基于響應(yīng)面法優(yōu)化高效液相色譜法檢測(cè)涼茶顆粒中7種綠原酸及其類似物的微波輔助萃取條件

陸劍華,陳其釗,王桂華,高裕鋒,陳嘉敏,韓秋珍,黃可靜,李穎茵

(廣東省科學(xué)院生物與醫(yī)學(xué)工程研究所(國(guó)家糖業(yè)質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心),廣州 510316)

綠原酸(CGA)是由咖啡酸與奎寧酸縮合成的酯,是植物體在有氧呼吸過程中經(jīng)磷酸戊糖途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物[1-2]。根據(jù)酯化位置和數(shù)目的不同,可將綠原酸及其類似物分為新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、洋薊素、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C等7種[2]。

綠原酸具有抗氧化、抗微生物、抗病毒、抗痙攣、降血糖、保護(hù)肝臟和神經(jīng)等作用,是許多中成藥的重要功效成分[3-4]。綠原酸的萃取工藝主要有水提醇沉法、加熱回流法、超聲法、酶法等,這些方法均存在萃取時(shí)間長(zhǎng)、溶劑消耗大等缺點(diǎn)[5-9]。其他方法如超臨界流體萃取法設(shè)備昂貴;微波輔助萃取技術(shù)具有耗時(shí)短、試劑耗費(fèi)少,選擇性、萃取率高,后處理方便,安全和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn),且萃取過程中藥粉不凝聚、不糊化[10],應(yīng)用十分廣泛[11-16],但在萃取中成藥綠原酸中應(yīng)用的報(bào)道較少。本工作通過單因素法和響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助萃取條件,并在優(yōu)化的條件下萃取涼茶顆粒樣品中綠原酸、新綠原酸、 隱綠原酸、洋薊素、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C等7種綠原酸及其類似物,以高效液相色譜法(HPLC)同時(shí)測(cè)定,取得了滿意結(jié)果。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290型高效液相色譜儀;MDS-15型密閉式高通量微波消解/萃取工作站;KQ-500DE型超聲波清洗機(jī);VORTEX 3型渦旋混合器;CL5R型醫(yī)用離心機(jī);Milli-Q 型超純水系統(tǒng)。

單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1 000 mg·L-1,分別取適量綠原酸、新綠原酸、 隱綠原酸、洋薊素、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中,搖勻備用。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:取適量單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,渦旋均勻后,用甲醇稀釋,配制成各目標(biāo)物質(zhì)量濃度為0.01,0.05,0.1,0.5,1.0,2.0, 4.0 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、洋薊素、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C等標(biāo)準(zhǔn)品的純度均不小于98%;甲醇、乙腈均為色譜純;甲酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸均為分析純;試驗(yàn)樣品均采購(gòu)于藥店,樣品信息見表1。

表1 樣品信息

1.2 色譜條件

ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫30 ℃;二極管陣列檢測(cè)器;進(jìn)樣量10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)325 nm;流動(dòng)相A為0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)磷酸溶液,B為甲醇;流量1.0 mL·min-1。梯度洗脫程序:0～2.00 min,A由90%降至85%;2.00～10.00 min,A由85%降至75%;10.00～20.00 min,A 由75%降至67%;20.00～27.00 min,A由 67%降至58%,保持13.00 min;40.00～40.01 min,A 由58%跳轉(zhuǎn)至90%,保持4.99 min。

1.3 試驗(yàn)方法

取1.00 g涼茶顆粒樣品,加入20 mL 70%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇溶液,渦旋溶解1 min,置于微波萃取儀中,于80 ℃萃取 2.0 min。結(jié)束后搖勻,以0.22 μm濾膜過濾,濾液按照色譜條件測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動(dòng)相

參照相關(guān)文獻(xiàn)[17-27],考察了分別以0.5%(體積分?jǐn)?shù),下同)磷酸溶液-甲醇、0.1%磷酸溶液-甲醇、0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙酸溶液-甲醇、0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸溶液-甲醇、0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)三氟乙酸溶液-甲醇、0.1%三氟乙酸溶液-乙腈和0.1%三氟乙酸溶液-甲醇-乙腈這些體系作流動(dòng)相時(shí)對(duì)7種目標(biāo)物分離效果的影響。結(jié)果顯示:以0.1%甲酸溶液作水相時(shí),異綠原酸A和異綠原酸B色譜峰重疊;以0.1%乙酸溶液作水相時(shí),7種目標(biāo)物的色譜峰均拖尾;以甲醇作有機(jī)相時(shí),7種目標(biāo)物色譜峰沒有重疊現(xiàn)象;乙腈洗脫能力比較強(qiáng),作有機(jī)相時(shí),異綠原酸A和洋薊素色譜峰容易重疊;用0.1%磷酸溶液-甲醇、0.1%三氟乙酸溶液-甲醇體系進(jìn)行洗脫時(shí),洗脫效果均較好,且峰形對(duì)稱。磷酸是實(shí)驗(yàn)室更常用的試劑,因此試驗(yàn)選擇0.1%磷酸溶液-甲醇體系作流動(dòng)相。進(jìn)一步考察了磷酸體積分?jǐn)?shù)分別為0.1%, 0.2%, 0.5%, 1.0%時(shí)對(duì)7種目標(biāo)物分離效果的影響。結(jié)果顯示,隨著磷酸體積分?jǐn)?shù)的增加,7種目標(biāo)物的保留時(shí)間整體延長(zhǎng),但是其分離度、峰形以及響應(yīng)值均變化不大。從保護(hù)色譜柱的角度出發(fā),試驗(yàn)選擇的流動(dòng)相為0.1%磷酸溶液-甲醇體系。

2.1.2 色譜柱

試驗(yàn)比較了分別以ECOSILC18-eco 100A C18、Diamonsil Plus C18、Shim-pack VP-ODS C18、GL-InertSustain C18、ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱作固定相時(shí)7種目標(biāo)物的分離效果,結(jié)果見圖1。

圖1 不同色譜柱分離情況考察Fig.1 Investigation of separation conditions on different chromatographic columns

由圖1可知:以Diamonsil Plus C18色譜柱分離時(shí),異綠原酸A和洋薊素色譜峰出現(xiàn)重疊;以Shim-pack VP-ODS C18色譜柱分離時(shí),異綠原酸A和洋薊素色譜峰較寬,也出現(xiàn)重疊;以GL-InertSustain C18色譜柱分離時(shí),異綠原酸B、異綠原酸A、洋薊素和異綠原酸C的色譜峰形較差;以ZORBAX Eclipse Plus C18和ECOSIL C18-eco 100A C18色譜柱分離時(shí),7種目標(biāo)物能達(dá)到基線分離,且峰形對(duì)稱。綜合考慮,試驗(yàn)選擇采用ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱分離7種目標(biāo)物。

2.1.3 柱溫

柱溫對(duì)7種目標(biāo)物的分離效果影響較大[24],因此試驗(yàn)考察了柱溫分別為25, 30, 35, 40 ℃時(shí)對(duì)7種目標(biāo)物分離效果的影響。結(jié)果顯示:柱溫升高,7種目標(biāo)物的保留時(shí)間整體縮短,分離度變化不大。從節(jié)省試驗(yàn)時(shí)間角度考慮,試驗(yàn)選擇的柱溫為30 ℃。

2.1.4 檢測(cè)波長(zhǎng)

用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,測(cè)得綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、洋薊素、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C的最大吸光度對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)均為325 nm,因此試驗(yàn)選擇的檢測(cè)波長(zhǎng)為325 nm。

2.2 萃取方法的選擇

分別采用微波輔助萃取法和超聲萃取法萃取樣品中的目標(biāo)物。其中:進(jìn)行超聲萃取時(shí),先準(zhǔn)確取1.00 g涼茶顆粒樣品,加入適量甲醇,渦旋溶解1 min,超聲萃取30 min,用甲醇定容到25 mL,搖勻,過0.22 μm濾膜,濾液按照色譜條件測(cè)定。在10個(gè)實(shí)際樣品中,羅浮山黑娃涼茶和金銀花固體飲料中均未檢出各目標(biāo)物,其他樣品中目標(biāo)物的檢出情況見表2。

表2 實(shí)際樣品中7種目標(biāo)物的測(cè)定值

由表2可知,微波輔助萃取法及超聲萃取法測(cè)得的涼茶顆粒中7種目標(biāo)物種類一致,微波輔助萃取法所得各目標(biāo)物的含量整體高于超聲萃取法的,說明微波輔助萃取法在涼茶顆粒的多指標(biāo)成分質(zhì)量評(píng)價(jià)中應(yīng)用較優(yōu)。因此,試驗(yàn)選擇的萃取方法為微波輔助萃取法。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 萃取溶劑的選擇

試驗(yàn)考察了萃取溶劑甲醇溶液的體積分?jǐn)?shù)分別為10%, 30%, 50%, 70%, 90%, 100%時(shí)對(duì)夏桑菊顆粒樣品中7種目標(biāo)物總峰面積的影響,結(jié)果見圖2。

圖2 甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)對(duì)7種目標(biāo)物總峰面積的影響Fig.2 Effect of volume fraction of methanol solution onthe total peak area of 7 targets

由圖2可知:當(dāng)甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)從10%增至70%時(shí),7種目標(biāo)物的總峰面積逐漸增大,甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)總峰面積較大;甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加,7種目標(biāo)物的總峰面積減小。綜合考慮,試驗(yàn)選擇甲醇溶液體積分?jǐn)?shù) 50%, 70%, 90%進(jìn)行響應(yīng)面法試驗(yàn)。

2.3.2 萃取時(shí)間的選擇

試驗(yàn)考察了萃取時(shí)間分別為1, 2, 3, 4, 5 min時(shí)對(duì)夏桑菊顆粒樣品中7種目標(biāo)物總峰面積的影響,結(jié)果見圖3。

圖3 萃取時(shí)間對(duì)7種目標(biāo)物總峰面積的影響Fig.3 Effect of extraction time on the total peak area of 7 targets

由圖3可知:萃取時(shí)間從1 min延長(zhǎng)至2 min時(shí),7種目標(biāo)物總峰面積明顯增大,2 min時(shí)總峰面積最大;萃取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng),總峰面積基本保持不變。綜合考慮節(jié)約能源及萃取效率等因素,試驗(yàn)選擇 1, 2, 3 min進(jìn)行響應(yīng)面法試驗(yàn)。

2.3.3 萃取溫度的選擇

試驗(yàn)考察了萃取溫度分別為40, 50, 60, 70, 80 ℃時(shí)對(duì)夏桑菊顆粒樣品中7種目標(biāo)物總峰面積的影響,結(jié)果見圖4。

圖4 萃取溫度對(duì)7種目標(biāo)物總峰面積的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the total peak area of 7 targets

由圖4可知:隨著萃取溫度的升高,7種目標(biāo)物的總峰面積呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì);當(dāng)萃取溫度為70 ℃時(shí)總峰面積最大。推測(cè):隨著萃取溫度的升高,分子熱運(yùn)動(dòng)增強(qiáng),樣品與萃取溶劑的接觸概率增加,但是過高的萃取溫度會(huì)促進(jìn)目標(biāo)物氧化,導(dǎo)致總峰面積減小。綜合考慮萃取效率等因素,試驗(yàn)選擇萃取溫度 60,70,80 ℃進(jìn)行響應(yīng)面法試驗(yàn)。

2.3.4 料液比的選擇

試驗(yàn)考察了料液比[樣品用量(g)…萃取溶劑體積(mL)]分別為1…5, 1…10, 1…15, 1…20, 1…30時(shí)對(duì)夏桑菊顆粒樣品中7種目標(biāo)物總峰面積的影響,結(jié)果見圖5。

圖5 料液比對(duì)7種目標(biāo)物總峰面積的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on the total peak area of 7 targets

由圖5可知:當(dāng)料液比為1…5～1…30時(shí),7種目標(biāo)物的總峰面積隨著料液比的減小而增大,當(dāng)液料比為1…20時(shí)總峰面積較大。因此,試驗(yàn)選擇 1…10, 1…20, 1…30進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.4.1 回歸模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì),以7種目標(biāo)物的總含量為響應(yīng)值,2.3節(jié)優(yōu)化所得的結(jié)果進(jìn)行四因素三水平試驗(yàn),響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表3。其中:四因素分別為萃取溶劑甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)(A)、萃取時(shí)間(B)、萃取溫度(C)、料液比(D),共進(jìn)行29組試驗(yàn);對(duì)中心點(diǎn)“0”水平重復(fù)試驗(yàn)5次,以計(jì)算回歸模型誤差。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

使用Design-Expert 13.0軟件對(duì)表4數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,所得回歸模型為二次多項(xiàng)回歸方程[公式(1)]。

Y=42.54-1.49A+0.433 1B+1.160C+

0.413 0D-3.210AB+2.070AC-

5.280AD+0.692 5BC-2.860BD-

2.100CD-7.680A2-5.690B2-

2.460C2-3.680D2

(1)

所得回歸模型的顯著性檢驗(yàn)及方差分析結(jié)果見表5。其中:“*”表示P<0.05,差異顯著;“**”表示P<0.01,差異極顯著。

表5 回歸模型的顯著性檢驗(yàn)及方差分析結(jié)果

由表5可知:所建回歸模型的P值為0.0148,小于0.05,表明所建回歸模型對(duì)所有變量的分析具有顯著意義,響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠;回歸模型的失擬項(xiàng)P值為0.383 9,大于0.05,說明該回歸模型擬合較好;A2,B2對(duì)7種目標(biāo)物總含量的影響極顯著,AD,D2的影響顯著;以F值評(píng)價(jià)各因素對(duì)涼茶顆粒中7種目標(biāo)物總含量的影響,影響由大到小分別為A,C,B,D,交互因素由大到小分別為AD,AB,BD,AC,CD,BC。

2.4.2 各因素交互作用的響應(yīng)面分析

以響應(yīng)面和等高線(響應(yīng)曲面的投影)形狀來判斷兩因素的交互程度[28],結(jié)果見圖6。

圖6 因素交互作用對(duì)7種目標(biāo)物總含量影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface diagrams of the effect of factor interaction on total content of 7 targets

由圖6可知:各因素的交互作用的等高線中,AD、AB的等高線偏橢圓形,AD的更顯著;AD的響應(yīng)面較其他響應(yīng)曲更陡峭,AB次之。以上結(jié)果說明,AD、AB的交互作用較強(qiáng),這與方差分析結(jié)果一致。

2.4.3 最優(yōu)萃取條件的預(yù)測(cè)和試驗(yàn)驗(yàn)證

采用 Design-Expert 13軟件優(yōu)化回歸模型,所得最優(yōu)萃取條件為甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)71.06%, 萃取時(shí)間1.874 min, 萃取溫度79.672 ℃, 料液比 1…16.443,該條件下7種目標(biāo)物的總測(cè)定值為41.10 mg·kg-1。綜合考慮實(shí)際情況和可操作性,將7種目標(biāo)物的最優(yōu)萃取條件設(shè)定為甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)70%, 萃取時(shí)間2.0 min, 萃取溫度80 ℃,料液比 1…20,在該條件下進(jìn)行5次平行試驗(yàn),得到7種目標(biāo)物的總測(cè)定值為32.98 mg·kg-1,是預(yù)測(cè)值的80.3%,進(jìn)一步證明了該模型有一定的可靠性。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測(cè)定下限

按照儀器工作條件測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以7種目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,7種目標(biāo)物的質(zhì)量濃度均在0.01～4.0 mg·L-1內(nèi)和峰面積呈線性關(guān)系,其他線性參數(shù)見表6。

表6 線性參數(shù)、檢出限和測(cè)定下限

分別以3, 10倍信噪比(S/N)計(jì)算檢出限(3S/N)和測(cè)定下限(10S/N),結(jié)果見表6。

2.5.2 精密度和回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對(duì)空白樣品(谷芽配方顆粒)進(jìn)行低、中、高等3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)濃度水平進(jìn)行6次平行測(cè)定,計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表7。

表7 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

由表7可知,7種目標(biāo)物的回收率為97.5%～105%,測(cè)定值的RSD為1.4%～6.9%,說明本方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

本工作以涼茶顆粒為研究對(duì)象,以微波輔助萃取-HPLC測(cè)定涼茶顆粒中7種綠原酸及其類似物的含量,方法快速、可靠、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便,且溶劑用量少,可為中成藥中綠原酸質(zhì)量監(jiān)控提供參考方法。