辛潤宣通法治療神經(jīng)病理性疼痛細胞因子的調(diào)控機制

侯媛媛，閆詠梅

（陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000）

神經(jīng)病理性疼痛是由神經(jīng)系統(tǒng)功能性異?；蚱髻|(zhì)性損傷引發(fā)的常見疼痛類型，臨床多表現(xiàn)為慢性疼痛且多合并失眠、抑郁、焦慮等精神障礙，對患者日常生活影響較大[1-2]。目前臨床多通過抗驚厥、阿片類、抗抑郁藥物等對神經(jīng)病理性疼痛進行治療，雖然上述藥物可暫時減輕疼痛，但對神經(jīng)損傷無修復作用，且常引發(fā)神經(jīng)順應性下降、神經(jīng)脫髓鞘等副作用，故臨床應用具有局限性[3]。中醫(yī)在多種疼痛性疾病治療中均有應用，臨床經(jīng)驗較為豐富且鎮(zhèn)痛效果較佳，而旋覆花湯為辛潤宣通法，具有滋潤陰血、宣通脈絡的作用，在背部疼痛、療帶狀皰疹后遺頑固性肋間神經(jīng)痛等多種疼痛性疾病治療中均取得較好治療效果[4]?；诖?，本研究分析了辛潤宣通法對神經(jīng)病理性疼痛細胞因子的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取120只SPF級Wistar大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由江西浩然生物制藥有限公司提供，動物許可證號：SYXK（贛）2019-0007。所有大鼠在相對濕度、室溫分別為50%、23°C的無病原菌籠子中進行5 d適應性喂養(yǎng)，本試驗操作均參照動物試驗倫理要求的相關規(guī)定，且經(jīng)我院倫理委員會批準同意（倫理編號：20210612）。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與建模 大鼠適應性喂養(yǎng)5 d后按照隨機數(shù)字表法分為假手術組、模型組、旋覆花湯高劑量組、中劑量組及低劑量組、普瑞巴林組，每組各20只，假手術組正常喂養(yǎng)，剩余5組參照劉霞等[5]建立神經(jīng)病理性疼痛模型，1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后將坐骨神經(jīng)起始處顯露，腓總神經(jīng)、脛神經(jīng)采用絲線結(jié)扎，將腓腸神經(jīng)保留，以大鼠出現(xiàn)明顯舔足及抬足為建模成功。

1.2.2 藥物制備及給藥 取旋覆花、歸尾、茜草、桃仁、柏子仁各10 kg，加600 L水，煮沸后再煎沸60 min，后對藥物濾液進行過濾、收集，藥渣中再加水500 mL，煮沸后再煎沸60 min，再次收集濾液，將2次收集藥液合并，離心15 min（3 cm離心半徑，3 000 r·min-1轉(zhuǎn)速），后將離心處理濾液在60℃、-0.06MP壓力減壓下壓縮成32.5 L（生藥液濃度為1.54 g·mL-1），保存于4 ℃以下，旋覆花湯高劑量組、中劑量組、低劑量組分別給予10 g·kg-1、5 g·kg-1、2.5 g·kg-1旋覆花湯藥液，于術后1 d進行灌胃，每日1次，共15 d，普瑞巴林組在術后1 d給予15 mg·kg-1普瑞巴林藥液，每日1次，共15 d，假手術組及模型組同量0.9%氯化鈉溶液，每日1次，共15 d。

1.2.3 樣本采集 連續(xù)干預15 d后，麻醉后橫向切開術側(cè)臀股交界處，逐層分離肌肉、筋膜，暴露坐骨神經(jīng)后，取1 cm坐骨神經(jīng)，制成標本，-80 ℃保存。

1.3 指標檢測

1.3.1 病理學觀察 取保存待檢大鼠坐骨神經(jīng)，經(jīng)脫水、石蠟包埋處理后，做HE染色，光鏡下對坐骨神經(jīng)病理形態(tài)變化進行分析。

1.3.2 行為學檢測 于用藥結(jié)束后麻醉處死前對大鼠括自發(fā)性疼痛評分、大鼠機械縮足反射閾值（mechanical withdrawal threshold, MWT）、熱縮足反射潛伏期（thermal withdrawal latency, TWL）水平進行檢測。1）自發(fā)性疼痛評分檢測：將大鼠置于0.45 m×1.2 m×1.2 m的安靜格子中，對其自由活動、跛行程度、后肢使用情況進行觀察，后爪無畸形、運動正常為0分，后爪明顯畸形但運動正常為1分，有垂足現(xiàn)象，運動行為輕度異常為2分，術側(cè)后爪癱瘓，運動行為嚴重異常為3分；2）MWT水平檢測：將大鼠置于透明、安靜的有機玻璃中，溫度為23～25℃，適應30 min后通過Von Frey纖維絲對術側(cè)后肢足底外側(cè)進行刺激，共刺激3次，后對纖維絲刻大小進行記錄，即為MWT；3）TWL水平檢測：通過YLS-6B智能熱板儀對TWL水平進行檢測。

1.3.3 炎性因子、疼痛介質(zhì)水平檢測 取保存待檢大鼠坐骨神經(jīng)，充分碾碎，離心15 min（3 cm離心半徑，3 000 r·min-1轉(zhuǎn)速）對上清液進行提取，保存于-70℃冰箱中，各組大鼠中白細胞介素（interleukin, IL）-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor, TNF-α）、IL-10、β-內(nèi)啡肽（β-end orphin, β-EP）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）、前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2）水平通過酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）法進行檢測。

1.3.4 Toll樣受體4（Toll like Receptor 4, TLR4）、核因子-κB（nuclear factor-κB, NF-κB）mRNA表達量檢測 取保存待檢大鼠坐骨神經(jīng)，TLR4、NFκB mRNA表達量通過實時熒光定量法進行鑒定，提取總RNA，坐骨神經(jīng)中RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA采用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，Primer 5.0軟件設計引物序列后將PCR儀啟動。通過2-△△Ct方法計算出TLR4、NF-κB的mRNA表達量。

1.3.5 TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白相對表達量檢測 坐骨神經(jīng)中的TLR4/NF-κB信號通路中的TLR4、NF-κB蛋白相對表達量通過Western Blot進行檢測，將加入適量（1:10）組織蛋白抽離液加入大鼠坐骨神經(jīng)，充分碾碎，離心15 min（3 cm離心半徑，3 000 r·min-1轉(zhuǎn)速）提取上清液，做BCA蛋白定性檢測，將樣品上樣至8%SDS-PAGE凝膠上，經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，TBST稀釋的羊抗鼠TLR4、NF-κB（1:2 500）一抗在PBS封閉2 h后加入，后孵育過夜（4 ℃），洗膜3次，加入稀釋羊抗鼠二抗（1:10 000），溫室孵育1 h，做TBST洗膜3次，蛋白表達情況定量分析以GAPDH為內(nèi)參照，重復試驗3次。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析處理。計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）描述，多組間比較采用方差齊性檢驗，2組間比較采用重復測量的方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組光鏡下病理切片對照

假手術組神經(jīng)纖維軸索清晰、排列整齊，模型組神經(jīng)纖維間質(zhì)疏松、水腫，排列紊亂，普瑞巴林組、旋覆花湯低劑量組、旋覆花湯中劑量組旋神經(jīng)纖維排序改善，間質(zhì)水腫依舊存在，旋覆花湯高劑量組神經(jīng)纖維排序基本恢復，水腫明顯減輕。見圖1。

圖1 各組光鏡下病理切片對照（HE染色，×400倍）

2.2 各組行為學比較

見表1。

表1 各組行為學比較（±s ，n= 20）

表1 各組行為學比較（±s ，n= 20）

注：與假手術組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與普瑞巴林組比較，▲P＜0.05；與旋覆花湯低劑量組比較，□P＜0.05；與旋覆花湯中劑量組比較，■P＜0.05

組別自發(fā)性疼痛評分/分MWT/sTWL/s假手術組0.00±0.0036.79±4.0213.56±2.02模型組2.21±0.21#21.14±2.89# 6.01±0.72#普瑞巴林組1.72±0.20#△26.21±2.51#△ 9.14±1.03#△旋覆花湯低劑量組1.71±0.21#△26.30±2.52#△ 9.12±1.05#△旋覆花湯中劑量組1.69±0.23#△25.98±2.60#△ 9.20±1.01#△旋覆花湯高劑量組1.30±0.14#△▲□■32.11±3.52#△▲□■11.37±1.59#△▲□■

2.3 各組炎性因子水平比較

見表2。

表2 各組炎性因子水平比較（±s ，n = 20） pg·mL-1

表2 各組炎性因子水平比較（±s ，n = 20） pg·mL-1

注：與假手術組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與普瑞巴林組比較，▲P＜0.05；與旋覆花湯低劑量組比較，□P＜0.05；與旋覆花湯中劑量組比較，■P＜0.05

組別IL-1βTNF-αIL-10假手術組11.36±1.5842.73±5.2620.03±3.56模型組26.37±3.01#80.69±10.34#10.25±1.51#普瑞巴林組20.52±2.56#△60.51±6.14#△14.07±2.01#△旋覆花湯低劑量組20.60±2.58#△59.63±6.20#△13.98±2.10#△旋覆花湯中劑量組20.61±2.61#△60.62±6.38#△14.12±2.03#△旋覆花湯高劑量組15.72±1.69#△▲□■50.27±5.69#△▲□■16.58±3.14#△▲□■

2.4 各組疼痛介質(zhì)水平比較

見表3。

表3 各組疼痛介質(zhì)水平比較（±s ，n = 20） ng·L-1

表3 各組疼痛介質(zhì)水平比較（±s ，n = 20） ng·L-1

注：與假手術組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與普瑞巴林組比較，▲P＜0.05；與旋覆花湯低劑量組比較，□P＜0.05；與旋覆花湯中劑量組比較，■P＜0.05

組別β-EP5-HTPGE2假手術組180.59±20.03102.60±13.65161.59±20.73模型組101.37±12.54#191.37±24.73#254.96±31.80#普瑞巴林組131.72±16.25#△150.43±16.01#△210.72±23.60#△旋覆花湯低劑量組132.80±16.24#△151.37±15.98#△211.80±23.41#△旋覆花湯中劑量組130.68±17.01#△149.37±16.11#△209.73±24.01#△旋覆花湯高劑量組154.83±18.37#△▲□■120.83±15.74#△▲□■180.44±21.03#△▲□■

2.5 各組TLR4、NF-κB mRNA表達量比較

見表4。

表4 各組TLR4、NF-κB mRNA表達量比較（±s ，n= 20）

表4 各組TLR4、NF-κB mRNA表達量比較（±s ，n= 20）

注：與假手術組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與普瑞巴林組比較，▲P＜0.05；與旋覆花湯低劑量組比較，□P＜0.05；與旋覆花湯中劑量組比較，■P＜0.05

組別TLR4NF-κB假手術組1.00±0.011.00±0.01模型組2.56±0.33#2.63±0.37#普瑞巴林組2.01±0.21#△1.98±0.24#△旋覆花湯低劑量組1.99±0.23#△2.00±0.25#△旋覆花湯中劑量組2.03±0.20#△1.99±0.23#△旋覆花湯高劑量組1.42±0.15#△▲□■1.50±0.17#△▲□■

2.6 各組TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白相對表達量比較

見表5。

表5 各組TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白相對表達量比較（±s，n= 20）

表5 各組TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白相對表達量比較（±s，n= 20）

注：與假手術組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與普瑞巴林組比較，▲P＜0.05；與旋覆花湯低劑量組比較，□P＜0.05；與旋覆花湯中劑量組比較，■P＜0.05

組別TLR4NF-κB假手術組1.00±0.011.00±0.01模型組2.23±0.24#2.30±0.36#普瑞巴林組1.80±0.19#△1.89±0.21#△旋覆花湯低劑量組1.82±0.20#△1.90±0.22#△旋覆花湯中劑量組1.79±0.21#△1.91±0.23#△旋覆花湯高劑量組1.32±0.14#△▲□■1.35±0.17#△▲□■

3 討論

中醫(yī)認為神經(jīng)病理性疼痛屬“筋傷”“痹癥”范疇，其核心病機為經(jīng)絡淤阻、氣血不暢[6]。旋覆花湯屬于辛潤宣通法，具有散氣節(jié)、利氣下行、通血脈等作用，其中旋覆花可疏肝通絡、化痰平喘、利尿消腫，歸尾具有調(diào)經(jīng)止痛、補血活血的作用，茜草可祛淤通經(jīng)、涼血活血，桃仁具有抗炎鎮(zhèn)痛、活血化瘀的作用，柏子仁可安心養(yǎng)神，以上諸藥合用可發(fā)揮清熱滌痰、活血化瘀之效[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)病理性疼痛大鼠通過辛潤宣通法干預后炎癥反應減輕，疼痛介質(zhì)水平改善，疼痛癥狀緩解，表明辛潤宣通法可有效減輕神經(jīng)病理性疼痛大鼠疼痛情況，且呈劑量依賴。

神經(jīng)病理性疼痛臨床癥狀以機械疼痛超敏、熱痛覺過敏、穩(wěn)定及明顯自發(fā)性疼痛為主，中樞及外周機制均為神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機制，其中外周機制包括炎癥因子活化、異位放電，中樞機制包括中樞敏化、中樞去抑制等，而炎性因子釋放增多為神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病的主要原因[8]。神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生、發(fā)展期間膠質(zhì)細胞被激活，進而轉(zhuǎn)化為“活化”狀態(tài)，使得神經(jīng)損傷進一步加重，而活化的膠質(zhì)細胞可釋放IL-1β、TNF-α等炎癥因子，其中IL-1β可由活化巨噬細胞以原蛋白形式表達，為疼痛信號傳導的主要因子，可造成初級感覺神經(jīng)元神經(jīng)纖維敏感，進而導致疼痛超敏；TNF-α可結(jié)合星形膠質(zhì)細胞中腫瘤壞死因子受體1，對氨基末端激酶活化起到了促進作用，使得星形膠質(zhì)細胞進一步激活，神經(jīng)病理性疼痛加劇[9]。IL-10則是對TNF-α表達具有抑制作用的抗炎細胞因子，在疼痛發(fā)生、疼痛治療中發(fā)揮著重要作用，可發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[10]。研究[11]發(fā)現(xiàn)，疼痛介質(zhì)分泌情況與神經(jīng)病理性疼痛病情存在密切聯(lián)系，機體組織損傷后炎性因子大量釋放，使得疼痛刺激加劇，進而促進了疼痛介質(zhì)釋放，β-EP是疼痛抑制性遞質(zhì)，其表達水平與痛覺敏感性呈負相關；5-HT、PGE2均為疼痛因子，可降低疼痛閾值。本研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)病理性疼痛大鼠通過辛潤宣通法干預后自發(fā)性疼痛評分、IL-1β、TNF-α水平下降，MWT、TWL、IL-10水平上升，表明辛潤宣通法可減輕神經(jīng)病理性疼痛大鼠炎癥反應，改善機械疼痛超敏、熱痛覺過敏、穩(wěn)定及明顯自發(fā)性疼痛。

TLR4/NF-κB是與神經(jīng)根性疼痛、膝骨關節(jié)炎、骨癌痛、盆腔炎等多種炎性、疼痛性疾病相關的信號通路[12-13]。TLR4是由小膠質(zhì)細胞表達的Toll樣受體家族成員，在先天免疫激活、病原體識別中發(fā)揮著重要作用，為先天免疫激活的關鍵調(diào)節(jié)劑，激活后的TLR4可釋放多種增強神經(jīng)元興奮性的調(diào)節(jié)劑及神經(jīng)遞質(zhì)，進而參與了炎癥反應調(diào)節(jié)、神經(jīng)病理性疼痛加重及維持，而NF-κB可由TLR4激活，激活后的NF-κB可促進炎性細胞因子合成、分泌，且可啟動獲得性免疫應答，最終推動了神經(jīng)病理性疼痛疾病進展[14]。旋覆花湯中的桃仁可抑制炎性反應，進而對TLR4/NF-κB信號通路起到了抑制作用，而茜草對血液循環(huán)具有促進作用，進而阻斷了疼痛神經(jīng)傳導，抑制了致痛因子表達，促進了鎮(zhèn)痛物質(zhì)釋放，本研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)病理性疼痛大鼠通過辛潤宣通法干預后TLR4、NF-κB表達量下降，提示辛潤宣通法可能通過調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路而抑制炎性反應，減輕疼痛。