嫁接對(duì)番茄植株根際微生物群落組成的影響

朱 瑜,周信雁,魏宇飛,謝源源,韋 勛,楊尚東,龐師嬋

(1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院/廣西農(nóng)產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/植物科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,南寧 530004;2.廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,廣西 龍州 532415)

【研究意義】番茄是世界上消費(fèi)量最大的蔬菜之一[1]。近年來,由于我國(guó)番茄主產(chǎn)區(qū)長(zhǎng)期重茬栽培,連作障礙危害日趨嚴(yán)重,已成為阻礙番茄產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要問題之一[2]。實(shí)際生產(chǎn)中,運(yùn)用嫁接技術(shù)已顯著提高了黃瓜、茄子、葡萄、蘋果等作物的抗性、品質(zhì)和產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀,有效緩解了連作障礙[3]。同樣,嫁接亦有助于減輕番茄連作障礙的危害,可增加番茄植株根系對(duì)養(yǎng)分的吸收、增強(qiáng)抗病性及提高番茄品質(zhì)[4-5]。植物與土壤微生物之間存在密切關(guān)系,植物根系通過產(chǎn)生根系分泌物可以使土壤中微生物富集于根系周圍[6],而根際微生物則可以通過多種代謝活動(dòng)顯著影響植物生長(zhǎng)發(fā)育[7-9]。根際微生物主要包括細(xì)菌和真菌,其豐度占比可達(dá)60%～80%,兩者之間不斷進(jìn)行相互作用,通過養(yǎng)分和生態(tài)位的競(jìng)爭(zhēng)增加自身的種群優(yōu)勢(shì)[10]。其中,有益微生物可以通過自身代謝活動(dòng)影響植物的生長(zhǎng),如調(diào)控土壤營(yíng)養(yǎng)元素的循環(huán)、分泌激素類化合物和抑制病原菌侵害等;而有害微生物則會(huì)侵染植物,阻礙植物生長(zhǎng)或?qū)е缕渌劳鯷11]。因此,研究番茄實(shí)生和嫁接植株根際土壤微生物群落組成,揭示嫁接對(duì)番茄根際土壤微生物的影響,能為挖掘?qū)Ψ焉L(zhǎng)有益的微生物種類提供思路,對(duì)促進(jìn)番茄產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】嫁接可誘導(dǎo)植物根際土壤微生物促進(jìn)土壤碳、氮、磷元素的循環(huán),進(jìn)而提升植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用能力[11-13]。劉斯晗等[14]發(fā)現(xiàn),番茄嫁接可以促使其根系產(chǎn)生鄰苯二甲酸二甲酯(DP)和2,6-二叔丁基對(duì)甲苯酚(BHT)2種抗病性化合物,DP和BHT可影響番茄根際微生物的形成,從而顯著提高番茄對(duì)青枯病的抵抗能力;覃仁柳等[15]發(fā)現(xiàn),番茄嫁接顯著提高根系內(nèi)生微生物多樣性和有益微生物數(shù)量,進(jìn)而增強(qiáng)植株對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性;茄子[16]和西瓜[17]嫁接處理也可以顯著增加其有益根際微生物數(shù)量,有效降低植株黃萎病和枯萎病發(fā)病率。嫁接不同種類砧木可以不同程度改變植株根系活力和根際、葉際微生物的數(shù)量和種類,可以提高植物對(duì)土壤病原體或不利環(huán)境的抵抗力[18-19]。根際土壤微生物通過生命活動(dòng)具有分解土壤中有機(jī)質(zhì)、產(chǎn)生植物激素類化合物、降解根系分泌物、塑造菌根等作用,從而可以改變土壤性質(zhì)和根系結(jié)構(gòu),為植株生長(zhǎng)創(chuàng)造更加有利的條件[20]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然前人對(duì)嫁接提高番茄植株抗性已開展了相關(guān)研究,但嫁接不同砧木對(duì)番茄植株根際微生物組成的影響仍鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本文選用不同砧木,基于高通量測(cè)序技術(shù)系統(tǒng)分析嫁接對(duì)番茄植株根際土壤微生物(細(xì)菌和真菌)群落組成的影響,進(jìn)一步闡明嫁接提高番茄植株抗性的作用方式,為構(gòu)建生態(tài)防控番茄土傳病害的栽培技術(shù)體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

砧木為新砧1號(hào)和寶砧1號(hào),其具有適應(yīng)性廣、抗病性強(qiáng)、根系生長(zhǎng)發(fā)達(dá)等特性。接穗選用桃太郎番茄品種,其生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、產(chǎn)量高且營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)優(yōu)良。砧木和接穗均購于農(nóng)友種苗(中國(guó))有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集 2020年8月至12月在廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院蔬菜生產(chǎn)基地(108°17′25″ E,22°51′02″ N)內(nèi)進(jìn)行盆栽試驗(yàn),定植盆高50 cm、直徑40 cm。試驗(yàn)點(diǎn)土壤類型為赤紅壤土,pH 5.71,有機(jī)質(zhì)21.2 g/kg,全氮1.05 g/kg,全磷0.49 g/kg,全鉀7.4 g/kg,堿解氮131.7 mg/kg。設(shè)5個(gè)處理:新砧1號(hào)實(shí)生植株(簡(jiǎn)稱:新砧)、新砧1號(hào)×桃太郎嫁接植株(簡(jiǎn)稱:桃太郎/新砧)、寶砧1號(hào)實(shí)生植株(簡(jiǎn)稱:寶砧)、寶砧1號(hào)×桃太郎嫁接植株(簡(jiǎn)稱:桃太郎/寶砧)、桃太郎實(shí)生植株(簡(jiǎn)稱:桃太郎)。當(dāng)番茄幼苗長(zhǎng)至3葉1心時(shí)采用插接法進(jìn)行嫁接,植株成活后進(jìn)行定植。每個(gè)試驗(yàn)處理設(shè)置3組重復(fù),每組重復(fù)種植20株。番茄生長(zhǎng)管理按常規(guī)方法進(jìn)行,每間隔4 d澆透一次水。

番茄植株定植80 d后,采集根際土壤樣品。具體方法如下:以番茄植株為中心,直徑20 cm左右,挖松植株周圍土壤,然后手握植株莖底部,拔取整個(gè)植株,采用“S”形采樣方法,3株混合作為一個(gè)樣品,每個(gè)處理3次重復(fù);同時(shí)采用抖根法[21]收集附著在根系表面的土壤置于樣品袋中,放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室,于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總DNA提取、PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定分析 總DNA提取、PCR擴(kuò)增和序列分析由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。具體操作步驟如下:總DNA抽提根據(jù)FastDNA Spin Kit for Soil 試劑盒(MP Biomedicals,美國(guó))說明進(jìn)行,DNA濃度和純度使用NanoDrop2000分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific,美國(guó))檢測(cè),利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量,其中細(xì)菌使用338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')、真菌使用ITS1F(5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3')和ITS2F(5'-GCTGCGTTCTTCATCATCGATFC-3')為引物對(duì)16SrRNA基因和ITS基因的V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,最后進(jìn)行PCR產(chǎn)物鑒定、純化及定量分析。llumina MiSeq測(cè)序:將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences,美國(guó))進(jìn)行回收產(chǎn)物純化,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),并用Quantus TM Fluorometer (Promega Corporation,美國(guó))對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測(cè)。使用NEXTflex Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫,利用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司MiSeq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)整理;利用IBM SPSS Statistics 26,采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析。使用Mothur 1.30.2計(jì)算微生物群落的α多樣性;選擇相似度97%的操作分類單元(OTU)表進(jìn)行微生物群落組成和維恩圖分析,并使用R語言(3.3.1版本)工具進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、繪圖和非度量多維尺度分析(NMDS);根據(jù)分類組成的不同分組條件,使用LEfSe進(jìn)行線性判別分析(LDA),以識(shí)別各處理顯著差異的物種。利用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的I-sanger云數(shù)據(jù)平臺(tái)進(jìn)行在線數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 嫁接對(duì)番茄植株根際土壤細(xì)菌群落在不同分類水平上OTU數(shù)量的影響

由表1可知,番茄實(shí)生和嫁接植株根際土壤細(xì)菌群落OTU可歸類為37門、97綱、267目、463科、905屬、1754種。與新砧、寶砧、桃太郎處理植株相比,桃太郎/新砧和桃太郎/寶砧處理植株根際土壤細(xì)菌群落在不同分類水平上OTU數(shù)量發(fā)生明顯變化。其中,與新砧和桃太郎處理植株相比,桃太郎/新砧處理植株根際土壤細(xì)菌群落在不同分類水平上OTU數(shù)量整體減少;與寶砧和桃太郎處理植株相比,桃太郎/寶砧處理植株根際土壤細(xì)菌群落在門、綱和科分類水平上OTU數(shù)量增加,在屬分類水平上OTU數(shù)量下降。與砧木和接穗的實(shí)生植株相比,嫁接植株根際土壤細(xì)菌群落組成發(fā)生了變化,而且變化程度受砧木種類影響。

表1 嫁接對(duì)番茄植株根際土壤細(xì)菌在不同分類水平上OTU數(shù)量的影響

2.2 嫁接對(duì)番茄植株根際土壤細(xì)菌Alpha多樣性的影響

由表2可知,各處理番茄植株根際土壤細(xì)菌群落測(cè)序結(jié)果的覆蓋度均在96.0%以上,表明測(cè)序結(jié)果可以代表樣本中微生物的真實(shí)情況。嫁接植株根際土壤細(xì)菌的多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù))和豐富度指數(shù)(ACE和Chao l指數(shù))與其對(duì)應(yīng)砧木和接穗實(shí)生植株相比均差異不顯著(P>0.05,下同),僅有新砧和寶砧2種實(shí)生砧木植株間根際土壤細(xì)菌的多樣性指數(shù)差異顯著(P<0.05,下同)。不同砧木植株根際土壤細(xì)菌群落多樣性與豐富度存在顯著差異,這可能亦是不同種類砧木之間抗性存在差異的重要原因之一。

2.3 嫁接對(duì)番茄植株根際土壤細(xì)菌群落組成影響的NMDS分析

由NMDS分析結(jié)果(圖1)可知,在OTU水平上,桃太郎/新砧處理植株與新砧和桃太郎處理植株間在根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)上差異顯著,桃太郎/寶砧處理植株與寶砧和桃太郎處理植株在根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)上差異顯著,說明嫁接改變了番茄植株根際土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

2.4 嫁接對(duì)番茄植株根際土壤細(xì)菌群落組成的影響

2.4.1 門分類水平優(yōu)勢(shì)菌群分析 由圖2可知,變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、厚壁菌門(Firmicutes)、髕骨細(xì)菌門(Patescibacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和酸桿菌門(Acidobacteria)細(xì)菌是番茄嫁接和實(shí)生植株根際土壤的共有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門類(豐度占比大于1.00%,下同)。

圖2 番茄實(shí)生和嫁接植株根際土壤細(xì)菌的門分類水平組成Fig.2 Compositions of rhizosphere soil bacteria in tomato plants and grafted plants at phylum level

其中,在桃太郎/新砧處理植株根際土壤中,放線菌門和厚壁菌門細(xì)菌豐度占比均高于新砧和桃太郎處理植株;但綠彎菌門、髕骨細(xì)菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門細(xì)菌豐度占比則低于桃太郎和新砧處理植株。在桃太郎/寶砧處理植株中,綠彎菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門細(xì)菌豐度占比均高于寶砧和桃太郎處理植株;而桃太郎/寶砧處理植株根系中變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門細(xì)菌豐度占比分別為28.89%、3.59%、6.10%,均低于寶砧和桃太郎處理植株。綜上所述,嫁接改變了番茄植株根際土壤細(xì)菌群落門分類水平組成的豐度占比,而且改變程度與砧木種類有關(guān)。

2.4.2 屬分類水平優(yōu)勢(shì)菌群分析 由圖3可知,番茄嫁接和實(shí)生植株根際土壤中,共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬分類數(shù)量為16個(gè)。其中,與新砧和桃太郎處理植株相比,桃太郎/新砧處理植株根際土壤中,鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、unclassified_f__Micrococcaceae、norank_f__norank_o__Gaiellales細(xì)菌屬豐度占比提升;但norank_f__Gemmatimonadaceae、norank_f__Roseiflexaceae屬細(xì)菌豐度占比下降;與桃太郎處理植株相比,桃太郎/新砧處理植株根際土壤中增加特有優(yōu)勢(shì)菌屬棲大理石菌屬(Marmoricola)。與寶砧和桃太郎處理植株相比,桃太郎/寶砧處理植株根際土壤中,norank_f__norank_o__norank_c__Subgroup_6、類諾卡氏菌、norank_f__norank_o__norank_c__Gitt-GS-136、norank_f__norank_o__norank_c__KD4-96、norank_f__JG30-KF-CM45屬細(xì)菌豐度占比增加,同時(shí)擁有特有優(yōu)勢(shì)菌屬norank_f__norank_o__norank_c__JG30-KF-CM66;但鞘氨醇單胞菌屬、芽孢桿菌屬、德沃斯氏菌屬(Devosia)、norank_f__norank_o__Gaiellales、unclassified_f__Micrococcaceae細(xì)菌屬豐度占比下降。

圖3 番茄實(shí)生和嫁接植株根際土壤細(xì)菌的屬分類水平組成Fig.3 Compositions of rhizosphere soil bacteria in tomato plants and grafted plants at genus level

2.5 嫁接和實(shí)生番茄植株根際土壤細(xì)菌LEfSe分析

如圖4所示,通過LDA方法分析多級(jí)物種的差異,以期發(fā)現(xiàn)不同處理中差異顯著物種,結(jié)合LDA效應(yīng)值與P值比較各處理中細(xì)菌物種豐度對(duì)差異效果影響大小,篩選出差異物種(LDA score ≥ 2.0,P<0.05)。在新砧處理中發(fā)生顯著變化的細(xì)菌差異物種有4個(gè):Pseudonocardiaceae、Pseudonocardiales、Amycolatopsisg、Wandonia;在桃太郎/新砧處理中發(fā)生顯著變化的細(xì)菌差異物種有9個(gè):norank_f__Chitinophagaceae、Elsterales、Flavitalea、Gemmatirosa、Criblamydiaceae、norank_f__Criblamydiaceae、Longimycelium、unclassified_o__Elsterales、unclassified_o__Elsterales;在寶砧處理中發(fā)生顯著變化的細(xì)菌差異物種有5個(gè):Geodermatophilaceae、Iamiaceae、Iamia、unclassified_f__Rhodobacteraceae、Anaeromyxobacter;在桃太郎/寶砧處理中發(fā)生顯著變化的細(xì)菌差異物種有6個(gè):Solirubrobacteraceae、unclassified_f__Geodermatophilaceae、unclassified_f__Solirubrob acteraceae、JCM_18997、UTBCD1、Deinococcaceae;在桃太郎處理中發(fā)生顯著變化的細(xì)菌差異物種有13個(gè):Chitinophagales、Chitinophagaceae、Flavisolibacter、Hymenobacteraceae、Peredibacter、norank_f__norank_o__Chitinophagales、Bacteriovoracaceae、norank_o__Chitinophagales、norank_o__norank_c__Elusimicrobia、norank_c__Elusimicrobia、norank_f__Vermiphilaceae、Vermiphilaceae、norank_f__norank_o__norank_c__Elusimicrobia。表明,番茄嫁接處理可顯著影響植株根際土壤細(xì)菌群落的組成。

圓圈表示從門到屬的系統(tǒng)發(fā)育水平,每個(gè)圓的直徑與該組的豐度成正比;不同的前綴表示不同的級(jí)別(p:門; c:類;o:目; f:科; g:屬,下同)。Circles indicated phylogenetic levels from phylum to genus, the diameter of each circle was proportional to the abundance of the group; Different prefixes indicated different levels different levels (p:phylum; c:class,o:Order; f:Family; g:Genus. The same as below).

2.6 嫁接和實(shí)生番茄植株根際土壤細(xì)菌Venn圖分析

由圖5可知,新砧、桃太郎和桃太郎/新砧處理植株根際土壤中分別獲得4291、4096、4026個(gè)OTUs;其中,新砧、桃太郎和桃太郎/新砧處理植株根際土壤中特有OTU數(shù)量分別為253、174和156個(gè)。寶砧、桃太郎和桃太郎/寶砧處理植株根際土壤中分別獲得4006、4096、4101個(gè)OTUs;其中,寶砧、桃太郎和桃太郎/寶砧處理植株根際土壤中特有的OTU數(shù)量分別為188、217、229個(gè)OTUs。分析可知,嫁接能改變番茄植株根際土壤中OTU數(shù)量,嫁接植株根際土壤中OTU數(shù)量比實(shí)生植株增加,且不同砧木作用不同,這是嫁接增強(qiáng)植株抗性的重要原因之一。

圖5 番茄根際土壤細(xì)菌OTU分布的Venn圖Fig.5 Venn diagram of OTU distribution of rhizosphere soil bacteria in tomatoes

2.7 嫁接對(duì)番茄植株根際土壤真菌群落在不同分類水平上OTU數(shù)量的影響

由表3可知,番茄實(shí)生和嫁接植株根際土壤真菌群落OTU可歸類到12門、30綱、62目、127科、203屬、304種。與新砧、寶砧、桃太郎處理植株相比,桃太郎/新砧和桃太郎/寶砧處理植株根際土壤在不同分類水平上的真菌OTU數(shù)量發(fā)生明顯變化。其中,與新砧和桃太郎處理植株相比,桃太郎/新砧處理植株根際土壤真菌在科、屬和種分類水平上OTU數(shù)量整體增加,而在綱分類水平上OTU數(shù)量減少;與寶砧和桃太郎處理植株相比,桃太郎/寶砧處理植株根際土壤在目、科、屬和種分類水平上OTU數(shù)量整體減少。表明,與砧木或接穗實(shí)生植株相比,嫁接同樣改變了植株根際土壤真菌群落組成,變化程度受砧木種類影響。

表3 嫁接對(duì)番茄植株根際土壤真菌群落在不同分類水平上OTU數(shù)量的影響

2.8 嫁接對(duì)番茄植株根際土壤真菌Alpha多樣性的影響

由表4可知,番茄各處理植株根系的覆蓋率均在99.00%以上,表明測(cè)序結(jié)果可以代表樣本中真菌微生物的真實(shí)情況。番茄實(shí)生和嫁接植株根際土壤之間真菌的Shannon、Chaol、Heip和ACE指數(shù)均無顯著差異,表明與砧木或接穗實(shí)生植株相比,嫁接對(duì)番茄植株根際土壤真菌的多樣性和豐富度無顯著影響。

表4 番茄不同處理根際土壤真菌的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)比較

2.9 嫁接對(duì)番茄植株根際土壤真菌群落組成影響的NMDS分析

由NMDS分析結(jié)果(圖6)可知,在OTU水平上,桃太郎/新砧處理植株根際土壤真菌群落與新砧和桃太郎處理植株根際土壤真菌群落有差異,但差異不顯著;而桃太郎/寶砧處理植株根際土壤真菌群落與寶砧和桃太郎處理植株根際土壤真菌群落存在顯著差異。表明嫁接同樣改變了植株根際土壤的真菌群落結(jié)構(gòu),且變化程度與砧木種類有關(guān)。

圖6 番茄實(shí)生和嫁接植株根際土壤真菌的群落組成Fig.6 Composition of rhizosphere soil fungi communities between the roots of live and grafted tomato plants

2.10 嫁接對(duì)番茄植株根際土壤真菌群落組成的影響

2.10.1 門分類水平優(yōu)勢(shì)菌群分析 由圖7可知,子囊菌門(Ascomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、unclassified_k__Fungi門真菌是嫁接和實(shí)生番茄植株根際土壤中共有的優(yōu)勢(shì)真菌門類。與番茄實(shí)生植株相比,嫁接植株根際土壤中壺菌門真菌豐度占比提升,而子囊菌門真菌豐度占比下降。

圖7 番茄實(shí)生和嫁接植株根際土壤真菌門的分類水平組成Fig.7 Compositions of rhizosphere soil fungi in tomato plants and grafted plants at phylum level

2.10.2 屬分類水平優(yōu)勢(shì)菌群分析 由圖8可知,毛殼菌屬(unclassified_f__Chaetomiaceae)、根囊壺菌屬(Rhizophlyctis)、unclassified_c__Sordariomycetes、unclassified_k__Fungi、青霉屬(Penicillium)是番茄嫁接植株和實(shí)生植株根際土壤中共有的5個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌屬。與桃太郎和新砧處理植株相比,桃太郎/新砧處理植株根際土壤中,根囊壺菌屬、unclassified_k__Fungi、分枝孢子霉屬(Cladosporium)真菌的豐度占比增加,而毛殼菌屬真菌豐度占比下降,此外,桃太郎/新砧嫁接植株根際土壤缺失木霉屬(Trichoderma)、曲霉菌屬(Aspergillus)、unclassified_o__Eurotiales、unclassified_o__Sordariales等菌屬,但與新砧處理植株相比,增加了鐮刀菌屬(Fusarium)。與桃太郎和寶砧處理植株相比,桃太郎/寶砧處理植株根際土壤中,根囊壺菌屬、青霉屬豐度占比增加,而unclassified_k__Fungi、unclassified_c__Sordariomycetes屬真菌豐度占比下降;而桃太郎/寶砧處理植株根際土壤缺失分枝孢子霉屬、木霉屬、曲霉菌屬、鐮刀菌屬、unclassified_o__Eurotiales、蛛網(wǎng)霉屬(Arachniotus)等菌屬。

圖8 番茄實(shí)生和嫁接植株根際土壤真菌的屬分類水平組成Fig.8 Compositions of rhizosphere soil fungi in tomato plants and grafted plants at genus level

2.11 番茄實(shí)生和嫁接植株根際土壤真菌LEfSe分析

如圖9所示,通過LDA方法分析多級(jí)物種的差異,以期發(fā)現(xiàn)不同處理中差異顯著物種,結(jié)合LDA效應(yīng)值與P值比較各處理中真菌物種豐度對(duì)差異效果影響大小,篩選出差異物種(LDA score≥3.0,P<0.05)。其中,在真菌分類水平上只有新砧、桃太郎/新砧和桃太郎處理植株根際土壤中分別擁有1、6、2種顯著變化的真菌種類,而寶砧和桃太郎/寶砧處理則無顯著變化真菌種類。在新砧處理植株根際土壤中發(fā)生顯著變化的真菌差異物種為:Pleosporales;在桃太郎/新砧處理植株根際土壤中發(fā)生顯著變化的真菌差異物種包括:Dothideomycetes、Cladosporiaceae、Capnodiales、Cladosporium、Pleosporaceae、Curvularia;在桃太郎處理植株根際土壤中發(fā)生顯著變化的真菌差異物種包括:Cortinariaceae、Gymnopi-lus。結(jié)果表明,不同種類砧木與接穗嫁接處理對(duì)植株根際土壤真菌群落的影響有差異。

圖9 番茄實(shí)生和嫁接植株根際土壤真菌的LEfSe分析(LDA閾值 ≥ 3.0)Fig.9 LEfSe analysis of rhizosphere soil fungi in tomato plants and grafted plants(LDA score ≥ 3.0)

2.12 番茄嫁接和實(shí)生植株根際土壤真菌Venn圖分析

由圖10可知,新砧、桃太郎和桃太郎/新砧處理植株根際土壤中分別共獲得509、549、510個(gè)OTUs;其中,新砧、桃太郎和桃太郎/新砧處理植株根際土壤中特有的OTU數(shù)量分別為54、78和59個(gè)。寶砧、桃太郎和桃太郎/寶砧處理植株根際土壤中共獲得491、549、495個(gè)OTUs;其中,寶砧、桃太郎和桃太郎/寶砧植株根際土壤中特有的OTU數(shù)量分別為54、75、44個(gè)。嫁接改變番茄植株根際土壤OTU數(shù)量,嫁接植株根際土壤OTU數(shù)量與實(shí)生植株相比有所減少,且不同砧木作用效果不同,這是嫁接增強(qiáng)植株抗性的重要原因之一。

圖10 番茄根際土壤真菌OTU分類水平的Venn圖Fig.10 Venn diagram of OTU distribution of rhizosphere soil fungi in tomatoes

3 討 論

植物根際土壤中擁有大量微生物,被稱為植物的第二基因庫[22],且每種微生物具有不同功能,進(jìn)而可從多方面影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育[23]。植物根際微生物群落組成受多種因素的影響[24],其中植物主要通過根系代謝活動(dòng)產(chǎn)生分泌物影響根際微生物群落的組成,如:糖類、氨基酸、有機(jī)酸、植物激素、水解酶、酚類等物質(zhì);而植物根際微生物對(duì)于維護(hù)土壤健康與肥力具有重要意義,植物根際富集的有益微生物可產(chǎn)生抗菌物質(zhì)或激活植物免疫系統(tǒng),從而達(dá)到減少病原微生物危害的作用[25]。另一方面,根際微生物通過自身代謝作用促進(jìn)土壤物質(zhì)的循環(huán),進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[26]。

本研究中,在門分類水平上,番茄實(shí)生和嫁接植株根際共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門種類并未發(fā)生變化,但嫁接改變了優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門種類的相對(duì)豐度占比。其中,與桃太郎和新砧處理植株相比,桃太郎/新砧處理植株根際土壤的放線菌門和厚壁菌門豐度占比增加;與桃太郎和寶砧處理植株相比,桃太郎/寶砧嫁接植株根際土壤的綠彎菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門細(xì)豐度占比增加,這與沈仁芳和趙學(xué)強(qiáng)[19]的研究得出嫁接可以改變植株根際土壤中微生物的豐度占比的結(jié)果一致。其中酸桿菌門、放線菌門和厚壁菌門是對(duì)植物有益的菌群,酸桿菌門細(xì)菌具有分泌纖維素和木質(zhì)素降解酶,加速土壤中木質(zhì)素和纖維素降解,提升土壤碳源循環(huán)的功能[27];而放線菌門細(xì)菌在促進(jìn)植物養(yǎng)分利用、植株激素調(diào)節(jié)和維持土壤健康方面具有重要作用[28];厚壁菌門細(xì)菌在固氮、降解土壤中難溶化合物、抑制病原微生物生長(zhǎng)等方面發(fā)揮重要作用[29],表明番茄嫁接處理后通過根際土壤微生物的活動(dòng)可以創(chuàng)造更有利的環(huán)境條件。在各處理番茄植株根際土壤的優(yōu)勢(shì)真菌門類中,與實(shí)生植株相比,嫁接植株根際土壤中壺菌門豐度占比增加,而子囊菌門豐度占比減少。壺菌門真菌是一類可以游動(dòng)的真菌類型,在自然界分布廣泛,其相對(duì)豐度占比與土壤有機(jī)碳含量相關(guān)[30],同時(shí)還可以影響植物次生代謝物質(zhì)合成[31];而子囊菌門真菌則是可以引起植物病害發(fā)生[32],不利于植物的生長(zhǎng)發(fā)育,這表明嫁接不僅可以使有益微生物數(shù)量增加,還減少了有害微生物的數(shù)量,這是番茄嫁接處理可以提高植株抗病性的原因之一。

在屬分類水平上,與桃太郎和新砧實(shí)生植株相比,桃太郎/新砧處理植株根際土壤中鞘氨醇單胞菌屬、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬、unclassified_f__Micrococcaceae、norank_f__norank_o__Gaiellales細(xì)菌屬豐度占比提升;與桃太郎處理植株相比,桃太郎/新砧處理植株根際土壤增加特有優(yōu)勢(shì)棲大理石菌屬(Marmoricola)。與桃太郎和寶砧處理植株相比,桃太郎/寶砧處理植株根際土壤中norank_f__norank_o__norank_c__Subgroup_6、類諾卡氏菌、norank_f__norank_o__norank_c__Gitt-GS-136、norank_f__norank_o__norank_c__KD4-96、norank_f__JG30-KF-CM45屬細(xì)菌豐度占比增加,相反鞘氨醇單胞菌屬、芽孢桿菌屬、德沃斯氏菌屬、norank_f__norank_o__Gaiellales、unclassified_f__Micrococcaceae細(xì)菌屬豐度占比下降,同時(shí)嫁接植株根際土壤擁有特有優(yōu)勢(shì)norank_f__norank_o__norank_c__JG30-KF-CM66菌屬。鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌具有促進(jìn)土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)和降解復(fù)雜芳香族化合物的功能[33],說明嫁接處理可以有效改善番茄根際土壤中的養(yǎng)分循環(huán)以及難分解物質(zhì)的轉(zhuǎn)化;芽孢桿菌屬和鏈霉菌屬細(xì)菌通過代謝作用可以產(chǎn)生多種化合物,從而影響其他有害微生物生長(zhǎng)[34-35],表明番茄嫁接處理可以改變根際土壤微生物的群落組成,塑造更加有益的菌群。

番茄實(shí)生與嫁接植株根際土壤中有5種共有優(yōu)勢(shì)真菌屬。其中,與桃太郎和新砧處理植株相比,桃太郎/新砧處理植株根際土壤中根囊壺菌屬、unclassified_k__Fungi、分枝孢子霉屬真菌豐度占比增加;與桃太郎和寶砧處理植株相比,桃太郎/寶砧處理植株根際土壤中青霉屬、根囊壺菌屬真菌豐度占比增加。青霉屬和根囊壺菌屬真菌可以產(chǎn)生肽類、生物堿和萜類等多種次級(jí)代謝產(chǎn)物,同時(shí)還可產(chǎn)生抗生素和抑制有害病原微生物的作用[36-37];此外,與實(shí)生植株根際土壤相比,嫁接植株根際土壤中減少或缺失了具有致病作用的曲霉菌屬、鐮刀菌屬和蛛網(wǎng)霉屬等有害真菌屬,表明番茄嫁接亦可以調(diào)控根際土壤真菌群落組成,從而增強(qiáng)番茄植株的抗病性。

綜上所述,與對(duì)應(yīng)番茄實(shí)生植株相比,嫁接不僅改變了番茄植株根際土壤細(xì)菌群落組成,同時(shí)亦改變了真菌群落組成。其中,放線菌門、厚壁菌門、鞘氨醇單胞菌屬、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬、unclassified_f__Micrococcaceae、norank_f__norank_o__Gaiellales細(xì)菌是桃太郎/新砧處理植株根際土壤中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門和屬;綠彎菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、類諾卡氏菌屬、norank_f__norank_o__norank_c__Subgroup_6、norank_f__norank_o__norank_c__Gitt-GS-136、norank_f__norank_o__norank_c__KD4-96、norank_f__JG30-KF-CM45細(xì)菌是桃太郎/寶砧處理植株根際土壤中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門和屬。另外,棲大理石菌屬與norank_f__norank_o__norank_c__JG30-KF-CM66屬細(xì)菌是番茄嫁接植株根際土壤中的特有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。在真菌分類水平上,壺菌門是桃太郎/新砧和桃太郎/寶砧處理植株根際土壤中占比增加的優(yōu)勢(shì)真菌門;根囊壺菌屬、unclassified_k__Fungi、分枝孢子霉屬是桃太郎/新砧嫁接植株的根際土壤中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬,青霉屬、根囊壺菌屬是桃太郎/寶砧嫁接植株的根際土壤中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。此外,番茄嫁接植株根際土壤中還擁有比實(shí)生植株更豐富的微生物OTU數(shù)量。

4 結(jié) 論

與實(shí)生植株相比,嫁接不僅改變了番茄植株根際土壤微生物群落豐度占比,而且改變了根際土壤微生物的群落組成。番茄嫁接植株根際土壤微生物群落組成的改良是嫁接植株抗性增強(qiáng)的重要原因之一。