基于Wnt/β-Catenin信號(hào)通路探討吳門骨密葆方含藥血清促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的效應(yīng)機(jī)制

梁國(guó)強(qiáng)，李宇衛(wèi)，沈曉峰，尤君怡，張國(guó)棟，華永慶

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州 215009；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院骨傷科，江蘇 蘇州 215009；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院康復(fù)科，江蘇 蘇州 215009；4.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 210023）

現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)把骨質(zhì)疏松歸為“骨痿”證的討論范疇。依據(jù)其病位在骨而主要病機(jī)為“髓枯骨痿”，基于中醫(yī)“腎主骨”的理論，骨病專家形成共識(shí)的“補(bǔ)腎壯骨”的治則[1]。中醫(yī)學(xué)強(qiáng)調(diào)的“髓充則骨養(yǎng)”與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能有機(jī)相映[2]。目前，骨病研究者[3]認(rèn)為，在調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化以及骨形成中起著積極的作用的Wnt/β-Catenin信號(hào)通路是骨質(zhì)疏松治療的重要潛在靶點(diǎn)之一。在團(tuán)隊(duì)前期研究表明，臨床有效抗骨質(zhì)疏松癥的吳門骨密葆方抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-Catenin）信號(hào)通路[4]，同時(shí)激活成骨細(xì)胞Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Recombinant Runt Related Transcription Factor 2，RUNX2）mRNA，促進(jìn)骨形成[5]。分泌型蛋白Dickkopf-1（DKK-1）被確認(rèn)為Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制劑，其與Wnt蛋白競(jìng)爭(zhēng)性地直接與Wnt共受體LRP5/6結(jié)合，或者間接與其另外兩類受體Kremen和LRP結(jié)合而形成三聚體，從而抑制Wnt蛋白活性[6]。本研究旨在探討吳門骨密葆方治療骨質(zhì)疏松的分子生物學(xué)機(jī)制與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞

選用6周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠25只，體質(zhì)量280～300 g。制備正常血清及吳門骨密葆方含藥血清，購于昭衍（蘇州）新藥研究中心有限公司，飼養(yǎng)于蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，許可證號(hào)分別為SCXK（蘇）2018-0006和SYXK（蘇）2021-0065。SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞由深圳市豪地華拓生物科技有限公司代購（進(jìn)口貨號(hào)：HTX2393），將此細(xì)胞置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。每24 h更換液1次，待細(xì)胞長(zhǎng)至近鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底時(shí)，應(yīng)用0.25%的胰酶消化，按1:3（接種濃度3×104·mL-1）傳至第3代應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)由蘇州市中醫(yī)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（動(dòng)物倫理批號(hào)：2022052），于2023年1月—2023年6月在南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室和蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

吳門骨密葆方包括生黃芪20 g，補(bǔ)骨脂10 g，蛇床子10 g，何首烏15 g，肉蓯蓉10 g，懷牛膝10 g，莪術(shù)10 g，海螵蛸30 g。藥材購買于蘇州市天靈中藥飲片有限公司，由蘇州市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部供應(yīng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

α-MEM液體培養(yǎng)基、胎牛血清（GIBCO公司）；胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%）、青鏈霉素混合液（100′）（Solarbio公司）；間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（OBM：含10 mM β-甘油磷酸鈉水合物和50 μg·mL-1抗壞血酸）、二甲基亞砜（DMSO）（Sigma公司）；CCK-8細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒（SAB公司）；堿性磷酸酶試劑盒（微板法，南京建成生物工程研究所）；RIPA組織細(xì)胞快速裂解液（北京索萊寶公司）；蛋白預(yù)染Marker（Fermentas公司）；BCA蛋白定量試劑盒（Thermo公司）；NC膜和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（Millipore公司）；Wnt信號(hào)蛋白家族3alpha（Wnt3a）（貨號(hào)：ab219412）、β-actin（貨號(hào)：ab8226）抗體（Abcam公司）；β-Catenin（貨號(hào)：#8480）抗體（美國(guó)CST公司）；糖原合成酶激酶3β（Glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）（貨號(hào)：bs-0023R）、破骨細(xì)胞抑制因子[（osteoclastogenesis inhibitory factor，OCIF; 又稱護(hù)骨素（osteoprotegerin，OPG）]（貨號(hào)：bs-20625R）和核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）（貨號(hào)：bs-20647R）抗體（Bioss公司）；羊抗兔HRP（貨號(hào)：A0208）二抗（碧云天公司）。其他試劑均為市售分析純。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

TDZ4-WS離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；DNM-9602酶標(biāo)儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）；Forma 3111 CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo公司）；CX41正置顯微鏡（OLYMPUS公司）；Mini protean 3 cell電泳儀（BIO-RAD公司）；DHG-9023A恒溫烘箱（上海恒一科學(xué)儀器有限公司）；TE77XP電轉(zhuǎn)儀（HOEFER公司）。

1.5 吳門骨密葆方含藥血清制備

選取25只大鼠隨機(jī)分為正常組（n= 5）和吳門骨密葆方低、高劑量組（n= 10），空白組以灌胃生理鹽水（10 mL·kg-1）；參考文獻(xiàn)將吳門骨密葆方低、高劑量組分別給予低劑量（根據(jù)人與動(dòng)物體表面積換算為：10 g生藥/kg）、高劑量（換算為人正常服用劑量2倍：20 g生藥/kg）吳門骨密葆方湯劑灌胃7 d[7]。最后灌胃給藥后1 h進(jìn)行麻醉，采用腹主動(dòng)脈抽血抽取各組大鼠血液，離心（3 000 r·min-1、30 min）后取上層血清，進(jìn)行滅活（56℃、30 min）后，采用0.22 μm濾膜對(duì)同組混勻血清過濾滅菌，于-20℃冰箱保存以備實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。

1.6 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組

取3代培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，按參考文獻(xiàn)[8]隨機(jī)分為7組。1）A組：正常血清組（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%正常大鼠血清）；2）B組：經(jīng)典誘導(dǎo)組（OBM+10%正常大鼠血清）；3）C組：吳門骨密葆方低計(jì)量組（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%對(duì)應(yīng)血清）；4）D組：吳門骨密葆方高劑量組（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%對(duì)應(yīng)血清）；5）E組：DKK-1抑制劑組（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%正常大鼠血清+0.1 ng·mL-1DKK-1）；6）F組：吳門骨密葆方低劑量+抑制劑組（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%對(duì)應(yīng)血清+0.1 ng·mL-1DKK-1）；7）G組：吳門骨密葆方高劑量+抑制劑組（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%對(duì)應(yīng)血清+0.1 ng·mL-1DKK-1）。干預(yù)7 d，每3 d更換對(duì)應(yīng)液1次，其中DKK-1抑制劑于第3 d加入干預(yù)。

1.7 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

取3代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以每毫升5×103個(gè)的密度接種于含10%FBS、1.0%青霉素和鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基中。將細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)，按以上分組有機(jī)干預(yù)，換用100 μL含10%體積的各組血清的相應(yīng)培養(yǎng)液（n= 5），培養(yǎng)7 d后，加入10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，設(shè)定450 nm波長(zhǎng)，采用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。

1.8 ALP染色及ALP活性檢測(cè)

將3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6孔板，按以上分組進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化，每3 d換液體1次，誘導(dǎo)7 d后，細(xì)胞采用ALP染色試劑盒進(jìn)行染色，倒置顯微鏡下觀察拍照分析。各組細(xì)胞培養(yǎng)液離心（1 500 r·min-1，10 min）收集上清液，嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說明書，每空分別加入基質(zhì)液和緩沖液各50 μL和樣品30 μL，充分混勻、孵育（37℃，15 min）后加入150 μL顯色劑、振搖混勻，設(shè)定450 nm波長(zhǎng)，采用酶標(biāo)儀同步檢測(cè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)孔和空白（雙蒸水）孔、標(biāo)準(zhǔn)孔的吸光度值，得到各組ALP活性原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.9 Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)

取3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以5×105個(gè)/孔接種于6孔板，按以上分組進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化，每3 d換液體1次，誘導(dǎo)7 d，Wnt3α、β-Catenin、GSK3β、OPG、RANKL蛋白表達(dá)差異采用Western blot檢測(cè)。收集在含PMSF的RIPA裂解液中目標(biāo)總蛋白，以BCA法確定蛋白濃度。取30 mg蛋白進(jìn)行SDSPAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉；一抗[Wnt3α（1:1 000）、β-Catenin（1:1 000）、GSK3β（1:500）、OPG（1:1 000）、RANKL（1:500）、β-actin（1:1 500）]孵育過夜，加HRP二抗（1:2 000）孵育60 min，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)和凝膠成像系統(tǒng)掃描，應(yīng)用Image軟件對(duì)結(jié)果圖像進(jìn)行分析，蛋白相對(duì)表達(dá)量=目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參β-actin灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，應(yīng)用 Graphpad prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)分布的情況下的數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較；對(duì)于不符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)，進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 吳門骨密葆方含藥血清對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響

見表1。

表1 吳門骨密葆方含藥血清對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響（±s，n= 5）

表1 吳門骨密葆方含藥血清對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響（±s，n= 5）

注：與A組比較，# P＜0.05；與C組比較，△P＜0.05；與D組比較，▲P＜0.05

組別細(xì)胞增殖（OD值）A組0.515±0.045 B組0.546±0.052#C組0.548±0.049#D組0.541±0.046#E組0.506±0.051 F組0.514±0.046△G組0.523±0.044▲

2.2 吳門骨密葆方含藥血清對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞堿性磷酸酶染色及活性的影響

ALP染色結(jié)果顯示：經(jīng)典誘導(dǎo)組與各劑量吳門骨密葆方含藥血清干預(yù)7 d后，與正常血清組相比，各組ALP染色程度增強(qiáng)，且酶活力以劑量依賴式增強(qiáng)。與抑制劑組比較，加入DKK-1的各含藥血清組ALP染色程度均增強(qiáng)，與同劑量吳門骨密葆方含藥血清組比較，加入DKK-1的各含藥血清組ALP染色程度均減弱。見圖1，見表2。

圖1 吳門骨密葆方含藥血清對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞ALP染色的影響（×400）

表2 吳門骨密葆方含藥血清對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞ALP活性的影響（±s，n= 5）

表2 吳門骨密葆方含藥血清對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞ALP活性的影響（±s，n= 5）

注：與A組比較，# P＜0.05；與B組比較，△P＜0.05；與C組比較，▲P＜0.05；與D組比較，□P＜0.05；與E組比較，■P＜0.05

組別ALP活性（金氏單位/gprot）A組1.421±0.136 B組2.704±0.175#C組1.971±0.112#△D組2.089±0.173△E組1.411±0.121 F組1.468±0.110▲G組1.515±0.176#□■

2.3 吳門骨密葆方含藥血清對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Wnt/β-Catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

見圖2、圖3。

圖2 各組Wnt3α、β-Catenin、GSK3β、OPG和RANKL蛋白條帶圖

圖3 各組Wnt3α、β-Catenin、GSK3β、OPG和RANKL蛋白相對(duì)表達(dá)量（±s，n= 5）

3 討論

補(bǔ)腎中藥具有調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)激素水平和提高機(jī)體免疫功能，以及刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、促進(jìn)成骨分化和成熟的功效，已被充分的現(xiàn)代中藥藥理學(xué)研究[9]證明。本研究的CCK-8結(jié)果顯示，吳門骨密葆方含藥血清具有明顯的促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的能力；同時(shí)ALP染色強(qiáng)度和活性檢測(cè)結(jié)果提示，吳門骨密葆方含藥血清能夠有效促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。

在本研究Western blot 檢測(cè)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin以及OPG/RANKL信號(hào)通路可能在吳門骨密葆方含藥血清促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中發(fā)揮了重要調(diào)控作用。DKK-1作為Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制劑，其可有效抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化，并抑制成骨細(xì)胞分泌OPG，導(dǎo)致OPG水平降低，提高RANKL水平，使RANKL/OPG比例增加，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化[10]。本研究在吳門骨密葆方含藥血清中加入DKK-1干預(yù)后，結(jié)果顯示，吳門骨密葆方含藥血清增殖及成骨分化能力被明顯抑制。從而又進(jìn)一步驗(yàn)證了吳門骨密葆方含藥血清在促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及成骨分化中Wnt/β-catenin、OPG/RANKL信號(hào)通路發(fā)揮重要調(diào)控作用。