IL-31是一種主要由偏向Th2表型的活化CD45RO+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子,主要誘導(dǎo)參與OC前體募集和免疫介導(dǎo)的骨吸收,對細(xì)胞增殖和組織重塑發(fā)揮多種調(diào)節(jié)作用[25-26]。以上結(jié)果表明,免疫調(diào)節(jié)分子IL-33通過調(diào)控IL-31的分泌來抑制OC生成,這種作用可能是通過RANKL軸來實現(xiàn)的。

現(xiàn)代研究證明,OPG/RANK/RANKL信號軸在調(diào)節(jié)PMOP的OB-OC成熟與分化,調(diào)控OB-OC動態(tài)平衡方面發(fā)揮著重要作用[27-28]。在骨組織中,由OB分泌的OPG是抑制骨吸收,增加皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨密度、面積和骨強度的關(guān)鍵細(xì)胞因子[29]。RANK與OC及其前體細(xì)胞表面RANKL結(jié)合,是一種能夠促進(jìn)OC成熟、分化和減慢其凋亡的關(guān)鍵細(xì)胞因子[29]。RANKL作為調(diào)控骨吸收的關(guān)鍵細(xì)胞因子,是OC分化、成熟的下游靶標(biāo)分子[30]。而OPG作為RANKL高親和力誘餌樣受體,通過競爭結(jié)合RANKL,阻斷RANK與RANKL結(jié)合,影響RANK-RANKL途徑,使OC轉(zhuǎn)錄活化信號生成減少,從而抑制骨吸收,增加皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨密度、面積和骨強度,維持骨代謝平衡[29]。絕經(jīng)后女性因雌激素缺乏導(dǎo)致機(jī)體RANKL表達(dá)水平增高,OPG表達(dá)水平下降,促進(jìn)RANKL與RANK的結(jié)合,OC收到RANK-RANKL途徑產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄活化信號,刺激前破骨細(xì)胞分化為OC,從而促進(jìn)OC的形成、分化、成熟,致使骨吸收增加、骨組織損傷,最終誘發(fā)OP[31]。

另有研究發(fā)現(xiàn),c-fos/NFATc1信號通路的激活對OC分化至關(guān)重要,c-fos、NFATc1蛋白的任一缺失將導(dǎo)致OC前體細(xì)胞無法分化為成熟的OC[32-33]。c-fos是骨細(xì)胞生長和分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,在骨代謝相關(guān)疾病中對OB-OC動態(tài)平衡產(chǎn)生著重要影響[7-8]。活化T細(xì)胞c1核因子(nuclear factor of activated T-cells,NFATc1)是NFAT家族成員之一,有研究證實,抑制NFATc1的蛋白表達(dá)可抑制去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠的OC分化,治療骨吸收過度導(dǎo)致的炎癥性骨病[9]。近年來研究也表明,NFATc1表達(dá)于哺乳動物的多種組織中,并發(fā)現(xiàn)其在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要調(diào)控作用[34]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),PMOP模型組大鼠體重、脂肪組織相對面積(BMAT)、血清IL-1、IL-31含量和股骨RANKL、RANK、c-Fos、NFATc1基因表達(dá)、蛋白表達(dá)及蛋白表達(dá)灰度值均明顯增加,而BMD、血清IL-33含量、股骨OPG基因表達(dá)、蛋白表達(dá)及蛋白表達(dá)灰度值則均顯著降低。與上述文獻(xiàn)報道結(jié)果一致。而給予藤黃健骨膠囊干預(yù)后,結(jié)果發(fā)現(xiàn),藤黃健骨膠囊能夠降低PMOP大鼠的體重、BMAT、血清IL-1和IL-31含量、股骨RANK、RANKL、c-Fos、NFATc1的基因表達(dá)、蛋白表達(dá)及蛋白表達(dá)灰度值,能夠升高其BMD、血清IL-33含量、股骨組織OPG基因表達(dá)、蛋白表達(dá)及蛋白表達(dá)灰度值。這些結(jié)果表明藤黃健骨膠囊通過提高PMOP模型大鼠免疫調(diào)控分子IL-33含量來抑制RANKL/c-fos/NFATc1骨代謝信號通路關(guān)鍵分子NFATC1的上調(diào)表達(dá),進(jìn)而抑制其破骨細(xì)胞分化,糾正骨代謝紊亂,從而促進(jìn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的骨重塑。該項研究初步揭示了免疫調(diào)節(jié)分子IL-33對PMOP模型鼠RANKL/c-fos/NFATc1信號軸的調(diào)控機(jī)制及藤黃健骨膠囊的干預(yù)機(jī)制,并探尋了補腎活血方藤黃健骨膠囊防治骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵靶點IL-33和NFATc1,為藤黃健骨膠囊的臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù),也為骨質(zhì)疏松癥的防治和藥物研發(fā)提供了新思路。

綜上,藤黃健骨膠囊治療PMOP的可能機(jī)制是免疫調(diào)節(jié)因子IL-33抑制了PMOP模型鼠RANKL/c-fos/NFATc1信號軸破骨細(xì)胞分化標(biāo)志分子NFATc1的表達(dá),從而發(fā)揮療效。但是由于藤黃健骨膠囊是一種復(fù)方制劑,存在多成分、多靶點的調(diào)節(jié)特點,其IL-33除了通過RANKL/c-fos/NFATc1信號軸對OC的分化起調(diào)控作用外,是否還可以通過調(diào)控其他的信號軸來同時調(diào)控OB增殖及成骨形成,目前尚未見相關(guān)研究。這或許是未來OP發(fā)病機(jī)制研究的一個方向,也可能成為藤黃健骨膠囊防治機(jī)制的研究熱點。