氣相色譜法測(cè)定魚肉中指示性多氯聯(lián)苯的不確定度評(píng)定

楊冉冉，左惠君，王忠一，都 蕓，鮑治成，周雁楠，王開宇

（煙臺(tái)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東煙臺(tái) 264000）

多氯聯(lián)苯（Polychlorinated biphenyls，PCBs）分子通式為：C12Hn+mCl10-n-m，其中n，m=0～5，是最具代表性的一類持久性有機(jī)污染物，擁有209 個(gè)同系物和異構(gòu)體[1-3]，已于2001 年被列入聯(lián)合國(guó)環(huán)境規(guī)劃署12 種持久性有機(jī)污染物之列[4-5]。PCBs 具有難降解性、遠(yuǎn)距離遷移性、生物蓄積性、致癌、致畸、致突變等特性，對(duì)人類健康產(chǎn)生極大的危害[6-8]。近年來(lái)，我國(guó)對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物及其制品中關(guān)于多氯聯(lián)苯的限量要求更加嚴(yán)格[9-10]，因此對(duì)檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度提出了更高的要求。不確定度是與測(cè)量結(jié)果聯(lián)系緊密的參數(shù)，是判定測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確度的重要依據(jù)[11-14]。為了檢驗(yàn)結(jié)果具有更高的可信度，對(duì)不確定度的評(píng)定受到各行業(yè)的關(guān)注[15-17]。

目前，有一些評(píng)定多氯聯(lián)苯測(cè)量不確定度的示例[18-21]。但存在以下不足：未能正確識(shí)別出“被測(cè)量”，僅評(píng)定多氯聯(lián)苯中一種成分的測(cè)量不確定度，而不是樣品中7 種多氯聯(lián)苯成分含量之和的不確定度；能識(shí)別出正確的“被測(cè)量”，但未能根據(jù)測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)建立正確的測(cè)量模型，僅分別評(píng)定7 種成分單獨(dú)含量的測(cè)量不確定度，然后將7 種成分的不確定度簡(jiǎn)單合成；未考慮內(nèi)標(biāo)定量方法的特點(diǎn)，未能正確分析內(nèi)標(biāo)法測(cè)量的不確定度分量。

現(xiàn)以魚肉質(zhì)控樣品為例，根據(jù)內(nèi)標(biāo)定量方法的特點(diǎn)，按照J(rèn)JF 1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[22]重新建立多氯聯(lián)苯測(cè)量模型，評(píng)定多氯聯(lián)苯含量（以PCB28、PCB52、PCB101、PCB118、PCB138、PCB153 和PCB180 總和計(jì)）的測(cè)量不確定度。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚肉質(zhì)控樣品（肉泥狀）購(gòu)買于廣州譜恩公司；正己烷、二氯甲烷 農(nóng)殘級(jí)，Honeywell 公司；濃硫酸優(yōu)級(jí)純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；堿性氧化鋁固相萃取柱 深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司；PCBs 混合標(biāo)準(zhǔn)品（10 μg/mL）CATO 公司；PCB198標(biāo)準(zhǔn)品（99 μg/mL）BePure 公司。

氣相色譜儀（配電子捕獲檢測(cè)器及Open LAB CDS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）美國(guó)安捷倫公司；SHAIII/C 型水浴恒溫振蕩器 北京況勝實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；SF-FDL-550 型離心機(jī) 上海菲恰爾分析儀器有限公司；Multi Reax 型多位試管渦旋振蕩器 德國(guó)heidolph 公司；R300 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 步琦實(shí)驗(yàn)室設(shè)備貿(mào)易（上海）有限公司；N-EVAP112（8125）型氮吹儀 美國(guó)Organomation 公司；BSA223S-CW 型電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

依據(jù)方法GB 5009.190-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中指示性多氯聯(lián)苯的測(cè)定》中第二法氣相色譜法[23]。原理為在試樣中加入PCB198 內(nèi)標(biāo)，水浴加熱振蕩提取后，經(jīng)硫酸處理、色譜柱層析凈化后，采用氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)器法測(cè)定。根據(jù)GB 2762-2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》，多氯聯(lián)苯含量以PCB28、PCB52、PCB101、PCB118、PCB138、PCB153 和PCB180 總和計(jì)。

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1.1 多氯聯(lián)苯混合標(biāo)準(zhǔn)中間液 準(zhǔn)確移取1.0 mL多氯聯(lián)苯混合標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL 容量瓶中，正己烷定容至刻度，即得濃度為400 μg/L 的多氯聯(lián)苯混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

1.2.1.2 多氯聯(lián)苯內(nèi)標(biāo)（PCB198）中間液 移取1.0 mL PCB198 標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL 容量瓶中，正己烷定容至刻度，即得濃度為396 μg/L 多氯聯(lián)苯內(nèi)標(biāo)中間液。

1.2.1.3 多氯聯(lián)苯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列 分別準(zhǔn)確移取12.5、50、100、250、500 μL 多氯聯(lián)苯混合標(biāo)準(zhǔn)中間液于氣相進(jìn)樣瓶中，加入100 μL 濃度為396 μg/L的PCB198 內(nèi)標(biāo)中間液，加正己烷補(bǔ)至1 mL，混勻，即得PCBs 濃度分別為5、20、40、100、200 μg/L，內(nèi)標(biāo)濃度為39.6 μg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品處理 準(zhǔn)確稱取5.0 g 試樣，加入100 μL內(nèi)標(biāo)中間液，加入30 mL 二氯甲烷＋正己烷（50+50）溶液振搖，于恒溫水浴振蕩儀中振蕩。離心取上清液，殘?jiān)?×10 mL 的正己烷，振蕩后離心取上清液。合并上清液于茄形瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。將濃縮的提取液轉(zhuǎn)移至10 mL 試管中，用約5 mL 正己烷洗滌茄形瓶3～4 次，洗液并入濃縮液中，正己烷定容至10 mL，并加入1 mL 濃硫酸，振搖1 min，以3000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心5 min，使硫酸層與有機(jī)層分離。重復(fù)操作，直至上層溶液呈無(wú)色。15 mL 正己烷預(yù)淋洗堿性氧化鋁固相萃取柱。將上清液轉(zhuǎn)移至小柱上，當(dāng)液面降至無(wú)水硫酸鈉層時(shí)，加入30 mL 正己烷（3×10 mL）洗脫；當(dāng)液面降至無(wú)水硫酸鈉層時(shí)，用25 mL 二氯甲烷+正己烷（5+95）分三次洗脫。洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干。將上述試樣溶液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中，用少量正己烷洗茄形瓶3～4 次，洗液并入進(jìn)樣瓶中，定容至1 mL，待GC 分析。

1.2.3 多氯聯(lián)苯的上機(jī)測(cè)定 色譜柱：Agilent HP-5（30 m×0.320 mm，0.25 μm）；升溫程序：120 ℃，保持3 min；15 ℃/min 升至160 ℃，保持5 min；2.5 ℃/min 升至220 ℃，保持1 min；20 ℃/min 升至270 ℃，保持5 min；進(jìn)樣量：1 μL；模式：不分流；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；檢測(cè)器溫度：300 ℃；流速：1.5 mL/min。

氣相色譜穩(wěn)定后，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列和樣品溶液進(jìn)樣檢測(cè)，每份溶液進(jìn)樣1 次。保留時(shí)間定性，內(nèi)標(biāo)—標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測(cè)量結(jié)果

樣品溶液目標(biāo)物濃度采用標(biāo)準(zhǔn)曲線—內(nèi)標(biāo)法定量。用安捷倫Open LAB CDS 軟件分析檢測(cè)數(shù)據(jù)，輸入多氯聯(lián)苯系列標(biāo)準(zhǔn)溶液目標(biāo)物濃度及內(nèi)標(biāo)濃度，軟件根據(jù)目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)峰面積檢測(cè)數(shù)據(jù)及輸入的目標(biāo)物濃度和內(nèi)標(biāo)濃度自動(dòng)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線；輸入樣品溶液中內(nèi)標(biāo)濃度，軟件根據(jù)樣品峰面積檢測(cè)數(shù)據(jù)和內(nèi)標(biāo)濃度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線直接計(jì)算出樣品溶液中目標(biāo)物的濃度，目標(biāo)物濃度測(cè)量結(jié)果見表1。根據(jù)式（1）、式（2）計(jì)算各樣品中多氯聯(lián)苯含量，結(jié)果見表1 。

表1 樣品測(cè)量結(jié)果Table 1 Results of sample measurement

式中，cj為樣品溶液中某一種目標(biāo)物濃度，μg/L；V 為樣品處理定容體積，mL；m 為樣品質(zhì)量，g；Xj為樣品中某一種目標(biāo)物含量，μg/kg；XPCBs為樣品中七種多氯聯(lián)苯含量，μg/kg。

2.2 測(cè)量模型和不確定度分析

2.2.1 建立測(cè)量數(shù)據(jù) 式（1）、式（2）并不是多氯聯(lián)苯（以PCB28、PCB52、PCB101、PCB118、PCB138、PCB153 和PCB180 含量之和計(jì)）的測(cè)量模型，不能據(jù)此評(píng)定多氯聯(lián)苯含量的不確定度。

根據(jù)內(nèi)標(biāo)定量法原理，樣品溶液目標(biāo)物濃度：

代入式（2）得：

簡(jiǎn)化得：

式（4）為多氯聯(lián)苯（以PCB28、PCB52、PCB 101、PCB118、PCB138、PCB153、PCB180 含量之和計(jì)）的測(cè)量模型。

式中：ci：樣品溶液中內(nèi)標(biāo)濃度，μg/L；cjR：樣品溶液中目標(biāo)物濃度與內(nèi)標(biāo)濃度比值，無(wú)單位，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線校正；∑cjR：樣品溶液中7 種目標(biāo)物濃度比值之和，無(wú)單位。

2.2.2 測(cè)量不確定度分析 根據(jù)內(nèi)標(biāo)法校正原理，系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品中加入同一份內(nèi)標(biāo)中間液，樣品測(cè)量結(jié)果與樣品定容體積V 無(wú)關(guān)；與內(nèi)標(biāo)中間液濃度無(wú)關(guān)，但與加入樣品中的內(nèi)標(biāo)中間液體積Vi有關(guān)，則不確定度的模型為：

其中，∑cjR做為測(cè)量模型中一個(gè)獨(dú)立的乘積因子，由7 種目標(biāo)物濃度比值的不確定度合成；每種目標(biāo)物濃度比值由目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液不確定度和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合不確定度引入。根據(jù)內(nèi)標(biāo)法校正原理，由標(biāo)準(zhǔn)溶液系列引入的不確定度也與標(biāo)準(zhǔn)溶液定容體積及內(nèi)標(biāo)中間液濃度無(wú)關(guān)，無(wú)須評(píng)定其不確定度，但要評(píng)定加入內(nèi)標(biāo)中間液體積不確定度。按照J(rèn)JF 1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》要求，魚肉中多氯聯(lián)苯測(cè)量不確定度因果圖見圖1。

圖1 多氯聯(lián)苯含量總和測(cè)量不確定度因果圖Fig.1 Causal graph of uncertainty in the measurement of the sum of PCBS

2.3 測(cè)量不確定度評(píng)定

根據(jù)測(cè)量模型式（4）及不確定度模型式（5），需要根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線、樣品溶液峰面積比值計(jì)算出樣品溶液中目標(biāo)物濃度與內(nèi)標(biāo)濃度的比值。樣品溶液中各目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)濃度之比值見表2。根據(jù)式（4）計(jì)算樣品中多氯聯(lián)苯含量，及相關(guān)數(shù)據(jù)平均值，計(jì)算結(jié)果見表2。

表2 樣品測(cè)試液中目標(biāo)物濃度與內(nèi)標(biāo)濃度比值及多氯聯(lián)苯含量計(jì)算結(jié)果Table 2 Ratio of target concentration to internal standard concentration and the calculation of PCBS content in sample test solution

2.3.1 測(cè)量重復(fù)性不確定度 測(cè)量重復(fù)性不確定度是測(cè)量結(jié)果平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用A 類評(píng)定，為A 類標(biāo)準(zhǔn)不確定度[24]。根據(jù)表2，6 次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差：

A 類標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

A 類相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.3.2 樣品質(zhì)量不確定度 樣品質(zhì)量m=4.793 g，使用0.001 g 電子天平。天平檢定合格，檢定證書顯示天平示值誤差E=3 mg，重復(fù)性m重=2 mg 天平分辯率d=1 mg。質(zhì)量稱量?jī)纱?，因質(zhì)量較小，質(zhì)量不確定度僅由天平重復(fù)性引入[25]。根據(jù)JJG 1036-2008《電子天平檢定規(guī)程》[26]，天平重復(fù)性為6 次檢定稱量質(zhì)量的極差，按極差法求得重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差，6 次極差系數(shù)C=2.53，則稱量質(zhì)量m 的不確定度：

相對(duì)不確定度：

2.3.3 樣品中加入內(nèi)標(biāo)使用液體積Vi的不確定度樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入同一份內(nèi)標(biāo)中間液，同一支移液槍吸取相同體積100 μL，內(nèi)標(biāo)中間液體積不確定度由移液槍測(cè)量重復(fù)性引入，與移液槍容量允差無(wú)關(guān)。實(shí)驗(yàn)室溫度在22～23 ℃，溫度較為穩(wěn)定，可忽略溫度波動(dòng)引入的不確定度。查移液槍檢定證書，100 μL 測(cè)量重復(fù)性為0.2%，可直接引用，ur（Vi）=ur（Vsi）=0.2%=0.002。

2.3.4 樣品溶液中7 種目標(biāo)物濃度比值之和 ∑cjR的不確定度 ∑ cjR做為乘積測(cè)量模型（4）、（5）中一個(gè)因子，需要單獨(dú)評(píng)定其相對(duì)不確定度。∑ cjR是樣品溶液中7 種目標(biāo)物濃度與內(nèi)標(biāo)濃度比值的總和；每種目標(biāo)物濃度比值不確定度由目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液不確定度和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合不確定度引入。

2.3.4.1 多氯聯(lián)苯中間液（cS中=400 μg/L）的不確定度 量取1.00 mL 多氯聯(lián)苯儲(chǔ)備液，正己烷定容于25 mL，制得濃度為400 μg/L 的多氯聯(lián)苯混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。不確定度由儲(chǔ)備液、量取體積、定容體積引入。

a.查標(biāo)準(zhǔn)品證書得PCBs 混合標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)擴(kuò)展不確定度為±3%（k=2），相對(duì)不確定度為：

b.吸取多氯聯(lián)苯儲(chǔ)備液體積

1 mL A 級(jí)單標(biāo)吸量管容量允差為±0.007 mL[27]，按三角分布k 為計(jì)算得不確定度為：

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液20 ℃定標(biāo)，溶劑異辛烷膨脹系數(shù)為β=1.14×10-3[2]，實(shí)驗(yàn)室溫度在22～23 ℃，溫度差異以最大值3 ℃計(jì)，按均勻分布假設(shè)，，則溫度引入的不確定度為：

合成得：

c.定容于A 級(jí)25 mL 容量瓶，容量允差為±0.03 mL，按三角分布k 為計(jì)算得相對(duì)不確定度：

d.合成得多氯聯(lián)苯中間液（CS中=400μg/L）的相對(duì)不確定度：

2.3.4.2 多氯聯(lián)苯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列的不確定度多氯聯(lián)苯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列配制由多氯聯(lián)苯標(biāo)準(zhǔn)中間液及吸取體積，內(nèi)標(biāo)中間液及吸取體積以及定容體積決定。不確定度由多氯聯(lián)苯標(biāo)準(zhǔn)中間液濃度及吸取體積、吸取內(nèi)標(biāo)中間液體積引入，與定容體積和內(nèi)標(biāo)中間液濃度無(wú)關(guān)。

a.吸取體積用100 μL/500 μL 移液槍，體積不確定度由允差和溫度引入。查檢定證書，吸取體積12.5 μL 時(shí)容量允差為0.9%，吸取體積50 μL 時(shí)容量允差為0.6%，吸取體積100 μL 時(shí)容量允差為0.3%，吸取體積200 μL 時(shí)容量允差為0.3%，吸取體積500 μL 時(shí)容量允差為±0.2%。按均勻分布處理為容量允差的不確定度：

溫度不確定度，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液系列與配制中間液溫度基本相同，溫度不確定度僅由移液槍體脹系數(shù)[28]引入，代入如下：

b.吸取內(nèi)標(biāo)中間液體積不確定度，同2.3.3。

c.系列標(biāo)液各濃度比值的相對(duì)不確定度：

根據(jù)移液槍檢定證書和使用體積，計(jì)算各吸取體積的不確定度和各濃度比值的相對(duì)不確定度，結(jié)果見表3。

表3 混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的不確定度評(píng)定Table 3 Uncertainty of mixed standard series solution

d.標(biāo)準(zhǔn)溶液系列相對(duì)不確定度以各濃度比值相對(duì)不確定度的均方根表示：

7 種多氯聯(lián)苯目標(biāo)物濃度比值的相對(duì)不確定度相同。

2.3.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度 標(biāo)準(zhǔn)曲線的殘留偏差結(jié)果見表4，計(jì)算方式如下：

表4 標(biāo)準(zhǔn)溶液系列測(cè)量數(shù)據(jù)Table 4 Standard solution series measurement data

曲線擬合引入的不確定度：

式中：SR：標(biāo)準(zhǔn)曲線的殘留偏差；a：標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；P：樣品溶液的測(cè)量次數(shù)，P=1；N：標(biāo)準(zhǔn)溶液總測(cè)量次數(shù)，N=5×1=5；：濃度比值平均值，：各濃度比值與均值差的平方和，

以PCB28 為例：CR28=2.248，代入式（10）得：

根據(jù)樣品溶液中各目標(biāo)物濃度比值評(píng)定其由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度，結(jié)果見表5。

表5 樣品溶液中各目標(biāo)物濃度比值不確定度Table 5 Uncertainty of concentration ratio of each target in sample solution

2.3.5 評(píng)定樣品溶液中7 種目標(biāo)物濃度比值之和∑cjR的不確定度

2.3.5.1 樣品溶液中各目標(biāo)物濃度比值不確定度由標(biāo)準(zhǔn)溶液系列和曲線擬合合成，見表5。其中標(biāo)準(zhǔn)溶液系列引入的不確定度由樣品溶液中各目標(biāo)物濃度比值與標(biāo)準(zhǔn)系列相對(duì)不確定度相乘得到。

2.3.5.2 評(píng)定樣品溶液中7 種目標(biāo)物濃度比值之和的不確定度

相對(duì)不確定度：

2.4 回收率的不確定度

2.5 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

根據(jù)評(píng)定過程可知，測(cè)量重復(fù)性、樣品的稱量質(zhì)量、內(nèi)標(biāo)的加入體積、樣品溶液中各目標(biāo)物濃度比值之和四部分互相獨(dú)立，因此合成相對(duì)不確定如下：

2.6 擴(kuò)展不確定度及報(bào)告

取包含因子k=2，相對(duì)擴(kuò)展不確定度Ur=k×ur=2×0.0147=0.0294≈2.9%魚肉中多氯聯(lián)苯（以PCB28、PCB52、PCB101、PCB118、PCB138、PCB153 和PCB180 總和計(jì)）報(bào)告：149.1（1±2.9%）μg/kg，k=2，式中正負(fù)號(hào)后的數(shù)為相對(duì)擴(kuò)展不確定度Ur的值。

各類相對(duì)不確定度主要分量及貢獻(xiàn)見表6。由表可知，不確定度主要來(lái)源于測(cè)量重復(fù)性和樣品溶液中各目標(biāo)物濃度比值之和。

表6 各類相對(duì)不確定度主要分量及貢獻(xiàn)Table 6 Major components and contributions of various relative uncertainties

3 結(jié)論

內(nèi)標(biāo)法是將一定重量的純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)加到一定量的被分析混合物中，根據(jù)測(cè)試液和內(nèi)標(biāo)的含量比及其相應(yīng)的峰面積面積比來(lái)計(jì)算被測(cè)試組分的含量，可以有效消除由于操作條件影響而產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)誤差[30]，準(zhǔn)確度和精密度均優(yōu)于外標(biāo)法[31]。本評(píng)定示例，根據(jù)內(nèi)標(biāo)法的特點(diǎn)，沒有評(píng)定內(nèi)標(biāo)物的濃度以及加入內(nèi)標(biāo)后的定容體積等引入的不確定度，僅評(píng)定加入內(nèi)標(biāo)體積重復(fù)性的不確定度。建立了氣相色譜標(biāo)準(zhǔn)曲線—內(nèi)標(biāo)法測(cè)定多個(gè)目標(biāo)物之和的不確定度評(píng)定的分析方法，具有科學(xué)合理、易于評(píng)定的特點(diǎn)。通過評(píng)定可知，根據(jù)GB 5009.190-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中指示性多氯聯(lián)苯的測(cè)定》第二法氣相色譜法測(cè)量魚肉樣品中指示性多氯聯(lián)苯的含量，不確定度主要來(lái)源于測(cè)量重復(fù)性和樣品溶液中各目標(biāo)物濃度比值之和，在以后的實(shí)驗(yàn)中，為了得到更加精確、可信的結(jié)果，應(yīng)該根據(jù)需要經(jīng)常維護(hù)保養(yǎng)氣相色譜儀使儀器保持在最佳狀態(tài)，增加平行進(jìn)樣次數(shù)以及在實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范操作。