玫瑰鮮花餅中四種阿維菌素類藥物殘留水平分析及慢性膳食風(fēng)險(xiǎn)評估

黃玉媛，徐 幸 ，段吉燕，張 燕，字杰軍

（1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理 671000；2.大理州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測中心，云南大理 671000）

云南作為中國的旅游大省，一直以來以其優(yōu)美秀麗的自然景色聞名遐邇。同時(shí)云南也有著“亞洲花都”的美譽(yù)[1]，是全國最大的鮮花供應(yīng)地，占據(jù)著全國80%的鮮花市場。玫瑰鮮花餅是云南的一大特色美食，隨著云南旅游業(yè)的飛速發(fā)展，玫瑰鮮花餅成為了云南的一張旅游名片，在全國乃至全世界都有了一定知名度，成為了熱門的走親訪友伴手禮之一。在玫瑰的生長培育過程中，可能會(huì)存在各種病蟲災(zāi)害，以白粉病、黑斑病和霜霉病為主，蟲害以蚜蟲、薊馬和紅蜘蛛為主，這些病蟲災(zāi)害都給玫瑰生長帶來很大影響。為了應(yīng)對病蟲害，保證玫瑰花的產(chǎn)量，花農(nóng)們會(huì)不得不給玫瑰使用一些農(nóng)藥。然而，在種植過程中使用的農(nóng)藥種類多、用藥量大、施藥次數(shù)多等問題可能會(huì)導(dǎo)致食用玫瑰中殘留農(nóng)藥[2-7]，從而使得玫瑰鮮花餅也具有農(nóng)藥殘留產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)。在食用玫瑰的種植過程中，為了對抗病蟲害，有時(shí)會(huì)使用到阿維菌素類藥物來進(jìn)行防治。而阿維菌素的殘留會(huì)對人體神經(jīng)系統(tǒng)及內(nèi)臟等多方面產(chǎn)生損害[8-9]。伊維菌素、乙酰氨基阿維菌素、多拉菌素都是由阿維菌素衍生而來[10-11]。因此，本文主要研究玫瑰鮮花餅中阿維菌素、伊維菌素、乙酰氨基阿維菌素和多拉菌素的農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)評估。

檢索國內(nèi)外文獻(xiàn)和限量標(biāo)準(zhǔn)，目前國家標(biāo)準(zhǔn)、CAC[12]及歐盟[13]中都沒有對食用玫瑰以及玫瑰鮮花餅的農(nóng)藥殘留做出限量要求；關(guān)于食用玫瑰及鮮花餅的相關(guān)農(nóng)藥殘留檢驗(yàn)及慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評估相關(guān)文獻(xiàn)極少。Bian 等[14]對食用玫瑰的種植、加工和浸泡過程進(jìn)行了18 種農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物的分析。說明了食用玫瑰花中具有部分的農(nóng)藥殘留，對人體健康造成一定影響，但是18 種農(nóng)藥并不包括本文研究的四種阿維菌素類藥物，且他們研究的是食用玫瑰作為花茶飲用時(shí)的農(nóng)藥遷移率，并未涉及到玫瑰鮮花餅。檢索國外文獻(xiàn)，并未檢索出有關(guān)于玫瑰鮮花餅的研究，關(guān)于食用玫瑰的相關(guān)文獻(xiàn)也十分有限。以往對于單一品種蔬菜[15-17]、蔬菜類[18-21]、水果[22-24]、稻米[25]和茶葉[26-27]等食品中農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)評估的研究較多，但是關(guān)于玫瑰鮮花餅的農(nóng)藥殘留以及風(fēng)險(xiǎn)評估的研究極少。

為了解玫瑰鮮花餅是否存在慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)，對健康是否造成影響，展開玫瑰鮮花餅中的四種阿維菌素類藥物殘留的風(fēng)險(xiǎn)評估是很有必要的。對玫瑰鮮花餅進(jìn)行農(nóng)藥殘留的風(fēng)險(xiǎn)評估工作，是當(dāng)前保障玫瑰鮮花餅的安全質(zhì)量的主要手段之一。本文擬建立一個(gè)能夠快速檢測玫瑰鮮花餅中農(nóng)藥殘留的實(shí)驗(yàn)方法，通過采用QuEChERS（Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged and Safe）方法結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀對玫瑰鮮花餅樣品進(jìn)行4 種阿維菌素類藥物殘留水平進(jìn)行系統(tǒng)分析[28-29]，從而計(jì)算慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)值（%ADI），對這4 種目標(biāo)化合物進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)排序，為玫瑰鮮花餅中農(nóng)藥殘留限量的制定提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玫瑰鮮花餅樣品 共計(jì)43 種，采購于市售玫瑰鮮花餅；甲醇中4 種阿維菌素類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：阿維菌素、多拉菌素、乙酰氨基阿維菌素、伊維菌素100 mg/L、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）粒徑40～60 μm、十八烷基硅烷（C18）吸附劑 粒徑40～60 μm、0.22 μm 有機(jī)相濾頭 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；甲酸（色譜純）、氯化鈉（分析純）Acros 公司；乙腈 色譜純，德國默克公司。

LC-2030 高效液相色譜儀 日本島津公司；QTRAP 4500 串聯(lián)質(zhì)譜儀 AB SCIEX 公司；8888 0018 型渦旋振蕩器 Thermo 公司；Direct-Q3 超純水機(jī) 密理博公司；AL204 型電子天平 梅特勒托利多公司；TG16-WS 臺式高速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制 用移液槍準(zhǔn)確吸取40 μL的4 種阿維菌素類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（溶劑為甲醇）于玻璃瓶中，然后準(zhǔn)確吸取3.96 mL 乙腈溶液，使其定容到4 mL，配制成1 mg/L 的混標(biāo)溶液，渦旋備用。

1.2.2 樣品前處理 參考GB 23200.121-2021《植物源性食品中331 種農(nóng)藥及其代謝物殘留的測定》方法[28]，稱取2 g 均質(zhì)的鮮花餅樣品于50 mL 離心管中，加入5 mL 純水，加氯化鈉5 g 渦旋振蕩1 min，加入10 mL 乙腈渦旋振蕩1 min，以轉(zhuǎn)速5000 r/min離心5 min，取上清液2 mL 于10 mL 離心管中，添加50 mg 的C18吸附劑，振蕩1 min，以轉(zhuǎn)速5000 r/min離心5 min。將上清液采用0.22 μm 有機(jī)相濾頭過濾，得到待檢測液，供HPLC-MS/MS 測定。

1.2.3 儀器分析條件

1.2.3.1 液相條件 流動(dòng)相：A 為0.1%體積濃度的甲酸水溶液[29]，B 為乙腈。色譜柱：Endeavorsil C18柱（規(guī)格50 mm×2.1 mm，粒徑1.8 μm）。液相色譜洗脫條件見表1；流速：0.30 mL/min，進(jìn)樣量：1 μL；柱溫：40 ℃。

表1 流動(dòng)相洗脫條件Table 1 Elution conditions of flow phase

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 采用ESI 源離子源，噴霧電壓為5500 eV，離子源溫度為110 ℃，脫溶劑氣溫度為400 ℃；多重反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）條件見表2。

表2 多重反應(yīng)監(jiān)測模式下4 種阿維菌素類藥物的保留時(shí)間、監(jiān)測離子對和碰撞能量Table 2 Retention times,monitored ion pairs and collision energy for four avermectins in MRM mode

1.2.4 方法驗(yàn)證

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及定量限、檢出限的測定 用乙腈定容配制好的1 mg/L 的阿維菌素類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別配制成質(zhì)量濃度為1、5、10、20、50、75、100 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)曲線，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，目標(biāo)物的峰面積為縱坐標(biāo)來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別以定量離子3 倍信噪比和10 倍信噪比得到4 種目標(biāo)物的檢出限（LODs）和定量限（LOQs）[30]。同時(shí)，用沒有檢出農(nóng)藥殘留的玫瑰鮮花餅按照1.2.2 樣品前處理的方法進(jìn)行處理，用得到的凈化溶液當(dāng)作溶劑來定容配制好的1 mg/L 的阿維菌素類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，同樣分別配制成質(zhì)量濃度為1、5、10、20、50、75、100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。

1.2.4.2 添加回收實(shí)驗(yàn) 在樣品中加入高、中、低濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)目標(biāo)物在儀器上的響應(yīng)值，添加水平分別為2.5、10、40 μg/kg，每個(gè)水平重復(fù)6次。按照1.2.2 的方法進(jìn)行提取和進(jìn)化，按照1.2.3的方法進(jìn)行分析，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）。

1.2.5 膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評估 膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評估是衡量膳食安全性的重要指標(biāo)，也是食品安全風(fēng)險(xiǎn)評估的重要組成部分[31]。

1.2.5.1 慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評估 慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)（%ADI）為每日攝入量（national estimated daily intakes，NEDI）（μg/kg·bw）除以每日允許攝入量（acceptable daily intake，ADI）（mg/kg）。ADI 參考GB 2763-2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[32]、GB 31650-2019《食品中獸藥最大殘留限量》[33]。當(dāng)%ADI≤100%時(shí)，表示慢性健康風(fēng)險(xiǎn)可以接受；當(dāng)%ADI＞100%時(shí)，表示有不可接受的慢性風(fēng)險(xiǎn)，%ADI 越大，風(fēng)險(xiǎn)越大。

式中：STMR 為玫瑰鮮花餅檢測殘留中值（supervised trials median residue），mg/kg；F 為日消費(fèi)量，g/d；mb為標(biāo)準(zhǔn)人體質(zhì)量（60 kg）。

1.2.5.2 食品安全指數(shù)分析 評估農(nóng)藥殘留攝入的安全風(fēng)險(xiǎn),采用食品安全指數(shù)（index of food safety,IFS）來評估對健康的危害程度[31]。IFS＜1，表示該農(nóng)藥為可接受安全風(fēng)險(xiǎn)，反之則為不可接受風(fēng)險(xiǎn)，計(jì)算公式見式（3）、式（4）。

式中：SIc 是安全攝入量，即ADI；f 是安全攝入量矯正因子，取值1；Ri為殘留平均值，μg/kg；Ei為可使用部分因子；Fi為估計(jì)攝入量，g/d；Pi為加工處理因子。

1.2.5.3 風(fēng)險(xiǎn)排序 參考英國獸藥殘留委員會(huì)獸藥殘留風(fēng)險(xiǎn)排序矩陣[34]，采用原賦值標(biāo)準(zhǔn)（表3），進(jìn)行農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)排序。農(nóng)藥使用頻率（FOD）計(jì)算公式見式（5）。農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)得分（S）計(jì)算公式見式（6）。農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)與S 值的大小有關(guān)，S 值越高，殘留風(fēng)險(xiǎn)越大。

表3 玫瑰鮮花餅農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)排序指標(biāo)得分賦值標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Scoring criteria for risk ranking indicators of pesticide residues in rose flower cakes

式中：T 為玫瑰花種植過程中使用農(nóng)藥的次數(shù)；P 為玫瑰花生長周期；A 為毒性，參考經(jīng)口半數(shù)致死量（LD50）[15]；B 為毒效；C 為膳食比例；D 為使用頻率；E 為高暴露人群；F 為殘留水平。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用HPLC-MS/MS 檢測目標(biāo)化合物含量，數(shù)據(jù)采集使用AB SCIEX Analyst software 軟件，每個(gè)樣品進(jìn)樣2 次，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用WPS 軟件，處理數(shù)據(jù)和繪圖采用Origin 2022。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC-MS/MS 儀器分析條件的結(jié)果

本文比較了水和乙腈、水和甲醇、0.1%甲酸水溶液和乙腈這3 種不同流動(dòng)相組成的分析效果。結(jié)果表明，這幾種化合物在0.1%甲酸水溶液和乙腈流動(dòng)相體系中的峰形和響應(yīng)值都較好，最終選擇0.1%的甲酸水溶液和乙腈體系作為本研究的流動(dòng)相。

采用不同的梯度洗脫程序進(jìn)行分析比較，最終確定了洗脫條件，不斷優(yōu)化離子對掃描條件，最終確定離子對掃描條件見表1。四種阿維菌素類藥物混標(biāo)多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）離子流圖如圖1 所示。

圖1 四種阿維菌素類藥物混標(biāo)多反應(yīng)監(jiān)測離子流圖Fig.1 Multi-reaction monitoring ion flow diagram of four avermectins

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

采用C18和PSA 吸附劑作為前處理材料來凈化樣品中的雜質(zhì)，分析比較的C18、PSA 以及C18和PSA 混合三種不同吸附劑條件的效果，并且每種吸附劑條件分別從25、50、100、200 mg 四種不同使用量來進(jìn)行分析比較，結(jié)果如圖2、圖3、圖4 顯示。按不同條件的回收率中位數(shù)的大小進(jìn)行比較，得出采用C18的前處理?xiàng)l件總體回收率最高，添加了PSA吸附劑的回收率都比較低，且隨著PSA 的添加量增加，回收率逐漸降低，說明PSA 對阿維菌素類藥物具有吸附作用。從圖2 中可以看出隨著C18的使用量增加，回收率先升高后降低，在C18使用量為50 mg時(shí)回收率是最好的。

圖2 不同劑量的C18 吸附劑對4 種阿維菌素類藥物回收率的影響Fig.2 Effects of different doses of C18 adsorbent on recovery of four avermectins

圖3 不同劑量的PSA+C18 吸附劑對4 種阿維菌素類藥物回收率的影響Fig.3 Effects of different doses of PSA+C18 adsorbent on recovery of four avermectins

圖4 不同劑量的PSA 吸附劑對4 種阿維菌素類藥物回收率的影響Fig.4 Effects of different doses of PSA adsorbent on recovery of four avermectins

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng) 在樣品中，除了被測目標(biāo)物以外的其他物質(zhì)都視為基質(zhì)?；|(zhì)效應(yīng)則是樣品基質(zhì)對于目標(biāo)化合物的干擾效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中，阿維菌素類藥物基質(zhì)效應(yīng)的計(jì)算方法為：基質(zhì)配標(biāo)的斜率與溶劑配標(biāo)斜率的比值[30]。用沒有檢出農(nóng)藥殘留的玫瑰鮮花餅經(jīng)過前處理凈化后的溶液作為溶劑來配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，阿維菌素的基質(zhì)效應(yīng)為1.023、多拉菌素的基質(zhì)效應(yīng)為1.026、乙酰氨基阿維菌素的基質(zhì)效應(yīng)為0.986、伊維菌素的基質(zhì)效應(yīng)為0.973。4 種阿維菌素類藥物在玫瑰鮮花餅樣品的基質(zhì)效應(yīng)不太明顯。可見本實(shí)驗(yàn)中基質(zhì)對于實(shí)驗(yàn)的影響不大。

2.3.2 線性方程、檢出限和定量限 各線性方程見表4，其中X 是阿維菌素類藥物的質(zhì)量濃度，Y 是阿維菌素類藥物的峰面積。線性方程的判定系數(shù)（R2）范圍從0.9973 到0.9991。方法檢出限（LOD）為3 倍信噪比的檢測值，定量限（LOQ）為10 倍信噪比的檢測值，這4 種阿維菌素類藥物L(fēng)OD 的范圍為0.1～0.7 μg/kg，LOQ 的范圍為0.3～2.3 μg/kg。

表4 線性方程、檢出限和定量限Table 4 Linear equation,LOD and LOQ of cephalosporins

2.3.3 準(zhǔn)確度和精密度 以準(zhǔn)確度和精密度評價(jià)方法的有效性，對4 種阿維菌素類藥物在玫瑰鮮花餅樣品中，加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)為高、中、低3 個(gè)濃度水平，每個(gè)濃度重復(fù)檢測6 次。檢測結(jié)果減去樣品中的本底含量，計(jì)算所得結(jié)果見表5，阿維菌素類藥物的平均回收率在94.97%～102.09%范圍，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.12%～9.22%，準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)表明，該分析方法滿足實(shí)驗(yàn)要求。

表5 玫瑰鮮花餅中阿維菌素類藥物的回收率和精密度（n=6）Table 5 Recovery and precision of avermectins in rose flower cake (n=6)

2.4 玫瑰鮮花餅中農(nóng)藥殘留的情況

本實(shí)驗(yàn)共采集了43 種玫瑰鮮花餅樣品，采用本文建立的方法進(jìn)行檢測，玫瑰鮮花餅中只檢出了阿維菌素，阿維菌素檢出率為79%，殘留量范圍為1.89～4.58 μg/kg。參照GB 2763-2021 規(guī)定的限量標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)中最高限量是金銀花中最大殘留限量為1 mg/kg，最低限量是小麥中最大殘留限量為0.01 mg/kg，本文檢出的殘留量低于標(biāo)準(zhǔn)中的最低限量值。

2.5 膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評估

2.5.1 慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評估 根據(jù)1.2.5 的膳食評估計(jì)算公式（1）、公式（2）進(jìn)行膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評估。鮮花餅屬于糕點(diǎn)類，因此用糕點(diǎn)類的消費(fèi)量來代替鮮花餅的消費(fèi)量。中國公民人均年糕點(diǎn)消費(fèi)量是7.3 kg[35]，平均到每天消費(fèi)量為20 g/d。參照GB 2763-2021 農(nóng)殘限量標(biāo)準(zhǔn)，阿維菌素ADI 為0.001 mg/kg·bw。代入公式計(jì)算得出NEDI 為5.3×10-4μg/kg·bw，%ADI 為53%。%ADI＜100%，因此，該膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)可以接受。

2.5.2 食品安全指數(shù)分析 根據(jù)1.2.5.2 的公式（3）。計(jì)算出4 種目標(biāo)化合物的IFS 值，因玫瑰鮮花餅中未檢出多拉菌素、乙酰氨基阿維菌素、伊維菌素，故它們的殘留水平Ri 用1/2LOD 來代替[22]，計(jì)算結(jié)果如表6 所示，這四種化合物都不存在安全風(fēng)險(xiǎn)。

表6 4 種阿維菌素類藥物的食品安全指數(shù)分析Table 6 Analysis of food safety index of 4 kinds of avermectin drugs

2.5.3 風(fēng)險(xiǎn)排序 通過藥物在線網(wǎng)站[36]可以查詢得到阿維菌素類藥物的毒性數(shù)據(jù)，毒效信息從國家標(biāo)準(zhǔn)（GB 2763-2021、GB 31650-2019）中查得。按鮮花餅攝入量占居民食物攝入量[37-38]的比例算出膳食比例為1.5%左右。用公式（5）計(jì)算農(nóng)藥使用頻率。本次風(fēng)險(xiǎn)排序不研究暴露人群是否存在差異，所以把高暴露水平賦值為3 分。結(jié)果如表7 所示，總分根據(jù)公式（6）算出。根據(jù)農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)得分將農(nóng)藥分成高、中、低風(fēng)險(xiǎn)農(nóng)藥，得分要大于100 是高風(fēng)險(xiǎn)農(nóng)藥；在50 到100 之間是中風(fēng)險(xiǎn)農(nóng)藥；低于50 是低風(fēng)險(xiǎn)農(nóng)藥。四種目標(biāo)化合物都為低風(fēng)險(xiǎn)農(nóng)藥，排名第一的是阿維菌素。

表7 玫瑰鮮花餅中農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)排序Table 7 Risk ranking of pesticide residues in rose flower cake

3 結(jié)論

本文以乙腈作為提取溶劑，采用C18凈化處理玫瑰鮮花餅樣品，優(yōu)化了方法和儀器條件，最終建立了HPLC-MS/MS 測定玫瑰鮮花餅中4 種阿維菌素類藥物的方法，并進(jìn)行了方法驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)證明，本研究建立的分析方法經(jīng)過驗(yàn)證，各項(xiàng)參數(shù)都滿足檢測需求，在實(shí)際樣品中的應(yīng)用效果較好。表明該分析方法準(zhǔn)確可靠，可用于對玫瑰鮮花餅中阿維菌素類藥物的監(jiān)測分析。通過農(nóng)殘膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評估，本次檢測的4 種目標(biāo)物的膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)都在可接受范圍內(nèi)，所檢出的阿維菌素也處于低風(fēng)險(xiǎn)。由于目前國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763-2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中并沒有對食用玫瑰中的阿維菌素的最大殘留限量進(jìn)行了規(guī)定，而在花農(nóng)種植食用玫瑰花過程中，通常會(huì)使用到阿維菌素用于防治食用玫瑰的病蟲害，因此建議將其納入食用玫瑰種植過程中農(nóng)藥登記名單并制定相應(yīng)限量標(biāo)準(zhǔn)。本文對其它類型的阿維菌素類藥物也進(jìn)行檢測分析，對進(jìn)一步了解市場上玫瑰鮮花餅中阿維菌素類藥物的殘留情況具有現(xiàn)實(shí)意義。