復(fù)方野菊花眼貼對(duì)藍(lán)光誘導(dǎo)小鼠瞼板腺功能異常的防治作用及其機(jī)制

李勇 黃彩虹 李清堅(jiān) 王玉倩 呂雨霏 張兆強(qiáng) 胡皎月 劉祖國(guó)

1南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院眼科,衡陽(yáng) 421000;2廈門(mén)大學(xué)附屬?gòu)B門(mén)眼科中心 福建省眼科與視覺(jué)科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建省眼再生醫(yī)學(xué)工程研究中心 廈門(mén)大學(xué)眼科研究所 廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院,廈門(mén) 361102;3南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科,衡陽(yáng) 421000

瞼板腺是位于上眼瞼和下眼瞼的一種特殊皮脂腺,在瞼板中呈上下垂直排列[1]。瞼板腺通過(guò)分泌特定的脂質(zhì)來(lái)維持眼表淚膜的穩(wěn)態(tài),脂質(zhì)的主要功能是潤(rùn)滑眼表以防止眼表水分揮發(fā),并保護(hù)眼表免受外來(lái)病原體的威脅[2-4]。瞼板腺功能障礙(meibomian gland dysfunction,MGD)以慢性炎癥反應(yīng)為中心環(huán)節(jié),是一種以瞼板腺終末導(dǎo)管萎縮和/或瞼酯分泌的量或質(zhì)發(fā)生異常為主要特征的慢性、彌漫性瞼板腺病變,可導(dǎo)致淚膜穩(wěn)定性改變,產(chǎn)生眼表炎癥和刺激癥狀[5],是導(dǎo)致干眼的主要原因。MGD的全球患病率為3.5%～70.0%[6],目前其治療方式主要分為物理治療、藥物治療和手術(shù)[7],但既往方法普遍存在治療成本高、操作難度較大、治療周期長(zhǎng)、效果較差、對(duì)患者傷害較大、不能完全滿足患者的需求等問(wèn)題。有研究表明,復(fù)方野菊花眼貼在干眼治療中獲得了較好的臨床效果[8],其是否對(duì)干眼主要致病因素之一的MGD也具有防治作用尚不清楚。本研究擬觀察復(fù)方野菊花眼貼對(duì)藍(lán)光引起的瞼板腺功能異常的防治作用,探討復(fù)方野菊花眼貼改善瞼板腺功能異常的效果及可能的機(jī)制,為未來(lái)開(kāi)發(fā)預(yù)防和治療MGD相關(guān)藥物提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 15周齡成年雄性SPF級(jí)C57BL/6J小鼠64只,購(gòu)自上海SLAC實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào):SYXK(閩)∶2018-0009]。本研究嚴(yán)格遵循視覺(jué)與眼科研究協(xié)會(huì)(ARVO)關(guān)于動(dòng)物用于眼科和視覺(jué)研究的聲明,并經(jīng)廈門(mén)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批文號(hào):XMULAC20220258)。小鼠可自由飲食和飲水,在(25±1)℃、相對(duì)濕度(60±10)%和交替12 h明暗循環(huán)(8:00～20:00)的標(biāo)準(zhǔn)無(wú)病原體環(huán)境中飼養(yǎng)。預(yù)防實(shí)驗(yàn)和治療實(shí)驗(yàn)中各32只小鼠分別按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常組、藍(lán)光組、溶劑組和眼貼組,每組8只。

1.1.2主要試劑及儀器 兔抗小鼠核因子(nuclear factor,NF)-κB抗體(4764S)、兔抗小鼠磷酸化NF-κB(phosphorylation of NF-κB,p-NF-κB)抗體(3039S)(美國(guó)Cell Signaling Technology公司);山羊抗兔二抗(ab6721)、兔抗小鼠β-actin抗體(ab227387)(美國(guó)Abcam公司);蘇木精-伊紅染色試劑盒(C0105S-2)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);改良油紅O染色液(BL987A)(安徽Biosharp公司)。SLM-7E型裂隙燈顯微鏡(山東康華科技有限公司);CX23光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司);M165FC正置熒光顯微鏡、CM1850冰凍切片機(jī)、EG1160石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司);ZK-10-VISU-150手術(shù)顯微鏡(德國(guó)蔡司公司)。

1.2 方法

1.2.1眼貼的制備 通過(guò)全封閉動(dòng)態(tài)回流多功能提取罐控溫萃取甄選的多味中藥材,確保提取的無(wú)污染、高濃度和充分性;過(guò)濾、靜置沉淀后將上清液經(jīng)60～70 ℃真空濃縮、16 300 r/min離心30 min并用超速離心管分離上清,形成提取濃縮液;將提取濃縮液置于冷庫(kù)中靜置沉淀,制劑后進(jìn)行灌裝,最終制成眼貼。

1.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組處理

1.2.2.1瞼板腺功能異常動(dòng)物模型 將小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分成正常組32只和藍(lán)光組32只。正常組和藍(lán)光組各32只小鼠再分別按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為0 d組、7 d組、15 d組和30 d組,每組8只。正常組和藍(lán)光組均置于標(biāo)準(zhǔn)無(wú)病原體環(huán)境中飼養(yǎng),藍(lán)光組組小鼠采用波長(zhǎng)460 nm、光照度2 000 lx的藍(lán)光,每天暴露6 h,分別在藍(lán)光暴露0、7、15和30 d時(shí)進(jìn)行瞼板腺開(kāi)口拍照、離體瞼板腺拍照,觀察小鼠瞼板腺組織學(xué)變化。

1.2.2.2預(yù)防實(shí)驗(yàn)部分 正常組小鼠置于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng),其余各組在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境的基礎(chǔ)上進(jìn)行藍(lán)光暴露(波長(zhǎng)為460 nm,光照度為2 000 lx),每天6 h(8:00～14:00),連續(xù)暴露15 d建立小鼠瞼板腺功能異常模型;溶劑組和眼貼組在藍(lán)光暴露的15 d中每天進(jìn)行2次相對(duì)應(yīng)的眼貼敷貼預(yù)防治療(7:00、15:00),每次25 min。在第15天對(duì)各組小鼠行瞼板腺開(kāi)口拍照,觀察小鼠瞼板腺功能情況,并采用頸椎脫臼法處死小鼠,取小鼠瞼板腺進(jìn)行瞼板腺拍照、油紅O染色、蘇木精-伊紅染色、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.3治療實(shí)驗(yàn)部分 正常組小鼠置于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng),其余各組在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境的基礎(chǔ)上進(jìn)行藍(lán)光暴露(波長(zhǎng)為460 nm,光照度為2 000 lx),每天6 h(8:00～14:00),持續(xù)15 d。藍(lán)光組在藍(lán)光暴露結(jié)束后不作任何處理,溶劑組和眼貼組在藍(lán)光暴露結(jié)束后,每天進(jìn)行2次相對(duì)應(yīng)的雙眼眼貼敷貼治療(7:00、15:00),每次25 min,持續(xù)15 d。在第15天對(duì)各組行瞼板腺開(kāi)口拍照,觀察小鼠眼表及瞼板腺功能,并采用頸椎脫臼法處死小鼠,取小鼠瞼板腺進(jìn)行瞼板腺拍照、油紅O染色、蘇木精-伊紅染色、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.2.3小鼠瞼板腺形態(tài)檢查

1.2.3.1瞼板腺開(kāi)口拍照 操作者用右手將小鼠固定好,左手調(diào)整裂隙燈顯微鏡,保持燈光與小鼠垂直,盡可能保證小鼠瞼緣不反光;另一操作者將裂隙燈顯微鏡焦距調(diào)好同時(shí)確定拍攝倍數(shù),至屏幕顯示出清晰圖像即可。

1.2.3.2離體瞼板腺拍照 采用頸椎脫臼法處死各組小鼠,迅速取下小鼠上下眼瞼,去除多余組織后充分暴露小鼠瞼板腺,置于正置顯微下觀察并拍照。采用ImageJ軟件(美國(guó)National Institute of Health公司)計(jì)算瞼板腺剩余面積。瞼板腺相對(duì)剩余面積=瞼板腺剩余面積/瞼板腺面積。

1.2.4小鼠瞼板腺組織病理學(xué)檢查

1.2.4.1蘇木精-伊紅染色觀察小鼠瞼板腺結(jié)構(gòu)和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況 各組任意選取3塊瞼板腺組織,用2塊載玻片將組織輕輕壓平并攤開(kāi),用4%多聚甲醛固定組織30 min,待瞼板腺初步固定后,將瞼板腺輕輕轉(zhuǎn)移至裝有1 ml 4%多聚甲醛的EP管中固定24 h,用雙蒸水沖洗掉多余多聚甲醛,常溫下梯度乙醇脫水(70%、80%、95%、100%、100%、100%乙醇各2 min),后用二甲苯進(jìn)一步脫水(二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各2 min)以及二甲苯透明后浸蠟包埋。采用Leica EG1160石蠟切片機(jī)切片,切片方向?yàn)榇怪庇诓€板腺腺體方向,切片厚度為5 μm,每個(gè)組織制備5個(gè)瞼板腺組織切片,蘇木精-伊紅染色,光學(xué)顯微鏡下選取瞼板腺中央5個(gè)腺體組織,觀察瞼板腺腺體結(jié)構(gòu)改變以及腺體間細(xì)胞增生情況并拍照。采用ImageJ軟件進(jìn)行組織間炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.4.2油紅O染色觀察各組小鼠瞼板腺脂質(zhì)沉積情況 各組任意選取3塊瞼板腺組織,用專用吸水紙吸干多余水分,同時(shí)用2把顯微鑷輕輕夾住組織邊緣并將瞼板腺盡可能展開(kāi),另一人再次用吸水紙吸干多余水分,再平整地將其置于裝有OCT溶液的包埋盒中,待瞼板腺組織中氣泡完全排出后,用鑷子夾取包埋盒緩慢放入液氮中固定。使用冰凍切片機(jī)于平行瞼板腺腺體方向行5 μm厚切片,每塊組織制備5個(gè)瞼板腺組織切片。進(jìn)行油紅O染色,光學(xué)顯微鏡下選取瞼板腺中央5塊腺體組織觀察瞼板腺腺體中脂質(zhì)堆積情況并拍照。采用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)瞼板腺組織中脂質(zhì)沉積情況。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組瞼板腺組織中白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6、腫瘤壞死因子α、γ干擾素 mRNA表達(dá) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將小鼠全部安樂(lè)死,采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選取6只小鼠,將小鼠瞼板腺取出后置于含1 ml Trizol的EP管中,采用Trizol法提取組織RNA,按照說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物由上海生工生物工程有限公司合成,其引物名稱及序列分別為β-actin正向引物:5'-AGATCAAGATCATTGCTCC TCCT-3',反向引物:5'-ACGCAGCTCAGTAACAGTCC-3';白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)正向引物:5'-GCACTACAGGCTCCGAGATGAA-3',反向引物:5'-GTCGTTGCTTGGTTCTCCTTGT-3';IL-6正向引物:5'-CTTGGGACTGATGCTGGTGACA-3',反向引物:5'-GCCTCCGACTTGTGAAGTGGTA-3';腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)正向引物:5'-ACAGC AAGGGACTAGCCAGGAG-3',反向引物:5'-AGTGCCTC TTCTGCCAGTTCCA-3';γ干擾素(interferon-γ,INF-γ)正向引物:5'-CTTCAGCAACAGCAAGGCGAAA-3',反向引物:5'-CCGAATCAGCAGCGACTCCT-3'。進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng),PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性10 s,60 ℃退火和延伸30 s,進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算各目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6Western blot法檢測(cè)瞼板腺組織中NF-κB和p-NF-κB蛋白表達(dá) 采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選取3只小鼠左眼瞼板腺,置于含有0.1 ml RIPA的EP管中,研磨組織收集蛋白,進(jìn)行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜至醋酸纖維素膜中,2% BSA封閉1 h;分別加入NF-κB一抗(1∶1 000)、p-NF-κB一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜,1倍TBST漂洗3次,每次5～10 min,加入羊抗兔IgG二抗(1∶500)孵育1 h,1倍TBST漂洗3次,每次5～10 min,使用Western BrightTMECL和Western BrightTMPeroxide按照1∶1配制顯影液,使用BIO-RAD顯影儀顯影。以β-actin為內(nèi)參,采用ImageJ軟件分別計(jì)算內(nèi)參和目蛋白條帶灰度值。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 正常組與藍(lán)光組小鼠眼瞼板腺形態(tài)變化

2.1.1正常組與藍(lán)光組小鼠瞼板腺開(kāi)口阻塞數(shù)量比較 裂隙燈顯微鏡拍照顯示,藍(lán)光暴露前(0 d),正常組和藍(lán)光組小鼠瞼緣規(guī)整、光滑、無(wú)阻塞現(xiàn)象;7 d時(shí),正常組和藍(lán)光組小鼠瞼緣規(guī)整、光滑,少見(jiàn)瞼板腺開(kāi)口阻塞;15 d時(shí),藍(lán)光組小鼠出現(xiàn)瞼板腺開(kāi)口阻塞和瞼緣光滑程度下降,正常組瞼緣無(wú)明顯變化;30 d時(shí),藍(lán)光組小鼠瞼板腺開(kāi)口明顯阻塞,瞼緣光滑程度明顯下降,正常組瞼緣無(wú)明顯改變(圖1A)。正常組和藍(lán)光組不同時(shí)間點(diǎn)小鼠瞼板腺開(kāi)口阻塞數(shù)量總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F分組=75.92,P<0.001;F時(shí)間=40.32,P<0.001),其中藍(lán)光暴露后15、30 d藍(lán)光組瞼板腺開(kāi)口阻塞數(shù)量明顯多于正常組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表1)。由于本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)關(guān)注早期瞼板腺功能異常,與暴露15 d相比,藍(lán)光暴露30 d瞼板腺功能損傷過(guò)重,故選用藍(lán)光暴露15 d所誘導(dǎo)的瞼板腺功能異常進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 正常組與藍(lán)光組不同時(shí)間點(diǎn)小鼠瞼緣及瞼板腺形態(tài)變化比較 A:裂隙燈顯微鏡下拍照 0 d時(shí),正常組和藍(lán)光組瞼板腺開(kāi)口通暢,瞼緣光滑;7 d時(shí),藍(lán)光組較正常組瞼緣光滑程度降低,但未見(jiàn)明顯瞼板腺開(kāi)口阻塞;15 d時(shí),藍(lán)光組較正常組瞼板腺開(kāi)口出現(xiàn)阻塞,瞼緣光滑程度降低(箭頭);30 d時(shí),藍(lán)光組較正常組瞼板腺開(kāi)口阻塞程度進(jìn)一步加重,瞼緣不規(guī)整(箭頭) B:離體瞼板腺拍照 0 d時(shí),正常組和藍(lán)光組小鼠瞼板腺完整,排列整齊;7 d時(shí),藍(lán)光組較正常組瞼板腺基本完整,未見(jiàn)明顯缺失;15 d時(shí),藍(lán)光組較正常組瞼板腺形態(tài)出現(xiàn)異常,下瞼腺體部分缺失(箭頭);30 d時(shí),藍(lán)光組較正常組瞼板腺損傷明顯,下瞼腺體基本缺失(箭頭)Figure 1 Comparison of morphological changes in mice eyelid margins and meibomian glands at different time points between normal group and blue light group A:Slit lamp microscopy images On day 0,the mice meibomian gland opening was normal and the eyelid margin was smooth in the two groups.On the 7th day,the eyelid margin was less smooth in the blue light group compared to normal group,but no significant obstruction of the opening was seen.On the 15th day,the openings were blocked in the blue light group compared to the normal group,with a decrease in the smoothness of the eyelid margin (arrows).On the 30th day,obstruction of the opening was severer in the blue light group compared to the normal group,and the eyelid margins were irregular (arrows) B:Photographs of meibomian gland in vitro On day 0,the mice meibomian gland was intact and neatly arranged in the two groups.On the 7th day,the mice meibomian gland in the blue light group was generally intact without significant loss compared to normal group.On the 15th day,the mice meibomian gland in the blue light group was abnormal, showing partial absence of the lower meibomian gland (arrows) compared with normal group.On the 30th day,the mice meibomian gland damage was more obvious with whole absence of lower meibomian glands (arrows) in the blue light group than in the normal group

表1 各組小鼠藍(lán)光暴露后不同時(shí)間點(diǎn)瞼板腺開(kāi)口阻塞數(shù)量比較(,個(gè))Table 1 Comparison of the number of obstructed mice meibomian gland openingsat different time points after blue light exposure between two groups (,pcs)

2.1.2正常組與藍(lán)光組小鼠瞼板腺下瞼剩余面積比較 離體瞼板腺拍照顯示,藍(lán)光暴露前(0 d),正常組和藍(lán)光組小鼠瞼板腺完整,排列整齊;7 d時(shí),藍(lán)光組和正常組小鼠瞼板腺基本完整,未見(jiàn)明顯缺失;15 d時(shí),藍(lán)光組小鼠瞼板腺形態(tài)出現(xiàn)異常并伴下瞼腺體部分缺失,正常組瞼板腺結(jié)構(gòu)完整;30 d時(shí),藍(lán)光組小鼠瞼板腺損傷明顯,下瞼腺體基本缺失,正常組瞼板腺腺體形態(tài)完整(圖1B)。正常組和藍(lán)光組不同時(shí)間點(diǎn)小鼠瞼板腺下瞼相對(duì)剩余面積總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F分組=258.30,P<0.001;F時(shí)間=57.47,P<0.001),其中藍(lán)光暴露后15、30 d藍(lán)光組小鼠瞼板腺下瞼相對(duì)剩余面積明顯小于正常組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表2)。

表2 各組小鼠藍(lán)光暴露后不同時(shí)間點(diǎn)瞼板腺下瞼相對(duì)剩余面積比較()Table 2 Comparison of the relative remaining area of lower mice meibomian at different time points after blue light exposure between two groups ()

2.2 預(yù)防實(shí)驗(yàn)中各組小鼠瞼板腺相關(guān)指標(biāo)比較

裂隙燈顯微鏡照相顯示,藍(lán)光照射15 d時(shí),正常組小鼠瞼緣光滑,無(wú)瞼板腺開(kāi)口阻塞;藍(lán)光組和溶劑組小鼠瞼板腺開(kāi)口阻塞明顯,瞼緣增厚,瞼板腺受損;眼貼組小鼠瞼緣形態(tài)接近正常,偶見(jiàn)瞼板腺開(kāi)口阻塞(圖2)。各組瞼板腺開(kāi)口阻塞數(shù)量總體比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=20.12,P<0.05),其中眼貼組瞼板腺開(kāi)口阻塞數(shù)量少于溶劑組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

表3 預(yù)防實(shí)驗(yàn)各組小鼠瞼板腺開(kāi)口阻塞數(shù)量比較(,個(gè))Table 3 Comparison of the number of blocked meibomian gland openings among different groups in the prevention test (,pcs)

圖2 預(yù)防實(shí)驗(yàn)中15 d時(shí)各組小鼠瞼板腺形態(tài)比較 裂隙燈顯微鏡下拍照可見(jiàn),正常組小鼠瞼板腺開(kāi)口未見(jiàn)栓塞,瞼緣光滑;藍(lán)光組和溶劑組可見(jiàn)乳白色栓塞(箭頭),瞼緣不規(guī)則;眼貼組偶見(jiàn)瞼板腺開(kāi)口阻塞(箭頭)(紅框內(nèi)為小鼠瞼緣中央瞼板腺開(kāi)口所指)。離體瞼板腺拍照可見(jiàn),正常組小鼠瞼板腺排列整齊,瞼板腺完整;藍(lán)光組和溶劑組瞼板腺形態(tài)不規(guī)則,下瞼板腺腺體缺失(箭頭);眼貼組瞼板腺腺體基本完整,未見(jiàn)明顯缺失Figure 2 Changes in mice meibomian gland tissue in different groups on day 15 in the prevention test In slit lamp microscopy images,no significant obstruction of the openings was observed and the eyelid margin was smooth in normal group.In blue light and solvent groups,creamy obstructed openings (arrows) and irregular eyelid margins were seen.In eye pad group,few obstruction of the openings (arrows) were visible (Within the red frames were meibomian gland openings at the central mice eyelid margins).In photographs of meibomian gland in vitro,well-aligned and intact meibomian glands were seen.In blue light and solvent groups,irregular meibomian gland and absence of lower meibomian glands (arrows) were observed in normal group.In eye pad group,meibomian glands were intact and not missing

離體瞼板腺拍照顯示,藍(lán)光照射15 d時(shí),正常組小鼠瞼板腺腺體結(jié)構(gòu)完整;藍(lán)光組和溶劑組瞼板腺受損,瞼腺體部分缺失;眼貼組瞼板腺腺體結(jié)構(gòu)基本完整,未觀察到明顯缺失(圖2)。各組瞼板腺下瞼相對(duì)剩余面積總體比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=31.24,P<0.05),其中眼貼組瞼板腺下瞼相對(duì)剩余面積明顯大于溶劑組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表4)。

表4 預(yù)防實(shí)驗(yàn)各組小鼠瞼板腺下瞼相對(duì)剩余面積比較()Table 4 Comparison of the relative remaining area of lower mice meibomian gland among different groups in the prevention test ()

2.3 預(yù)防實(shí)驗(yàn)中各組小鼠瞼板腺組織病理學(xué)表現(xiàn)

蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示,正常組瞼板腺腺體完整,結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞排列緊密,腺體間無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);藍(lán)光組瞼板腺腺體排列紊亂,腺體形態(tài)異常,呈現(xiàn)腺體萎縮的趨勢(shì),間充質(zhì)細(xì)胞過(guò)度增加,腺體間出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);溶劑組瞼板腺腺體形態(tài)基本完整,瞼板腺腺體間充質(zhì)細(xì)胞過(guò)度增生,伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn);眼貼組瞼板腺腺體基本完整,形態(tài)規(guī)則,組織增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度較溶劑組降低,呈現(xiàn)好轉(zhuǎn)趨勢(shì)。油紅O染色結(jié)果顯示,正常組、藍(lán)光組、溶劑組、眼貼組瞼板腺腺體、導(dǎo)管內(nèi)無(wú)大量脂質(zhì)沉積,形態(tài)結(jié)構(gòu)正常(圖3)。

圖3 預(yù)防實(shí)驗(yàn)中15 d時(shí)各組小鼠瞼板腺組織病理學(xué)表現(xiàn) 蘇木精-伊紅染色可見(jiàn),正常組瞼板腺腺體形態(tài)完整,細(xì)胞排列緊密,邊界清晰,腺體間無(wú)組織增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn);藍(lán)光組腺體排列異常,邊界不清,腺體間出現(xiàn)組織增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(箭頭);溶劑組腺體形態(tài)基本正常,瞼板腺腺體間組織增生并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(箭頭);眼貼組瞼板腺腺體間組織增生減少,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度降低(×200,標(biāo)尺=50 μm)。油紅O染色可見(jiàn),正常組、藍(lán)光組、溶劑組和眼貼組瞼板腺腺體及導(dǎo)管內(nèi)均無(wú)明顯脂質(zhì)沉積(×100,標(biāo)尺=50 μm)Figure 3 Histopathological manifestations of mice meibomian gland in different groups on day 15 in the prevention test By hematoxylin-eosin staining,intact meibomian gland in morphology with tightly arranged cells and clear borders were observed in normal group,and no tissue hyperplasia or inflammatory cell infiltration was seen between glands.In the blue light group,abnormally arranged meibomian glands with unclear borders,tissue hyperplasia and inflammatory cell infiltration between glands (arrows).In the solvent group,basically normal gland with inter-gland tissue hyperplasia and inflammatory cell infiltration (arrows) were seen.Reduced inter-gland tissue hyperplasia and inflammatory cell infiltration were seen in the eye pad group (×200,scale bar=50 μm).By oil red O staining,no significant lipid deposition was seen in the meibomian glands and ducts in the four groups (×100,scale bar=50 μm)

2.4 預(yù)防實(shí)驗(yàn)中各組小鼠瞼板腺組織中炎性因子相對(duì)表達(dá)量比較

正常組、藍(lán)光組、溶劑組和眼貼組IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量總體比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=50.56、26.97、66.81、23.71,均P<0.001),其中眼貼組IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量較藍(lán)光組和溶劑組明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表5)。

表5 預(yù)防實(shí)驗(yàn)各組小鼠瞼板腺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量比較()Table 5 Comparison of relative expressions of IL-1β,IL-6,TNF-α and IFN-γ mRNA in mice meibomian gland tissue among different groups in the prevention test ()

2.5 預(yù)防實(shí)驗(yàn)中各組小鼠瞼板腺組織中NF-κB和p-NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,藍(lán)光組瞼板腺組織中NF-κB和p-NF-κB蛋白灰度強(qiáng)于正常組,眼貼組NF-κB和p-NF-κB蛋白灰度弱于溶劑組(圖4)。正常組、藍(lán)光組、溶劑組和眼貼組瞼板腺組織中NF-κB和p-NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量總體比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=37.85、57.64,均P<0.001),其中眼貼組NF-κB和p-NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于溶劑組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表6)。

表6 預(yù)防實(shí)驗(yàn)各組小鼠瞼板腺組織中NF-κB和p-NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量比較()Table 6 Comparison of the relative expression of NF-κB and p-NF-κB proteins in mice meibomian gland tissue among different groups in the prevention test ()

圖4 預(yù)防實(shí)驗(yàn)各組瞼板腺組織中NF-κB和p-NF-κB蛋白表達(dá)電泳圖 藍(lán)光組NF-κB和p-NF-κB蛋白灰度強(qiáng)于正常組,眼貼組NF-κB和p-NF-κB蛋白灰度弱于溶劑組 1:正常組;2:藍(lán)光組;3:溶劑組;4:眼貼組 NF-κB:核因子κB;p-NF-κB:磷酸化核因子κB;β-actin:β-肌動(dòng)蛋白Figure 4 Electrophoretogram of NF-κB and p-NF-κB protein expression in mice meibomian gland tissue in different groups in the prevention test Grayscale intensities of NF-κB and p-NF-κB proteins were stronger in the blue light group than in the normal group,weaker in the eye pad group than in the solvent group 1:normal group;2:blue light group;3:solvent group;4:eye pad group NF-κB:nuclear factor-κB;p-NF-κB:phosphorylation of nuclear factor-κB

2.6 治療實(shí)驗(yàn)各組小鼠瞼板腺相關(guān)指標(biāo)比較

裂隙燈顯微鏡照相顯示,藍(lán)光照射15 d時(shí),正常組小鼠瞼緣光滑,無(wú)瞼板腺開(kāi)口阻塞;藍(lán)光組、溶劑組和眼貼組小鼠瞼板腺開(kāi)口阻塞明顯,瞼緣增厚,瞼板腺受損(圖5)。各組瞼板腺開(kāi)口阻塞數(shù)量總體比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=28.34,P<0.05),其中藍(lán)光組和眼貼組瞼板腺開(kāi)口阻塞數(shù)量明顯多于正常組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表7)。

表7 治療實(shí)驗(yàn)各組小鼠瞼板腺開(kāi)口阻塞數(shù)量比較(,個(gè))

離體瞼板腺拍照顯示,藍(lán)光照射15 d時(shí),正常組小鼠瞼板腺腺體結(jié)構(gòu)完整,藍(lán)光組、溶劑組和眼貼組瞼板腺受損,下瞼腺體部分缺失(圖5)。各組瞼板腺下瞼相對(duì)剩余面積總體比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=31.27,P<0.05),其中藍(lán)光組和眼貼組瞼板腺下瞼相對(duì)剩余面積明顯小于正常組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表8)。

表8 治療實(shí)驗(yàn)各組小鼠瞼板腺下瞼相對(duì)剩余面積比較()

2.7 治療實(shí)驗(yàn)各組小鼠瞼板腺組織病理學(xué)表現(xiàn)

蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示,正常組瞼板腺腺體完整,結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞排列緊密,腺體間無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);藍(lán)光組瞼板腺腺體排列紊亂,腺體形態(tài)異常,分界不清,間充質(zhì)細(xì)胞過(guò)度增加,腺體間出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);溶劑組瞼板腺腺體形態(tài)基本完整,瞼板腺腺體間充質(zhì)細(xì)胞過(guò)度增生,伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn);眼貼組瞼板腺腺體基本完整,形態(tài)規(guī)則,組織增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較溶劑組減輕。油紅O染色結(jié)果顯示,正常組、藍(lán)光組、溶劑組和眼貼組瞼板腺腺體及導(dǎo)管內(nèi)均無(wú)大量脂質(zhì)沉積,形態(tài)結(jié)構(gòu)正常(圖6)。

圖6 治療實(shí)驗(yàn)15 d時(shí)各組小鼠瞼板腺組織病理學(xué)表現(xiàn) 蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示,正常組瞼板腺腺體形態(tài)完整,細(xì)胞排列緊密,邊界清晰,腺體間無(wú)組織增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn);藍(lán)光組和溶劑組均表現(xiàn)為腺體排列紊亂(箭頭),邊界不清,腺體形態(tài)異常,腺體間組織增生明顯并出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);眼貼組瞼板腺腺體結(jié)構(gòu)基本完整,形態(tài)規(guī)則,腺體間組織增生減少,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度較溶劑組減輕(×200,標(biāo)尺=50 μm)。油紅O染色結(jié)果顯示,正常組、藍(lán)光組、溶劑組和眼貼組瞼板腺腺體及導(dǎo)管內(nèi)均無(wú)明顯脂質(zhì)沉積,形態(tài)結(jié)構(gòu)正常(×100,標(biāo)尺=50 μm)Figure 6 Histopathological manifestations of mice meibomian gland in different groups on day 15 in the treatment test By hematoxylin-eosin staining,intact meibomian gland in morphology with tightly arranged cells and clear borders were observed in normal group,and no tissue hyperplasia or inflammatory cell infiltration was seen between glands.In blue light and solvent groups,disordered meibomian glands (arrows) with unclear borders and abnormal morphology,obvious tissue hyperplasia and inflammatory cell infiltration between glands.Meibomian glands with intact structure,regular morphology,reduced inter-gland tissue hyperplasia and inflammatory cell infiltration than solvent group were seen in eye pad group (×200,scale bar=50 μm).By oil red O staining,regular morphology and structure without significant lipid deposition was seen in the meibomian glands and ducts in four groups (×100,scale bar=50 μm)

2.8 治療實(shí)驗(yàn)各組小鼠瞼板腺組織中炎性因子相對(duì)表達(dá)量比較

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,正常組、藍(lán)光組、溶劑組和眼貼組瞼板腺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量總體比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=45.04、35.68、39.94、30.13,均P<0.001),其中眼貼組IL-1β、IL-6和IFN-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于藍(lán)光組和溶劑組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);眼貼組TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量與藍(lán)光組和溶劑組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)(表9)。

表9 治療實(shí)驗(yàn)各組小鼠瞼板腺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量比較()Table 9 Comparison of relative expressions of IL-1β,IL-6,TNF-α and IFN-γ mRNA in mice meibomian gland tissue among different groups in the treatment test ()

2.9 治療實(shí)驗(yàn)各組小鼠瞼板腺組織中NF-κB和p-NF-κB蛋白表達(dá)量比較

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,藍(lán)光組瞼板腺組織中NF-κB和p-NF-κB蛋白灰度強(qiáng)于正常組,眼貼組NF-κB和p-NF-κB蛋白灰度弱于溶劑組(圖7)。正常組、藍(lán)光組、溶劑組和眼貼組瞼板腺組織中NF-κB和p-NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量總體比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=43.13,P<0.001;F=21.31,P=0.004),其中眼貼組NF-κB和p-NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于藍(lán)光組和溶劑組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表10)。

表10 治療實(shí)驗(yàn)各組小鼠瞼板腺組織中NF-κB和p-NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量比較()Table 10 Comparison of the relative expression of NF-κB and p-NF-κB proteins in mice meibomian gland tissue among different groups in the treatment test ()

圖7 治療實(shí)驗(yàn)各組瞼板腺組織中NF-κB和p-NF-κB蛋白表達(dá)電泳圖 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,藍(lán)光組NF-κB和p-NF-κB蛋白灰度強(qiáng)于正常組,眼貼組NF-κB和p-NF-κB蛋白灰度弱于溶劑組 1:正常組;2:藍(lán)光組;3:溶劑組;4:眼貼組 NF-κB:核因子κB;p-NF-κB:磷酸化核因子κB;β-actin:β-肌動(dòng)蛋白Figure 7 Electrophoretogram of NF-κB and p-NF-κB protein expressions in mice meibomian gland tissue in different groups in the treatment test Western blot analysis showed that grayscale intensities of NF-κB and p-NF-κB proteins were stronger in blue light group than in normal group.Grayscale intensities of NF-κB and p-NF-κB proteins were weaker in eye pad group than in solvent group 1:normal group;2:blue light group;3:solvent group;4:eye pad group NF-κB:nuclear factor-κB;p-NF-κB:phosphorylation of nuclear factor-κB

3 討論

MGD是眼科常見(jiàn)病,以老年患者居多[6]。目前MGD的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確,但有不少研究證實(shí)慢性炎癥在MGD中起著中心環(huán)節(jié)的作用[9-10]。產(chǎn)生慢性炎癥的誘因包括眼部因素、年齡、免疫系統(tǒng)疾病、用藥因素和環(huán)境因素等。慢性炎癥導(dǎo)致瞼板腺功能異常,瞼板腺開(kāi)口阻塞。瞼板腺開(kāi)口阻塞是MGD出現(xiàn)的標(biāo)志之一,往往同時(shí)伴隨瞼板腺脂質(zhì)堆積、瞼板腺腺體萎縮、瞼緣鱗狀上皮化生等一系列病理改變。因此,如何有效控制慢性炎癥反應(yīng)是預(yù)防和治療MGD的關(guān)鍵。

目前,MGD的主要治療方法包括熱敷、瞼緣清潔、局部用藥和全身用藥等。近年來(lái),中藥眼貼等中藥制劑也被逐漸用于MGD的輔助治療,并取得良好的療效[7,11-12],但其作用機(jī)制仍不明確。有研究表明,中醫(yī)療法對(duì)于慢性炎癥性疾病的治療有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì),在中國(guó)古代醫(yī)學(xué)著作,如《傷寒雜病論》《金匱要略》《溫病條辯》《眼科龍目論》等中均有記載野菊花、丹參、黃柏等藥材有降低體內(nèi)燥熱、虛火等功能。目前大量的研究也表明,野菊花、丹參、黃柏、黃連、薄荷的提取物具有較強(qiáng)的抗炎作用[13-15];丹參酮ⅡA已被證明可通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路和Nrf2信號(hào)通路,減少炎性因子的表達(dá)[13,16-17];黃柏和薄荷是常用的祛火抗炎藥物[18];黃連可抑制環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)和COX-5的生成,從而起到抗炎作用[14,19]。

復(fù)方野菊花眼貼是在傳統(tǒng)眼貼中加入野菊花、丹參、黃柏、黃連、薄荷等祛火抗炎中藥,其主要成分為野菊花和丹參,是按照現(xiàn)代工藝所制成的一種新型中藥眼貼。復(fù)方野菊花眼貼在減輕眼部慢性炎癥中已有不少應(yīng)用,且療效較好[8]。目前,野菊花類眼貼對(duì)MGD治療效果尚不清楚,且既往研究多集中在當(dāng)MGD較為嚴(yán)重時(shí)進(jìn)行治療。因此,本研究通過(guò)預(yù)防實(shí)驗(yàn)和治療實(shí)驗(yàn)探討復(fù)方野菊花眼貼對(duì)MGD的影響及其作用機(jī)制。

本研究中采用高能短波藍(lán)光致小鼠瞼板腺功能異常模型。已有研究表明,藍(lán)光暴露所產(chǎn)生的慢性損失可導(dǎo)致眼部慢性炎癥的產(chǎn)生,從而導(dǎo)致結(jié)膜炎、視網(wǎng)膜病變、白內(nèi)障、神經(jīng)退行性相關(guān)病變等[20-23]。雄性12～15周齡C57BL/6J小鼠在光照度為2 000 lx、波長(zhǎng)460 nm的藍(lán)光作用下,每天暴露6 h,15 d后即可出現(xiàn)瞼板腺開(kāi)口阻塞,瞼酯呈混濁黏稠牙膏狀,下瞼瞼板腺發(fā)生萎縮,與臨床診斷要求相符,證明瞼板腺功能異常模型造模成功。在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),隨著在藍(lán)光中暴露時(shí)間的延長(zhǎng),小鼠瞼板腺的萎縮基本上都是從瞼板腺下瞼開(kāi)始,可能與小鼠瞼板腺形態(tài)有關(guān),即小鼠瞼板腺下瞼普遍小于上瞼,其瞼板腺導(dǎo)管及瞼板腺開(kāi)口普遍更小,更容易發(fā)生阻塞,進(jìn)而引起小鼠瞼板腺腺體萎縮。

在預(yù)防實(shí)驗(yàn)中,眼貼組小鼠瞼板腺開(kāi)口阻塞程度和瞼板腺下瞼剩余面積指標(biāo)優(yōu)于溶劑組;而在治療實(shí)驗(yàn)中,眼貼組的小鼠瞼板腺開(kāi)口阻塞程度和瞼板腺下瞼剩余面積指標(biāo)較溶劑組基本無(wú)變化,提示復(fù)方野菊花眼貼在瞼板腺功能異常早期對(duì)小鼠瞼板腺有一定的保護(hù)作用。在預(yù)防實(shí)驗(yàn)和治療實(shí)驗(yàn)中,瞼板腺油紅O染色發(fā)現(xiàn),藍(lán)光組、溶劑組、眼貼組中均無(wú)大量脂質(zhì)沉積,可能是瞼板腺開(kāi)口阻塞后引起瞼板腺腺泡中大量脂質(zhì)的堆積需要一定時(shí)間,同時(shí)也證明了本實(shí)驗(yàn)所用模型為輕度瞼板腺功能異常模型。本研究中蘇木精-伊紅染色結(jié)果可見(jiàn),預(yù)防實(shí)驗(yàn)和治療實(shí)驗(yàn)的眼貼組瞼板腺腺體完整,結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞排列緊密,腺體間無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),表明復(fù)方野菊花眼貼能夠有效減輕瞼板腺組織的炎癥損傷。本研究中實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,在預(yù)防實(shí)驗(yàn)中眼貼組的IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量較溶劑組均有所降低;在治療實(shí)驗(yàn)中,眼貼組的IL-1β、IL-6、IFN-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量較溶劑組均明顯降低,TNF-α相對(duì)表達(dá)量有降低趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可能是由于治療時(shí)間偏短,炎癥的消退還需一段時(shí)間。有研究表明,MGD是由于NF-κB信號(hào)通路的激活[3],導(dǎo)致慢性炎癥的發(fā)生。NF-κB信號(hào)通路的激活會(huì)引起IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ等炎性因子表達(dá)升高,同時(shí)也有研究表明TNF-α的升高會(huì)激活NF-κB信號(hào)通路[3,24]。本研究結(jié)果顯示,預(yù)防實(shí)驗(yàn)和治療實(shí)驗(yàn)中眼貼組NF-κB和p-NF-κB相對(duì)表達(dá)量均低于溶劑組,說(shuō)明復(fù)方野菊花眼貼能夠改善瞼板腺功能,可能與抑制了NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。然而,究竟是眼貼中哪種具體有效成分發(fā)揮了作用仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究通過(guò)預(yù)防實(shí)驗(yàn)和治療實(shí)驗(yàn)觀察了復(fù)方野菊花眼貼對(duì)早期MGD的作用效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路,降低瞼板腺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ等炎性因子的表達(dá),保護(hù)瞼板腺組織,改善瞼板腺功能。本研究結(jié)果為MGD的藥物干預(yù)研究提供了新的思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明李勇:參與研究設(shè)計(jì)、研究實(shí)施、收集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、起草文章、論文修改;黃彩虹、李清堅(jiān)、王玉倩:實(shí)施研究、收集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù);呂雨霏、張兆強(qiáng)、胡皎月:參與研究選題、分析/解釋數(shù)據(jù)、起草文章;劉祖國(guó):參與研究設(shè)計(jì)、論文內(nèi)容修改和審核、最終定稿