人參不定根總皂苷的提取工藝優(yōu)化及其抗氧化與抗疲勞作用

邢藝?yán)_，王馨悅，王慕堯，齊 欣, ，崔承弼,2,

（1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133000；2.延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林延吉 133000）

疲勞是指由于運(yùn)動(dòng)過度而引起的機(jī)能生理功能減弱，導(dǎo)致不能持續(xù)維持特定的運(yùn)動(dòng)水平的現(xiàn)象，即運(yùn)動(dòng)性疲勞[1]。通常會(huì)表現(xiàn)為極度疲倦、疲憊或虛弱，若疲勞不能及時(shí)消除，還可造成一系列繼發(fā)性問題，如焦慮、失眠、抑郁、身體功能障礙、認(rèn)知障礙、能量失衡，嚴(yán)重甚至?xí)?dǎo)致與生物調(diào)節(jié)和免疫系統(tǒng)相關(guān)的嚴(yán)重疾病[2-3]。疲勞的機(jī)制很復(fù)雜，主要包括以下幾種理論，一種是LD 和BUN 等代謝物的過度產(chǎn)生和積累導(dǎo)致肌肉疲勞[4]；另一種是“自由基理論”，即自由基是體內(nèi)各種生化反應(yīng)的結(jié)果，具有強(qiáng)氧化性。自由基過度積累可導(dǎo)致生物大分子氧化，并影響人體器官。因此抗氧化和抗疲勞之間可能存在著關(guān)聯(lián)[5]。

人參（Panax ginseng C.A.Mey）具有很高的藥用價(jià)值，其主要成分是人參皂苷，是人參中主要活性成分，屬于固醇類化合物，又稱為三萜皂苷。人參皂苷主要的功效與作用包括提高機(jī)體免疫力、抗菌、改善心腦血管的供血不足、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及抗疲勞和延緩衰老等，人參開發(fā)前景巨大，但由于野生人參受氣候環(huán)境的變化經(jīng)常造成質(zhì)量波動(dòng)，且隨著近年來野生人參資源被過度開采，再加上人工種植栽培時(shí)間長(zhǎng)，易受環(huán)境因素影響，不能滿足國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的需要。因此使用組織培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)和大規(guī)模生產(chǎn)不定根，是緩解人參皂苷供給不足，實(shí)現(xiàn)可持續(xù)生產(chǎn)的有效手段[6-7]。人參不定根（ginseng adventitious roots,GAR）是一種通過生物發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)出的人參組織培養(yǎng)物[8]，GAR 在遺傳信息層面與野生人參具有很高的相似性，還具有成本低、產(chǎn)量高、易于控制和生長(zhǎng)周期短等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[9-10]，可得到更多的生物量及代謝產(chǎn)物，其所產(chǎn)生的人參皂苷含量、種類也與天然人參相似。Murthy 等[11]通過高效液相色譜法對(duì)組織培養(yǎng)的山參不定根和栽培的高麗參根中的人參皂苷進(jìn)行了化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)兩種植物中活性成分都含有Rb1、Rc、Rd、Rg1 等，且與正常人參相比，GAR 中人參皂苷的含量更高。屈青松等[12]優(yōu)化了人參皂苷的提取工藝，提高人參皂苷轉(zhuǎn)化率，并測(cè)定其具有抗氧化活性。藍(lán)瑞高等[13]研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷可以增加肌/肝糖原含量，降低LA、BUN 水平，有效緩解運(yùn)動(dòng)性疲勞。呂世鑫等[14]研究發(fā)現(xiàn)西洋參不定根總皂苷具有較好的DPPH 和OH 自由基清除能力，有較強(qiáng)的抗氧化性。目前GAR 已批準(zhǔn)認(rèn)為與5 年以下人參實(shí)質(zhì)等同，可以作為新食品原料在食品中應(yīng)用，但是利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)出的GAR，其化學(xué)成分積累及生物活性可能與傳統(tǒng)人參相比具有其獨(dú)特性，因此研究GAR 中的總皂苷具有重要意義。

本試驗(yàn)以乙醇回流法提取的GARS 為研究對(duì)象，采用單因素實(shí)驗(yàn)考察提取時(shí)間、提取溫度、乙醇濃度、料液比對(duì)GARS 得率的影響，進(jìn)一步進(jìn)行正交試驗(yàn)對(duì)GARS 的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，測(cè)定其體外抗氧化活性，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來評(píng)定其抗疲勞作用。本文探究了影響GARS 含量的多種因素及抗氧化、抗疲勞作用，為GAR 資源的開發(fā)利用提供了良好理論基礎(chǔ)，為GAR 作為一種良好的抗氧化劑原料和開發(fā)具有抗疲勞性質(zhì)的功能性食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人參不定根 大連農(nóng)科院提供，將其根洗凈、切斷、曬干；昆明小鼠 20 只，雄性，2 周齡，體重（18～22 g），延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，在恒溫（23±2 ℃）、相對(duì)濕度55%±10%的食品研究中心動(dòng)物室飼養(yǎng)，動(dòng)物許可號(hào)：SYXK（吉）2020-0009；人參皂苷Re 標(biāo)準(zhǔn)品、ABTS 上海源葉生物科技有限公司；抗壞血酸（VC）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DPPH、PTIO 梯希愛（上海）化成工發(fā)展有限公司；刺五加片 上海華源安徽仁濟(jì)制藥有限公司；肌/肝糖原測(cè)試盒、乳酸（LD）測(cè)試盒、乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)試盒、尿素氮（BUN）測(cè)試盒 南京建成生物工程研究所。

DF-35 型落地式連續(xù)投料粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司；HWS-24 型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒儀器有限公司；KQ3200DE 型數(shù)控超聲波清洗器 昆山超聲儀器公司；DHG-9620A 型立式鼓風(fēng)干燥箱 上海百典設(shè)公司；LyoQuest-55 型實(shí)驗(yàn)型冷凍干燥機(jī) 西班牙Telstar 集團(tuán)公司；N-1110 型旋蒸支架 東京理化器械株式會(huì)社；SK-0180-E 型搖床 大龍興創(chuàng)試驗(yàn)儀器（北京）有限公司；TG16A-WS 型離心機(jī)、BXM-30R 型立式壓力蒸汽滅菌 上海盧湘儀器有限公司；MS 3 basic 型渦旋混勻器 德國(guó)IKA 集團(tuán)；SP-Max3500FL 型多功能熒光酶標(biāo)儀 上海閃譜生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人參不定根總皂苷的提取 將GAR 粉碎過80 目篩，得到粉末，用70%乙醇溶液按料液比1:10浸泡過夜，抽濾取上清液，沉淀繼續(xù)按料液比1:10添加70%乙醇溶液混勻，重復(fù)抽濾步驟，合并濾液。將上清液在60 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，將殘留物溶解于蒸餾水中，用水飽和正丁醇于分液漏斗中多次萃取至上層有機(jī)層澄清，合并上層，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在50 ℃下蒸發(fā)正丁醇部分，加少量蒸餾水溶解后置于-80 ℃冷凍，凍干[15]。

1.2.2 人參不定根總皂苷含量測(cè)定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取人參Re 對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，得到對(duì)照品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液20、40、80、120、160、200 μL，分別置于具塞試管中，低溫?fù)]去溶劑，加入1%香草醛高氯酸試液0.5 mL，置60 ℃恒溫水浴充分混勻后加熱15 min，立即用冰水冷卻2 min，加入77%硫酸溶液5 mL，搖勻；以對(duì)照品溶液作空白。消除氣泡后按照“紫外-可見分光光度法”（通則0401），在540 nm 的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[16-17]，經(jīng)測(cè)定GARS 的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.9498x+0.0018（R2=0.9991）。

1.2.2.2 總皂苷含量測(cè)定 根據(jù)中國(guó)藥典2015 版中人參總皂苷含量測(cè)定方法，取待測(cè)品約50 mg，精密稱定，置于燒杯中，用25 mL 甲醇溶解并搖勻，精密吸取50 μL，照1.3.2.1 的方法，測(cè)定吸光度，帶入GARS 的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算溶液中人參皂苷Re 含量，單位為mg/g，計(jì)算結(jié)果乘以校正系數(shù)0.84，即得[18]。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 在利用乙醇水浴浸提法對(duì)GAR中的皂苷提取時(shí)，會(huì)有多種因素對(duì)提取效果產(chǎn)生影響。對(duì)主要影響因素：乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時(shí)間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)[19]。分別精密稱取4 g GAR 粉末6 個(gè)樣品，確定提取時(shí)間40 min，提取溫度80 ℃，乙醇溶液濃度70%，料液比1:35 g/mL。分別考察乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%、90%），料液比（1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45 g/mL），提取溫度（40、50、60、70、80、90 ℃），提取時(shí)間（10、20、30、40、50、60 min）對(duì)GARS 含量的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)GARS 含量影響最大的4 個(gè)因素[20]，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，因素與水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.5 人參不定根總皂苷抗氧化活性測(cè)定

1.2.5.1 DPPH 自由基清除能力測(cè)定 用蒸餾水配制濃度為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL 的人參不定根總皂苷提取液，取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液20 μL加入配置好的DPPH 溶液180 μL 并充分混勻，在搖床450 r/min 避光反應(yīng)20 min，以蒸餾水作為空白對(duì)照，以Vc 作為陽(yáng)性對(duì)照，用酶標(biāo)儀測(cè)量560 nm 波長(zhǎng)處各組的吸光值，平行測(cè)定3 次，按公式（1）計(jì)算DPPH 自由基清除率[21]：

式中：A0為空白組吸光度；A1為實(shí)驗(yàn)組吸光度；A2為陰性對(duì)照組吸光度。

1.2.5.2 ABTS+自由基清除能力測(cè)定 用蒸餾水配制濃度為0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mg/mL 的人參不定根總皂苷提取液，取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液30 μL 加入配置好的ABTS+溶液270 μL 并充分混勻，反應(yīng)10 min，以蒸餾水作為空白對(duì)照，以Vc 作為陽(yáng)性對(duì)照，用酶標(biāo)儀測(cè)量405 nm 波長(zhǎng)處各組的吸光值，平行測(cè)定3 次，按公式（2）計(jì)算ABTS+自由基清除率[22]：

式中：A0為空白組吸光度；A1為為實(shí)驗(yàn)組吸光度；A2為陰性對(duì)照組吸光度。

1.2.5.3 PTIO 自由基清除能力測(cè)定 用蒸餾水配制濃度為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL 的人參不定根總皂苷提取液，取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液0.2 mL加入配置好的PBS 貯備液、PTIO 溶液，水浴37 ℃避光反應(yīng)3 h，以VC為陽(yáng)性對(duì)照，用酶標(biāo)儀測(cè)量在557 nm 波長(zhǎng)處各組的吸光值，平行測(cè)定3 次，按公式（3）計(jì)算PTIO 自由基清除率[23]：

式中：A0為空白組吸光度；A 為實(shí)驗(yàn)組吸光度。

1.2.5.4 OH 自由基清除率的測(cè)定 用蒸餾水配制濃度為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL 的人參不定根總皂苷提取液，取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液2 mL、2 mL FeSO4溶液（10 mmol/L）、2 mL 水楊酸乙醇溶液（10 mmol/L）、再加入2 mL H2O2溶液（8.8 mmol/L）啟動(dòng)反應(yīng)，在37 ℃恒溫水浴加熱30 min，以蒸餾水作為空白對(duì)照，以Vc 作為陽(yáng)性對(duì)照，用酶標(biāo)儀測(cè)量510 nm 波長(zhǎng)處各組的吸光值，平行測(cè)定3 次[24]，按公式（4）計(jì)算羥自由基清除率：

式中：A0為空白組吸光度；A1為實(shí)驗(yàn)組吸光度；A2陰性對(duì)照組吸光度。

1.2.5.5 O2-自由基清除率的測(cè)定 用蒸餾水配制濃度為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL 的人參不定根總皂苷提取液，取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液0.2 mL，加入pH8.2 的50 mmol/L 的Tris-HCl 緩沖液5.6 mL，于25 ℃水浴20 min，立即加入3 mmol/L 鄰苯三酚溶液0.2 mL，反應(yīng)5 min，用酶標(biāo)儀測(cè)量510 nm 波長(zhǎng)處各組的吸光值[25]，平行測(cè)定3 次，按公式（5）計(jì)算O2-自由基清除率：

式中：A0為空白組；A1為實(shí)驗(yàn)組；A2為陰性對(duì)照組。

1.2.5.6 還原力的測(cè)定 用蒸餾水配制濃度為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL 的人參不定根總皂苷提取液，取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液2.5 mL，依次加入2.5 mL 0.2 mol/L 的磷酸鹽緩沖溶液（pH6.6），2.5 mL 1%的K3Fe（CN）6溶液，于50 ℃水浴20 min，再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，4000 r/min 下離心10 min。取2.5 mL 上清液，加入2.5 mL 蒸餾水，0.5 mL 0.1%的FeC13溶液，混勻反應(yīng)10 min，以VC為陽(yáng)性對(duì)照，用酶標(biāo)儀測(cè)量700 nm 波長(zhǎng)處各組的吸光值[26]，平行三次測(cè)定。

1.2.6 試驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥 將20 只昆明鼠平均分成五組，每組各4 只，依次分為空白對(duì)照組（蒸餾水）、陽(yáng)性對(duì)照組（刺五加 500 mg/kg·BW）、高劑量組（GARS 500 mg/kg·BW）、中劑量組（GARS 250 mg/kg·BW）、低劑量組（GARS 50 mg/kg·BW）[27]，正常飼養(yǎng)，并每天記錄體重，適應(yīng)性培養(yǎng)7 d 后連續(xù)灌胃28 d[28]。

1.2.7 小鼠爬桿時(shí)間測(cè)定 第28 d 灌胃1 h 后，進(jìn)行小鼠爬桿實(shí)驗(yàn)。準(zhǔn)備一根表面光滑的塑料棒，并把爬桿架放置于水溫20～25 ℃、水深約30 cm 的水箱中進(jìn)行試驗(yàn)，將小鼠放置在塑料棒的頂端，使其肌肉處于靜力緊張狀態(tài)，記錄小鼠從爬桿開始，持續(xù)到肌肉疲勞，無力抱住塑料棒而掉落到水中的時(shí)間。按照此方法，于小鼠第3 次跌落時(shí)停止實(shí)驗(yàn)，累計(jì)3 次的總時(shí)間作為爬桿時(shí)間，爬桿結(jié)束后將小鼠擦干繼續(xù)飼養(yǎng)[29]。

1.2.8 小鼠力竭游泳時(shí)間測(cè)定 待小鼠休息一晚后，將小鼠放置于水溫20～25 ℃、水深約30 cm 的游泳箱中進(jìn)行游泳實(shí)驗(yàn)，時(shí)刻觀察小鼠，要保證小鼠尾部不觸碰游泳箱底部，當(dāng)發(fā)現(xiàn)小鼠靜止漂浮于水面時(shí)用玻璃棒輕輕敲擊小鼠身體，使其肌肉一直處于緊張狀態(tài)，讓小鼠不停的游泳。小鼠游泳力竭表現(xiàn)為頭部沉入水中并在10 s 內(nèi)不露出水面，將其撈出并記錄時(shí)間[30]。

1.2.9 小鼠基礎(chǔ)指標(biāo)的測(cè)定

1.2.9.1 小鼠試驗(yàn)前后體重、體重增加量測(cè)定 每天在灌胃前測(cè)量小鼠的體重[31]并加以記錄，于28 d 后依據(jù)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.9.2 小鼠肌糖原/肝糖原含量的測(cè)定 小鼠在力竭游泳實(shí)驗(yàn)后休息0.5 h，用乙醚迷暈后取眼球血，裝入EP 試管中。將小鼠脫頸取出小鼠的肝臟、腿部肌肉，將其浸泡于生理鹽水漂洗后，濾紙吸干，稱重（樣品重量≤100 mg 為宜，不要＞100 mg），具體試驗(yàn)操作方法按照試劑盒說明書，對(duì)肌糖原/肝糖原含量進(jìn)行測(cè)定。

1.2.9.3 小鼠血液中乳酸、乳酸脫氫酶、尿素氮含量的測(cè)定 用乙醚將小鼠迷暈后取眼球血，裝入EP 試管中，置于冰袋上保持低溫。將得到的血液進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速3000 r/min，溫度25 ℃，時(shí)間10 min 后，按照試劑盒說明書，吸取上層血清測(cè)定乳酸、乳酸脫氫酶、尿素氮含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并繪制圖表，以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示；利用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析，P＜0.05 表示存在顯著性差異，P＞0.05 表示無顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 人參不定根總皂苷提取工藝單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖1A 所示，隨著乙醇濃度的增加，GARS含量也隨之提高，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到70%時(shí)，GARS 含量最高。而當(dāng)乙醇濃度持續(xù)增加，GARS 含量會(huì)有所下降，其極性降低，這是因?yàn)橐掖紳舛鹊牟煌瑢?dǎo)致極性也不同，70%乙醇極性與GARS 極性相似，根據(jù)相似相溶原理，得率較高，但乙醇濃度超出一定范圍時(shí)，提取溶劑與GARS 極性會(huì)有很大差別，某些脂溶性物質(zhì)的溶出量增加，各種雜質(zhì)增多，會(huì)對(duì)皂苷的浸出有一定的影響，從而導(dǎo)致總皂苷含量降低，所以70%的乙醇溶液為最佳溶劑體積分?jǐn)?shù)。

如圖1B 所示，當(dāng)料液比增加，GARS 含量呈現(xiàn)出遞增趨勢(shì)，在料液比1:30 g/mL 時(shí)，GARS 含量最大，之后呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，其原因是當(dāng)溶劑量增加時(shí)，試樣與溶劑的接觸面積也會(huì)隨之增加，在料液比1:30 g/mL 時(shí)，溶劑充分包裹試樣，然后持續(xù)增大溶劑量，不會(huì)影響GARS 的含量。另外，隨著溶劑量的增加，非皂苷的雜質(zhì)溶出也會(huì)隨之增大，從而阻礙GARS 的溶出，并降低其含量，因此最優(yōu)料液比是1:30 g/mL。

如圖1C 所示，溫度在40～70 ℃，GARS 含量隨溫度的增大而增大，當(dāng)溫度高于70 ℃，GARS 含量達(dá)到峰值，溫度上升到90 ℃，GARS 含量也隨之下降，但隨著溫度的升高，分子的熱量提高溶液的粘度，總皂苷萃取系數(shù)的增加隨水解速度的增加而增加；但溫度過高易分解總皂苷的分子結(jié)構(gòu)，對(duì)總皂苷的分子結(jié)構(gòu)造成損傷，使其含量下降，因此70 ℃是提取最佳溫度。

如圖1D 所示，提取時(shí)間低于40 min，GARS含量隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在40 min 時(shí)達(dá)到高峰值，在超過40 min 后則漸趨穩(wěn)定，但隨著提取時(shí)間的逐步拉長(zhǎng)，GARS 含量有小幅度降低，可能由于在最初階段萃取溶液迅速包裹試樣，提取液中皂苷類物質(zhì)濃度迅速增加，而隨著浸泡時(shí)間的增長(zhǎng)，試樣在提取液中慢慢沉淀，從而使得提取液中的有效物質(zhì)降低，所以40 min 是最佳提取時(shí)間。

2.2 人參不定根總皂苷提取正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Experimental results and analyses for optimization of total flavonoids

由表2 可知，依據(jù)直觀分析法中極差R 的大小，對(duì)因素進(jìn)行主次排列，次序?yàn)椋篋＞C＞B＞A，即料液比是最主要的因素，其次為乙醇濃度，其最佳組合為A1B2C2D2。由表3 可知，乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)GARS 的得率均有顯著影響（P＜0.05）。因此GARS 含量最高時(shí)的正交試驗(yàn)最佳方案為：乙醇濃度70%，料液比1:30 g/mL，提取溫度70 ℃，提取時(shí)間40 min，該條件下提取到的GARS 含量為107.85 mg/g。方差分析結(jié)果如表3所示。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance results

2.3 人參不定根總皂苷抗氧化活性測(cè)定

DPPH 自由基在有機(jī)溶劑中長(zhǎng)期存在的，其在波長(zhǎng)715 nm 處的吸收能力最強(qiáng)。當(dāng)DPPH 被清除時(shí)，其在最大吸收波長(zhǎng)715 nm 處可以檢測(cè)到吸光值逐漸減小，來判斷抗氧化活性的強(qiáng)弱。由圖2A 可知，隨著濃度的不斷增加，GARS 對(duì)DPPH 自由基的清除能力逐漸加強(qiáng)，并且在濃度0.4～1.2 mg/mL，GARS對(duì)DPPH 自由基清除率均有顯著性差異（P＜0.05），但濃度在1.2～2.0 mg/mL，GARS 對(duì)DPPH 自由基清除率逐漸放緩。由此可見，GARS 對(duì)DPPH 自由基具有一定的清除作用。

圖2 人參不定根總皂苷的抗氧化活性的測(cè)定結(jié)果Fig.2 Determination results of antioxidant activity of GARS

過硫酸鉀與ABTS+反應(yīng)生成穩(wěn)定的陽(yáng)離子自由基，GARS 與自由基反應(yīng)，使反應(yīng)體系褪色，以此來檢測(cè)樣品的抗氧化能力。由圖2B 可知，GARS 對(duì)ABTS+自由基的清除能力隨著濃度增大而逐漸加強(qiáng)。雖然在濃度0.4～2 mg/mL，GARS 對(duì)ABTS+自由基清除率均有顯著性差異（P＜0.05），但與VC相比有較大的差距。由此可見，GARS 對(duì)ABTS+自由基有一定程度的清除作用。

PTIO 溶解后為紫色溶液，當(dāng)有抗氧化劑清除PTIO 時(shí)，溶液顏色會(huì)減淡，通過測(cè)量吸光度的改變可以測(cè)量抗氧化活性。PTIO 有良好的穩(wěn)定性，呈劑量依賴性關(guān)系且測(cè)量簡(jiǎn)單直接。由圖2C 可知，隨著濃度的不斷增加，GARS 對(duì)PTIO 自由基的清除能力逐漸加強(qiáng)。GARS 濃度在0.4～2.0 mg/mL，其對(duì)PTIO自由基清除率均有顯著性差異（P＜0.05）。由此可見GARS 對(duì)PTIO 自由基具有一定的清除能力。

OH 自由基是活性氧自由基中毒性最大的一種自由基，若人體中有過多的OH 自由基，會(huì)影響細(xì)胞膜而產(chǎn)生活性氧和過氧化氫，從而導(dǎo)致諸如易疲勞、老化、突變、動(dòng)脈硬化等癥狀，使人體的健康受到嚴(yán)重危害。由圖2D 可知，隨著GARS 濃度的不斷增加，OH 自由基的清除能力逐漸加強(qiáng)。GARS 濃度從0.4 mg/mL 增長(zhǎng)到2.0 mg/mL 過程中，其對(duì)OH自由基清除率均有顯著性差異（P＜0.05）。但隨著濃度增長(zhǎng)，其對(duì)OH 自由基清除能力逐漸趨于平穩(wěn)。由此可見，GARS 對(duì)OH 自由基具有一定程度的清除能力。

O2-自由基是指在人體代謝中產(chǎn)生的未配對(duì)電子原子團(tuán)，雖然其氧化性與其他氧自由基比較弱，但它在代謝過程中會(huì)分解成氧化性很強(qiáng)的單線態(tài)氧自由基或OH 自由基，從而造成生物大分子結(jié)構(gòu)的變化或細(xì)胞組織損傷，使人產(chǎn)生疲勞。由圖2E 可知，O2-自由基清除率隨GARS 濃度的增加而升高，GARS 濃度在0.4～2.0 mg/mL，其對(duì)O2-自由基清除率均有顯著性差異（P＜0.05），但其對(duì)O2-自由基的清除率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于VC。由此可見，GARS 對(duì)O2-自由基僅僅只有一定程度的清除作用。

抗氧化活性的機(jī)制主要包括還原力機(jī)制，鏈引發(fā)的抑制機(jī)制，過渡金屬離子催化劑的折疊機(jī)制，過氧化物的分解和自由基清除機(jī)理。因此，一種化合物的還原能力可以作為具有潛在抗氧化活性的一個(gè)重要指標(biāo)。由圖2F 可知，隨著濃度不斷升高，GARS的還原性不斷增強(qiáng)，并且還原性與其濃度呈正相關(guān)。GARS 的最大OD 值與VC只相差了0.13，由此可見，GARS 具有較強(qiáng)的鐵離子還原能力。

2.4 人參不定根總皂苷抗疲勞作用測(cè)定

2.4.1 人參不定根總皂苷對(duì)小鼠爬桿與力竭游泳時(shí)間的影響 小鼠爬桿和力竭游泳時(shí)間是評(píng)價(jià)抗疲勞能力的兩種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停鼈兡軌蚝芎玫卦u(píng)價(jià)小鼠的疲勞耐受能力，再現(xiàn)性較高。由表4 可知，灌胃高劑量組時(shí)，小鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)最多，灌胃蒸餾水與灌胃低劑量組的爬桿時(shí)間不存在顯著性差異（P＞0.05），灌胃中劑量組、高劑量組與低劑量組的爬桿時(shí)間相比存在顯著性差異（P＜0.05）。高、中、低劑量組均增加小鼠爬桿和力竭游泳時(shí)間，高劑量組增加小鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)間最多，表明GARS 具有增強(qiáng)疲勞小鼠運(yùn)動(dòng)耐力作用，并隨著濃度的增加，效果越明顯。

表4 小鼠爬桿和力竭游泳時(shí)間結(jié)果Table 4 Results of mice pole climbing and exhausted swimming time

2.4.2 小鼠試驗(yàn)前后體重、體重增加量結(jié)果 體重變化可以直接反映小鼠運(yùn)動(dòng)量的多少。由表5 可知，經(jīng)過28 d 的灌胃后，空白對(duì)照組小鼠體重增長(zhǎng)較快；灌胃刺五加提取物的陽(yáng)性對(duì)照組小鼠體重較空白對(duì)照組小鼠有下降；灌胃蒸餾水小鼠的體重增加量與灌胃GARS 的高、中、低劑量組的體重增加量存在顯著性差異（P＜0.05），相比于空白對(duì)照組小鼠，高、中、低劑量組小鼠體重有明顯降低，其中高劑量組體重最輕，表明小鼠運(yùn)動(dòng)加劇，并隨著GARS 濃度增加，小鼠運(yùn)動(dòng)量逐漸增加。

表5 試驗(yàn)前后小鼠體重指標(biāo)變化Table 5 Mouse index results before and after the test

2.4.3 小鼠肌糖原和肝糖原含量測(cè)定結(jié)果 糖原是主要的能源儲(chǔ)備物質(zhì)，糖和糖原在體內(nèi)可以相互轉(zhuǎn)化。在機(jī)體調(diào)節(jié)下，血糖濃度高時(shí)，糖可以轉(zhuǎn)化為糖原儲(chǔ)存；血糖濃度低時(shí)，糖原又可以轉(zhuǎn)化為糖釋放到血液中，以維持血糖濃度。所以，糖原儲(chǔ)備的多少直接影響運(yùn)動(dòng)能力的強(qiáng)弱。在機(jī)體劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，肝糖原可以轉(zhuǎn)化為糖進(jìn)入血液而供能；肌糖原通過無氧酵解，直接為肌肉供能，以延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)時(shí)間。因此，能量?jī)?chǔ)備物質(zhì)肝糖原和肌糖原可以作為機(jī)體抗疲勞指標(biāo)。由表6 可知，灌胃蒸餾水小鼠的肌/肝糖原含量與低劑量組相比不存在顯著性差異（P＞0.05），灌胃中劑量組、高劑量組的肌/肝糖原含量與低劑量組相比存在顯著性差異（P＜0.05）。低劑量組灌胃劑量較少，對(duì)肌/肝糖原含量影響較小，因此與空白對(duì)照組相比差異不顯著（P＜0.05）。而高劑量組灌胃劑量最多，小鼠肌/肝糖原含量最高，所以高劑量對(duì)提高小鼠肌/肝糖原含量最有效，表明GARS 能增加小鼠體內(nèi)肌/肝糖原的貯存，從而為運(yùn)動(dòng)提供更多能量。

表6 各組小鼠肌糖原與肝糖原含量Table 6 Muscle glycogen and liver glycogen content in mice of each group

2.4.4 小鼠乳酸、尿素氮含量和乳酸脫氫酶活性測(cè)定結(jié)果 長(zhǎng)時(shí)間的劇烈運(yùn)動(dòng)會(huì)增加肌肉的氧氣消耗，導(dǎo)致機(jī)體相對(duì)缺氧，此時(shí)肌肉中的糖原會(huì)被分解產(chǎn)生乳酸，為機(jī)體提供能量。但大量乳酸的產(chǎn)生則會(huì)影響機(jī)體內(nèi)環(huán)境的酸堿平衡，引起肌肉酸痛，導(dǎo)致肌肉運(yùn)動(dòng)能力下降。同時(shí)為了滿足能量需求，蛋白質(zhì)的代謝顯著增加，使肝臟中的尿素水平明顯增加，過量的尿素會(huì)在體內(nèi)積累并對(duì)機(jī)體造成危害。BUN 的含量在一定程度上可以反映機(jī)體的疲勞程度。LDH 的主要作用是將肌肉中過多乳酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸幔瑥亩鴾p少乳酸的積累。LDH 活力越強(qiáng)，乳酸的轉(zhuǎn)變?cè)蕉?，抗疲勞性就越?qiáng)。由表7 可知，灌胃蒸餾水小鼠的LD 含量與低劑量組相比存在顯著性差異（P＜0.05），灌胃中劑量組與低劑量組相比不存在顯著性差異（P＞0.05）。空白對(duì)照組小鼠LD 含量最高，高劑量組LD 含量最低。灌胃高劑量組時(shí)對(duì)于降低LD 含量最有效；灌胃蒸餾水小鼠的BUN 含量與低劑量組相比存在顯著性差異（P＜0.05），灌胃中劑量組與低劑量組相比不存在差異性顯著（P＞0.05）?？瞻讓?duì)照組小鼠BUN 含量最高，高劑量組BUN 含量最低，灌胃高劑量組對(duì)于降低BUN 含量最有效，表明GARS 能減少蛋白質(zhì)分解，降低疲勞小鼠血清尿素氮的生成；灌胃蒸餾水小鼠的LDH 活性與低劑量組相比存在顯著性差異（P＜0.05），灌胃中劑量組與低劑量組相比存在顯著性差異（P＜0.05），灌胃高劑量組與中劑量組相比存在顯著性差異（P＜0.05）?？瞻讓?duì)照組LDH 活性最低，高劑量組LDH 活性最高。灌胃高劑量組時(shí)對(duì)于提高LDH 活性最有效，表明隨著GARS 濃度增大，體內(nèi)乳酸脫氫酶的活力增強(qiáng)，從而減少體內(nèi)乳酸的累積。

表7 各組小鼠LD、BUN 含量和LDH 活性Table 7 LD,BUN content and LDH activity of mice in each group

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化提取工藝，有效減少對(duì)提取活性成分的影響，縮短提取時(shí)間，從而提高GARS 含量。通過體外抗氧化實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，表明GARS具有抗氧化和抗疲勞活性，與人參總皂苷的功能相似。因此本研究為研發(fā)GARS 抗氧化和抗疲勞相關(guān)藥物和功能性食品等深加工產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)參考。但本試驗(yàn)沒有測(cè)定體內(nèi)抗氧化活性，難以反映GAR 在體內(nèi)真實(shí)的抗氧化水平，不能確定GARS是否有通過清除體內(nèi)自由基來緩解疲勞的作用，有待進(jìn)一步研究。