富硒荷葉離褶傘菌絲體中蛋白質(zhì)提取工藝優(yōu)化及氨基酸組成分析

高慧娟，陳月娟 ，楊艷輝，黃建花，曹 陽，趙 麗，張 楠，朱子雄，魏生龍

（1.河西學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅張掖 734000；2.甘肅省應(yīng)用真菌工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅張掖 734000；3.甘肅省河西走廊特色資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅張掖 734000；4.臨澤縣怡泉新禾農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，甘肅張掖 734200）

硒是生物體必需的微量礦質(zhì)元素[1]，對(duì)人類健康有著極其重要的作用。人體硒的主要來源是通過食物攝入[2]，但是人們很難從本土自然食物中攝入硒以達(dá)到補(bǔ)硒的目的。人工外源施硒培養(yǎng)技術(shù)可以提高食物中硒的含量。食用菌具有從生長底物中吸收硒的能力，通過菌絲體的代謝，將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，有機(jī)硒主要以硒蛋白質(zhì)、硒多糖、硒核酸、含硒多肽、硒黃酮等形式存在，其中又以含硒蛋白為主[3]。食用菌經(jīng)富硒處理后不僅提升了本身的營養(yǎng)功效，還能更好地被人體吸收[4]，可以用于生產(chǎn)高硒新型食品補(bǔ)充劑[5]。

近年來，隨著人們生活水平提高及對(duì)健康的重視，味道鮮美、營養(yǎng)豐富、綠色健康的食用菌及其制品越來越受到消費(fèi)者的喜愛。荷葉離褶傘（Lyophyllum decastes）被稱作香味松口蘑或美味玉蕈，是離褶傘屬一種市場前景較好的珍稀食用菌[6]，也是一種藥用真菌[7]。蛋白質(zhì)營養(yǎng)是衡量食物營養(yǎng)的重要組成部分[8]，也是對(duì)食用菌營養(yǎng)學(xué)評(píng)價(jià)的一個(gè)重要方面，也是氨基酸種類和含量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。研究表明，荷葉離褶傘菌絲體中蛋白質(zhì)含量大于20%，蛋白質(zhì)的均衡性優(yōu)于子實(shí)體，營養(yǎng)價(jià)值比子實(shí)體更高，極具生產(chǎn)和食用價(jià)值[9]。此外，荷葉離褶傘還具有較強(qiáng)的富硒能力[10]，硒在攝入人體后可以增加機(jī)體中硒蛋白含量[11]，提升其營養(yǎng)價(jià)值。目前國內(nèi)外有關(guān)荷葉離褶傘硒蛋白的報(bào)道還很少，有必要對(duì)富硒荷葉離褶傘菌絲體中蛋白質(zhì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

因此，本試驗(yàn)以富硒的荷葉離褶傘菌絲體為原料，采用超聲輔助提取，對(duì)蛋白的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)蛋白質(zhì)中硒的含量進(jìn)行測定，以氨基酸分析測定儀檢測荷葉離褶傘菌絲體富硒前后，蛋白質(zhì)中的氨基酸種類和數(shù)量的變化，了解硒對(duì)荷葉離褶傘菌絲體中氨基酸的影響，為進(jìn)一步研發(fā)食用菌富硒菌絲蛋白質(zhì)保健品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

荷葉離褶傘1022 菌株 甘肅省應(yīng)用真菌工程實(shí)驗(yàn)室提供；標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白（分析純）、硒粉（化學(xué)純CP）、3,3'-二氨基聯(lián)苯胺（化學(xué)純CAS）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其它試劑均為分析純；玉米粉、大豆蛋白粉 甘肅張掖新樂超市。

V-1200 型可見光分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；TDL-50 大容量低速離心機(jī)金壇市億能實(shí)驗(yàn)儀器場；LGJ-18 真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華科技發(fā)展有限公司；RE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；KQ-250B 型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；L-8900 氨基酸分析測定儀 日本日立公司；氨基酸柱 安米諾西斯公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌絲體中蛋白質(zhì)的提取工藝 荷葉離褶傘菌絲體→活化→加硒→搖瓶發(fā)酵→加入20 L 發(fā)酵罐→發(fā)酵→得到富硒菌絲體→干燥→粉碎→加堿液攪拌→超聲輔助提取→離心→上清液→調(diào)節(jié)pH 直至等電點(diǎn)→離心→回溶→冷凍干燥→蛋白樣品

操作要點(diǎn)：在20 L 生物發(fā)酵罐中加入玉米粉和大豆蛋白粉水解液的培養(yǎng)基，滅菌冷卻后接入8.5%種子液（將活化的荷葉離褶傘菌絲體菌塊接入PDA 培養(yǎng)基中，在搖床發(fā)酵8 d 的發(fā)酵液），發(fā)酵至第3 d，在發(fā)酵液中加入Na2SeO3溶液，使發(fā)酵液中硒含量為4 μg/mL，待發(fā)酵至第8 d 時(shí)，終止發(fā)酵，過濾并清洗菌絲體，放入真空干燥機(jī)中干燥，磨粉制成100 目標(biāo)準(zhǔn)粉[12]，稱取0.5 g 該標(biāo)準(zhǔn)粉，加入濃度為0.05 mol/L NaOH 溶液，使用超聲輔助提取后，然后在3000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心15 min，然后調(diào)節(jié)上清液至等電點(diǎn)，再次離心得蛋白沉淀，最后將蛋白沉淀加入少量蒸餾水調(diào)節(jié)至pH7.0 回溶。放在真空冷凍干燥機(jī)中干燥得蛋白樣品。

1.2.2 蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定 按照文獻(xiàn)[13]方法測定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，略作修改。將富硒荷葉離褶傘菌絲體與0.05 mol/L 的NaOH 溶液以55:1 液料比進(jìn)行混合，置于磁力攪拌器中53 ℃提取2 h，冷卻至室溫后離心（3000 r/min，15 min）取上清液。分別取30 mL 上清液于8 個(gè)50 mL 的燒杯中，分別用1 mol/L 的 HCl 溶液調(diào)節(jié)pH 為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，室溫下靜置2 h 后離心（8000 r/min，10 min），測定上清液蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 蛋白提取率的測定 按照文獻(xiàn)[14]中雙縮脲法測定蛋白質(zhì)的提取率。

1.2.3.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液 準(zhǔn)確稱取1.0 g 牛血清白蛋白，用水配制成含量為10 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，分別取出0、1、2、3、4 和5 mL，轉(zhuǎn)入6 支比色管，各加入20 mL 雙縮脲試劑，并分別加水補(bǔ)足到25 mL，室溫下反應(yīng)30 min，以蒸餾水為空白，于550 nm測定吸光度值，然后以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)（mg/mL），吸光值為縱坐標(biāo)，得回歸方程Y=0.1985X+0.0665，決定系數(shù)R2=0.9990。

1.2.3.2 樣品中蛋白質(zhì)提取率的測定 取5 mL 超聲提取后離心的上清液，加入20 mL 雙縮脲試劑，并加水補(bǔ)足到25 mL，充分混勻后，室溫下放置30 min，在550 nm 下測定吸光值。

式中，C：從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得樣品的吸光值所對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）；V1：反應(yīng)體系的總體積（mL）；V2：用于顯色的樣品體積（mL）；V0：樣品稀釋后總體積（mL）；m：樣品中蛋白質(zhì)（由等電點(diǎn)處沉淀的蛋白質(zhì)凍干所得）的質(zhì)量（g）。

1.2.4 富硒荷葉離褶傘菌絲體中蛋白提取單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 提取溫度對(duì)蛋白提取率的影響 準(zhǔn)確稱取富硒的樣品0.5000 g，選擇不同提取溫度（50、60、70 和80 ℃），堿液濃度為0.05 mol/L，液料比為150:1 g/mL，提取時(shí)間為20 min，提取1 次的條件下超聲攪拌提取，提取后在3000 r/min 下離心15 min，測定蛋白質(zhì)含量，研究提取時(shí)間對(duì)菌絲體蛋白提取率的影響。

1.2.4.2 提取時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響 準(zhǔn)確稱取富硒的樣品0.5000 g，在1.2.3.1 最優(yōu)提取溫度下，選擇不同提取時(shí)間（20、40、60、80 和100 min），堿液濃度為0.05 mol/L，液料比為150:1 g/mL，提取時(shí)間為60 min，提取次數(shù)為1 次的條件下超聲攪拌提取，提取后在3000 r/min 下離心15 min，測定蛋白提取率，研究提取時(shí)間對(duì)菌絲體蛋白提取率的影響。

1.2.4.3 液料比對(duì)蛋白提取率的影響 準(zhǔn)確稱取富硒的樣品0.5000 g，選擇1.2.3.1 中最優(yōu)提取時(shí)間，在60 ℃水浴中，堿液濃度為0.05 mol/L，選擇不同液料比（150:1、200:1、250:1、300:1 和400:1 g/mL），提取1 次的條件下超聲攪拌提取，提取后在3000 r/min 下離心15 min，測定蛋白提取率，研究液料比對(duì)菌絲體蛋白提取率的影響。

1.2.4.4 提取次數(shù)對(duì)蛋白提取率的影響 準(zhǔn)確稱取富硒的樣品0.5000 g，選擇最優(yōu)提取時(shí)間、液料比和提取溫度，在不同提取次數(shù)（1、2、3 和4 次）下，于0.05 mol/L 堿液中超聲攪拌提取，提取后在3000 r/min下離心15 min，測定蛋白提取率，研究提取時(shí)間對(duì)菌絲體蛋白提取率的影響。

1.2.5 富硒菌絲體中蛋白質(zhì)提取工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用Design-expert 8.0 軟件系統(tǒng)，采用Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)法[15]，以蛋白提取率為響應(yīng)值，選取提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、液料比（C）和提取次數(shù)（D）四個(gè)因素，設(shè)計(jì)4 因素3 水平試驗(yàn)，因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.6 蛋白樣品中硒含量測定 根據(jù)文獻(xiàn)[16]方法稍作修改測定蛋白樣品中硒含量。

1.2.6.1 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取0.10 g 硒標(biāo)準(zhǔn)品溶解于2 mL 濃硝酸中，低溫下（65～70 ℃）加熱溶解至蒸干，用體積比為1:1 的濃鹽酸溶解，定容至1 L，使用時(shí)用蒸餾水稀釋至1 μg/mL 制得硒標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取0.0、1.0、2.0、4.0、6.0 和8.0 mL 的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0 μg/mL），分別置于125 mL 分液漏斗中，加水定容至25 mL，分別加入5% EDTA-2Na 溶液1 mL，用體積比為1:1 的濃HCl 調(diào)節(jié)溶液至pH2～3，再加入0.5% 3,3'-二氨基聯(lián)苯胺溶液4 mL，搖勻，置暗處20 min 后，用10% NaOH 溶液調(diào)節(jié)至pH7～7.5，加入10 mL 甲苯振蕩2 min 靜置分層，棄水層，甲苯層用比色皿于420 nm 處測其吸光值。以硒含量（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，得回歸方程為Y=0.0151X-0.0014，決定系數(shù)R2=0.9996。

1.2.6.2 樣品的處理及硒含量測定 準(zhǔn)確稱取0.05 g樣品溶于2 mL 濃硝酸，在電熱爐中加熱（控制溫度160～180 ℃）消化，至樣品完全溶解，溶液呈澄清，停止加熱并冷卻至70 ℃，加入體積比為1:1 濃HCl 定容至10 mL，備用。準(zhǔn)確移取上述備用溶液0.2 mL，用水定容至25 mL 轉(zhuǎn)入125 mL 分液漏斗中，此時(shí)若有白色沉淀物（可能是硅膠）應(yīng)用濾紙過濾，分別加入5% EDTA-2Na 溶液1 mL 后步驟同1.2.6.1 中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法。根據(jù)樣品溶液測得的吸光值，結(jié)合硒標(biāo)準(zhǔn)曲線查找、計(jì)算相應(yīng)的硒含量。

式中，C：從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得樣品的吸光值所對(duì)應(yīng)的硒濃度（mg/mL）；V1：反應(yīng)體系的總體積；n：樣品稀釋倍數(shù)；m：菌絲體樣品中蛋白質(zhì)的質(zhì)量（g）。

1.2.7 富硒菌絲體中蛋白質(zhì)氨基酸種類和含量測定

1.2.7.1 蛋白樣品的前處理 稱取提取的蛋白質(zhì)0.1000 g 置于水解管中，加入10～15 mL 6 mol/L 的鹽酸，將封口嚴(yán)密的水解管放在（110±1）℃的恒溫干燥箱內(nèi)水解22 h 后，取出冷卻。打開水解管，將水解液全部轉(zhuǎn)入25 mL 容量瓶中，用去離子水定容至刻度，取濾液1 mL 置于25 mL 小燒杯中，在40～50 ℃的真空干燥箱中烘干（如有殘留物，用1～2 mL 去離子水溶解，再干燥），加入5 mL 0.02 mol/L 的鹽酸溶液溶解作為待測液。

1.2.7.2 測定分析條件 氨基酸柱；單樣品分析周期為30 min。分離柱的條件為：洗脫液的流速0.40 mL/min，柱溫70 ℃，柱壓8.627 MPa；反應(yīng)柱的條件為：茚三酮及茚三酮緩沖液的流速0.35 mL/min，柱溫135 ℃，柱壓0.982 MPa，檢測波長：440 nm/570 nm雙波長同時(shí)檢測；反應(yīng)溫度：135 ℃；分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液及試樣20 μL 進(jìn)樣[17]。

1.2.8 營養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià) 采用化學(xué)評(píng)分（chemical score，CS）、氨基酸評(píng)分（amino acid score，AAS）對(duì)富硒荷葉離褶傘菌絲體進(jìn)行營養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)[18]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中的每組數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)的平均值，采用Design-Expert 13 軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析，采用Origin 2018 進(jìn)行圖表處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的確定

如圖1 所示，上清液中蛋白質(zhì)的含量，隨著pH 增加呈現(xiàn)凹形，pH 從2.5～3.5，隨著pH 增加，上清液中蛋白質(zhì)含量在急劇降低，從3.5 以后開始又緩慢增加，4.5 以后迅速增加，在5.0 時(shí)達(dá)到最大值22.5%。說明提取液上清中蛋白質(zhì)在pH3.5～4.5 的溶解度較低，在此范圍之外，蛋白含量均較大。pH在3.5～4.5 范圍內(nèi)，上清液中蛋白質(zhì)殘留濃度較低，而在3.5 處蛋白質(zhì)所帶電荷為零，溶解度最低，推測富硒荷葉離褶傘菌絲體中蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在3.5 左右，這和王梓杭等[18]對(duì)香菇中蛋白質(zhì)的提取工藝中等電點(diǎn)的測定值（3.8）相接近。

圖1 蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定Fig.1 Determination of protein isoelectic point

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取溫度對(duì)富硒菌絲體中蛋白提取率的影響

如圖2 所示，隨著提取溫度的升高，蛋白提取率也在增加，提取溫度越高，堿提效果也越好。但提取溫度超過60 ℃以后，蛋白提取率隨提取溫度變化的趨勢減小，并且有文獻(xiàn)[19]報(bào)道，蛋白的變性溫度為70～80 ℃，由此確定實(shí)際提取溫度為60 ℃。這與田敏爵等[20]對(duì)富硒猴頭菌中硒蛋白提取工藝的研究中的結(jié)論相似。

圖2 提取溫度對(duì)富硒菌絲體中蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on protein extraction rate in selenium-rich mycelia

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)富硒菌絲體中蛋白提取率的影響

如圖3 所示，隨提取時(shí)間的增加，蛋白提取率不斷增加，在提取時(shí)間為60 min 時(shí)，達(dá)到最大43.69%。提取時(shí)間超過60 min 后，隨著提取時(shí)間延長，蛋白提取率呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，可能是提取時(shí)間增加后，蛋白質(zhì)溶出量已飽和，因此選擇60 min 為優(yōu)化試驗(yàn)條件。

圖3 提取時(shí)間對(duì)富硒菌絲體中蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of reaction time on protein extraction rate in selenium-rich mycelia

2.2.3 液料比對(duì)對(duì)富硒菌絲體中蛋白提取率的影響

由圖4 可知，隨著液料比的增大，蛋白質(zhì)提取率也在增加，液料比200:1 mL/g 時(shí)達(dá)到44.95%，之后隨液料比的增加，蛋白質(zhì)提取率的提高不明顯?？赡苁且?yàn)殡S著溶劑的增加，固液相中的濃度差增大，溶質(zhì)溶出速度增大[21]，使得蛋白提取率增加。但是液料比過大會(huì)給隨后的濃縮步驟造成負(fù)擔(dān)，考慮工藝過程中溶劑使用量和降低生產(chǎn)成本方面的考慮，確定液料比為200:1 mL/g。

圖4 液料比對(duì)富硒菌絲體中蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of liquid to material ratio on protein extraction rate in selenium-rich mycelia

2.2.4 提取次數(shù)對(duì)對(duì)富硒菌絲體中蛋白提取率的影響 由圖5 可知，隨著提取次數(shù)增多，蛋白提取率增加，堿提2 次的蛋白提取率為61.39%，之后隨著提取次數(shù)增加，蛋白提取率增加幅度緩慢，說明堿提2 次可以有效地將蛋白充分提出，考慮到提取效率，選擇2 次為最佳提取次數(shù)。

圖5 提取次數(shù)對(duì)富硒菌絲體中蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of reaction times on protein extraction rate in selenium-rich mycelia

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken 的中心組合設(shè)計(jì)原理，試驗(yàn)中對(duì)4 因素各取3 水平，設(shè)計(jì)了29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，結(jié)果見表2。經(jīng)Design-Expert 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行多元回歸分析，所得的方差分析結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 2 Design and results of response surface analysis

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)的方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA results of factors and model in the response surface experiment

利用軟件Design Expert8.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析得到多元二次回歸方程：Y1=74.23+7.02A+0.98B+2.48C+12.61D-1.36AB-5.57AC-1.63AD-2.31BC-3.29BD-5.91CD-9.08A2-10.80B2-10.35C2-19.36D2。

由表3 可知，模型項(xiàng)顯著，P＜0.0001，失擬項(xiàng)不顯著，P=0.1439＞0.05，決定系數(shù)R2=0.9307，說明模型可用，回歸擬合程度較好。A、D、A2、B2、C2、D2對(duì)響應(yīng)值的影響均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），B、C、AB、AC、AD、CD、BD、BC 對(duì)響應(yīng)值的影響均不顯著。由F值可知，影響蛋白提取率主要因素依次為D＞A＞C＞B，即提取次數(shù)＞提取溫度＞液料比＞提取時(shí)間。利用Design Expert 8.0 軟件可以得兩兩因子交互作用的響應(yīng)面圖。響應(yīng)面坡面的陡峭程度及等高線的疏密、形狀可反映出交互作用對(duì)響應(yīng)值影響的強(qiáng)弱，響應(yīng)面坡度陡峭，等高線密集且趨于橢圓表示兩因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響顯著，而響應(yīng)面坡度平緩，等高線稀疏且趨于圓形則與之相反。圖6 反映兩因素交互作用對(duì)富硒荷葉離褶傘中蛋白提取率的影響，圖中響應(yīng)面坡度較平緩，等高線稀疏且趨于圓形，說明提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)和液料比的兩兩交互作用對(duì)蛋白質(zhì)提取率影響不顯著，這與方差分析結(jié)果一致。

圖6 各因素交互作用對(duì)富硒荷葉離褶傘菌絲體蛋白提取率的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface of the interaction of various factors on the protein extraction rate of selenium-rich Lyophyllum decastes mycelia

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

Design-Expert 8.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到荷葉離褶傘菌絲體硒蛋白的最佳提取工藝條件：提取溫度63.81 ℃、提取時(shí)間59.80 min、液料比196.36:1 g/mL、提取次數(shù)2.32 次，理論上蛋白提取率為77.50%。考慮到實(shí)驗(yàn)的可行性，將最佳條件調(diào)整為提取溫度64 ℃、提取時(shí)間60 min、液料比200:1 g/mL、提取次數(shù)2 次。在此條件下，對(duì)荷葉離褶傘菌絲體硒蛋白進(jìn)行提取，通過3 次平行試驗(yàn)，測得蛋白提取率為75.13%，相對(duì)誤差為2.36%，證明優(yōu)化的荷葉離褶傘菌絲體硒蛋白的最適提取工藝條件可行，這與王蓮芳等[22]研究富硒食用菌中蛋白得率為30.17%的結(jié)果不同，在優(yōu)化條件相同的同等條件下，未富硒菌絲體中蛋白質(zhì)提取率為52.11%，說明未富硒菌絲體中含有的蛋白含量低，富硒能夠提高菌絲體中的蛋白質(zhì)含量[23]。

2.5 富硒荷葉離褶傘菌絲體蛋白質(zhì)中硒含量測定

富硒荷葉離褶傘菌絲體蛋白中硒含量為63.87±4.18 μg/g。推測荷葉離褶傘菌絲體發(fā)酵過程中加入無機(jī)硒，可以通過生物轉(zhuǎn)化進(jìn)入蛋白質(zhì)中。

2.6 富硒菌荷葉離褶傘菌絲體蛋白質(zhì)中氨基酸色譜分析

實(shí)驗(yàn)所測得氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖7，17 種氨基酸在選定的分離條件下，可以達(dá)到很好的分離效果。荷葉離褶傘菌絲體富硒前后的蛋白質(zhì)中均含有14 種氨基酸（色氨酸在水解過程中遭到破壞），Cys 和Lie 兩種氨基酸含量未檢出。富硒后菌絲體蛋白質(zhì)中的氨基酸，除Pro 外，其他氨基酸含量均比未富硒菌絲體中含量高，其中Ala 和Lys 兩種氨基酸含量較未富硒的菌絲體中含量高出一倍以上（表4）。

圖7 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.7 Chromatogram of amino acid standard

表4 富硒前后荷葉離褶傘菌絲體蛋白質(zhì)中氨基酸組成及含量Table 4 Analysis of AA content of protein in mycelia of Lyophyllum decastes before and after selenium enrichment

富硒菌絲體蛋白中總氨基酸含量（TAA）和人體必需氨基酸的含量（EAA）分別為51.18 和17.20 g/100 g，較未富硒中的含量高出20.33%和19.75%，EAA/TAA 的值為33.61，EAA/NEAA 的值為0.51，與FAO/WHO 提出的理想蛋白的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷，荷葉離褶傘菌絲體富硒前后蛋白接近該標(biāo)準(zhǔn)，說明荷葉離褶傘菌絲體富硒前后均具有一定的營養(yǎng)價(jià)值，且硒能促進(jìn)荷葉離褶傘菌絲體中大部分氨基酸的合成，這和富硒姬松茸[24]、松杉靈芝[25]菌絲體蛋白質(zhì)中氨基酸含量變化的研究結(jié)果一致。

由表4 可知，富硒荷葉離褶傘菌絲體中必需氨基酸的含量為33.61%，和不富硒的菌絲體中必需氨基酸含量相當(dāng)。由表5 可知，必需氨基酸Thr、Leu、Phe+Tyr 占總氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比FAO/WHO 提出的理想蛋白標(biāo)準(zhǔn)的高，Lys 和Met+Cys 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比標(biāo)準(zhǔn)低。CS 越接近100 分，表明樣品與雞蛋蛋白越接近；AAS 越接近100 分，表明樣品與WHO/FAO模式蛋白越接近。Lys、Phe+Tyr 和Met+Cys 的CS較低，其他必需氨基酸均在80 分以上，因此荷葉離褶傘菌絲體蛋白的限制性氨基酸為Lys、Phe+Tyr和Met+Cys；Lys 和Met+Cys 的AAS 較低，其他必需氨基酸均超過100，說明菌絲體具有良好的營養(yǎng)價(jià)值，且富硒菌絲體的營養(yǎng)價(jià)值更高一些。

表5 富硒前后荷葉離褶傘菌絲體蛋白質(zhì)中必需氨基酸組成評(píng)價(jià)Table 5 Analysis of AA content of protein in mycelia of Lyophyllum decastes before and after selenium enrichment

3 結(jié)論

該研究采用目前在食用菌蛋白質(zhì)提取中常采用的超聲輔助堿提取蛋白法，通過單因素實(shí)驗(yàn)和Boxbenhnken 中心組合響應(yīng)面試驗(yàn)法，對(duì)富硒荷葉離褶傘菌絲體中蛋白質(zhì)進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)，確定了最佳提取工藝條件：提取時(shí)間60 min、提取溫度60 ℃、液料比200:1 g/mL、提取次數(shù)為2 次，蛋白提取率為76.90%。并且采用3,3’-二氨基聯(lián)苯胺分光光度法測定菌絲體蛋白質(zhì)中的硒含量為63.87 μg/g，通過添加無機(jī)硒進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)菌絲體，可以使硒進(jìn)入菌絲體蛋白中。分析發(fā)現(xiàn)，富硒菌絲體中有17 種氨基酸，其中必需氨基酸含量占33.61%，和非必需氨基酸的比值為0.5，氨基酸組成較為合理，荷葉離褶傘菌絲體富硒前后均具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，富硒的營養(yǎng)價(jià)值更高，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白來源，且其中含有一定量的硒，大大提高菌絲體的營養(yǎng)價(jià)值和利用價(jià)值，這為富硒荷葉離褶傘菌絲體的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了可靠的理論依據(jù)，具有廣闊的應(yīng)用前景。