施用豬糞水對(duì)青脆李果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量、土壤中微生物群落與抗生素耐藥基因的影響

雷云峰,何志平,龔建軍,肖 璐,涂 騰,曾 凱,付 敏,曾祥忠

(1.四川省畜牧科學(xué)研究院,成都 610066;2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所,成都 610066)

【研究意義】中國(guó)是世界生豬生產(chǎn)和消費(fèi)第一大國(guó),為穩(wěn)定生豬生產(chǎn),保障豬肉持續(xù)供給,滿足社會(huì)對(duì)肉類(lèi)的需求,國(guó)家出臺(tái)了一系列政策和措施支持生豬產(chǎn)業(yè)發(fā)展。然而糞污處理已成為制約生豬生產(chǎn)的瓶勁,“以種定養(yǎng)、以養(yǎng)肥田”是我國(guó)當(dāng)前的糞污資源化利用的主要原則,國(guó)家層面已將糞污還田作為養(yǎng)殖廢棄物資源化利用的主要途徑。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部還開(kāi)展了綠色種養(yǎng)循環(huán)農(nóng)業(yè)試點(diǎn)工作,全國(guó)農(nóng)技中心印發(fā)了《2022年主要農(nóng)作物沼液施用技術(shù)指導(dǎo)意見(jiàn)》,對(duì)不同農(nóng)區(qū)的農(nóng)作物提出了推薦使用量和施用方法。由此可見(jiàn),畜禽糞污資源化利用是畜禽養(yǎng)殖業(yè)污染防治最為經(jīng)濟(jì)有效的途徑,也是治本之策。【前人研究進(jìn)展】將畜禽糞污施入農(nóng)田在我國(guó)具有悠久歷史,畜禽糞污本是土壤所需的優(yōu)質(zhì)有機(jī)肥料,隨著我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展,畜禽糞污未經(jīng)科學(xué)處理和利用,已成為我國(guó)農(nóng)村最重要的污染源之一[1-2],未經(jīng)處理的畜禽糞污不僅會(huì)污染空氣、水源、環(huán)境,還可傳播病原[3-4],且畜禽糞便中含有大量的氮磷化合物或添加劑中的重金屬物質(zhì),會(huì)破壞土壤的正常功能,削弱土壤凈化能力,最終導(dǎo)致土壤孔隙堵塞和板結(jié),此外,糞污中還可能殘留抗生素或抗生素耐藥基因[5-6],造成水體、沉積物、土壤等環(huán)境介質(zhì)中的耐藥基因富集[7],帶來(lái)嚴(yán)重的食品質(zhì)量安全和公共衛(wèi)生安全風(fēng)險(xiǎn),對(duì)環(huán)境污染、生態(tài)平衡、人與動(dòng)物健康造成了巨大的威脅。經(jīng)科學(xué)處理和利用的畜禽糞尿既可為作物等提供肥料,又可提高土壤中的有機(jī)質(zhì)含量和改善土壤質(zhì)量,研究表明,長(zhǎng)期施用沼液后土壤有機(jī)質(zhì)含量、全氮、堿解氮、有效磷、速效鉀等有不同程度的升高,土壤培肥效果顯著[8]。李子樹(shù),原產(chǎn)于我國(guó),有3000余年的栽培歷史,青脆李在四川的栽培歷史悠久,分布范圍廣,是四川省主栽地方品種李[9],據(jù)統(tǒng)計(jì)資料,2021年全國(guó)李子樹(shù)栽種面積達(dá)1.95×106hm2。相對(duì)于化肥成本的不斷上升,將處理后的畜禽糞便還田,既能為土壤改良提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)源,又能降低種植成本,還可提高土壤生產(chǎn)力、促進(jìn)生態(tài)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展、助力鄉(xiāng)村振興[10-13]。【本研究切入點(diǎn)】目前,對(duì)豬糞農(nóng)田利用的研究主要集中于豬糞或其堆肥產(chǎn)物用量、與其他物料配合施用以及對(duì)作物生長(zhǎng)、培肥土壤、替代化肥和影響農(nóng)田環(huán)境等方面[14-16]?！缎笄菁S污土地承載力測(cè)算技術(shù)指南》(NY-T 3877—2021)、《農(nóng)區(qū)耕地畜禽承載力評(píng)估技術(shù)規(guī)程》(DB51-T 1493—2021)等標(biāo)準(zhǔn)中,均沒(méi)有對(duì)李子樹(shù)種植園的承載力提出推薦值,《2022年主要農(nóng)作物沼液施用技術(shù)指導(dǎo)意見(jiàn)》中也沒(méi)有推薦李子樹(shù)種植園沼液的施用量,也未查閱到有關(guān)在李子樹(shù)施用豬糞水的相關(guān)研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究選擇青脆李作試驗(yàn)材料,基于田間小區(qū)試驗(yàn),以不同比例豬糞水替代化肥對(duì)李樹(shù)進(jìn)行施肥處理,比較不同豬糞水施用組對(duì)李樹(shù)果實(shí)品質(zhì)、產(chǎn)量,李樹(shù)種植土壤性質(zhì)、土壤中微生物群落變化和抗生素耐藥基因變化的差異。通過(guò)比較不同豬糞水施用比例對(duì)李樹(shù)果實(shí)品質(zhì)、產(chǎn)量,李樹(shù)種植土壤性質(zhì)、土壤中微生物群落變化和抗生素耐藥基因的影響,評(píng)估豬糞水替代化肥作為青脆李樹(shù)肥料的可行性,為全國(guó)1.95×106hm2李子樹(shù)基地科學(xué)施用貯存腐熟后的豬糞水提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

本試驗(yàn)地在四川省資陽(yáng)市樂(lè)至縣高寺鎮(zhèn)某青脆李種植基地內(nèi)。該李子園地處中緯度季風(fēng)區(qū),屬亞熱帶季風(fēng)氣候,日均氣溫16.7 ℃,年均日照1330 h,年均降水量900 mm。供試土壤類(lèi)型為石灰性紫色土。

1.2 試驗(yàn)材料

豬糞水來(lái)源于四川省資陽(yáng)市樂(lè)至縣高寺鎮(zhèn)某豬場(chǎng),并按照《畜禽糞便無(wú)害化處理技術(shù)規(guī)范》(GB/T 36195—2018)中要求,在氧化塘貯存,經(jīng)3～5個(gè)月腐熟的水泡糞原液,供試原液的平均理化性質(zhì)為pH 7.67、有機(jī)質(zhì)23%、總氮865 mg/L、總磷107 mg/L、總鉀896 mg/L;化肥選擇復(fù)合肥(24-8-13);供試果樹(shù)為長(zhǎng)勢(shì)基本一致的5年生青脆李,試驗(yàn)地灌溉條件良好。

1.3 試驗(yàn)主要儀器與試劑

核酸蛋白儀(型號(hào)為Nanodrop 2000)、Qubit熒光計(jì)(型號(hào)為Qubit 2.0 Fluorometer)均購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司;測(cè)序儀(型號(hào)為Hiseq 4000)購(gòu)自因美納公司;生物分析儀(型號(hào)為Agilent 2100 Bioanalyzer)購(gòu)自安捷倫科技(中國(guó))有限公司;凝膠電泳儀(型號(hào)為Power Pac 300)、全自動(dòng)紫外凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào)為Chemi Doc XRS+)均購(gòu)自伯樂(lè)公司。土壤基因組提取試劑盒、Qubit定量試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 試驗(yàn)分組及施肥 試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)處理,每個(gè)小區(qū)5株李樹(shù),李樹(shù)行距4 m、株距3 m,重復(fù)3次。試驗(yàn)在施用等氮量的基礎(chǔ)上調(diào)節(jié)豬糞水與化肥的比例,處理如下:F100為100%化肥對(duì)照(100%F);PS25為25%豬糞水替代化肥(25%PS+75%F),折算每次豬糞水施用量1.375 m3/667 m2;PS50為豬糞水替代50%化肥(50%PS+50%F),折算每次豬糞水施用量2.750 m3/667 m2;PS75為豬糞水替代75%化肥(75%PS+25%F),折算每次豬糞水施用量4.125 m3/667 m2;PS100為豬糞水替代100%化肥(100%PS),折算每次豬糞水施用量5.500 m3/667 m2。將豬糞水或化肥按照比例在水池中攪拌均勻后抽入糞桶,以澆灌的方式進(jìn)行施用,一年施肥3次。

1.4.2 青脆李果實(shí)品質(zhì)及產(chǎn)量測(cè)定及分析 青脆李果實(shí)成熟后,將每個(gè)小區(qū)的5株果樹(shù)上果實(shí)全部采摘稱重,并從中隨機(jī)選取60顆果實(shí),測(cè)定果實(shí)品質(zhì)。使用電子天平測(cè)定果實(shí)單果重,使用游標(biāo)卡尺測(cè)定果實(shí)橫徑,用水分分析儀測(cè)定果實(shí)水分,利用手持折光儀測(cè)定可溶性固形物含量,采用中和滴定法測(cè)定有機(jī)酸含量,采用蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖含量。數(shù)據(jù)處理采用Excel 2019和SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,采用Duncan法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。

1.4.3 土壤樣品采集 青脆李收獲后,在每個(gè)小區(qū)樹(shù)冠滴水線外圍10 cm東西南北4個(gè)方向,隨機(jī)用土鉆取4穴土壤,每穴土壤鉆取深度10 cm,將4穴土壤混勻后制成1個(gè)混合土樣。每個(gè)混合土樣用四分法分成2份備用。將各個(gè)處理不同小區(qū)采集土樣單獨(dú)送檢,分別命名為:F100A/B/C、PS75A/B/C、PS50A/B/C、PS25A/B/C、PS100A/B/C。

1.4.4 理化和生物學(xué)性質(zhì)測(cè)定 將每小區(qū)采回的混合土樣品風(fēng)干后測(cè)定其理化性質(zhì),土壤pH測(cè)定采用酸度計(jì)電位法;全氮(TN)含量測(cè)定采用用凱式定氮法;土壤有機(jī)質(zhì)(SOM)含量測(cè)定采用重鉻酸稀釋熱法,堿解氮(AN)含量測(cè)定采用堿解擴(kuò)散法,速效磷(OP)含量測(cè)定采用0.5 mol/L NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法,速效鉀(TK)含量測(cè)定采用醋酸銨-火焰光度法,土壤重金屬全量(THM)含量測(cè)定采用HCl-HNO3-HClO4消煮,重金屬有效態(tài)測(cè)定采用0.1 mol/L HCl溶液浸提,Cu、Zn含量測(cè)定采用原子吸收分光光度計(jì)。

1.5 土壤中菌群及耐藥特性的宏基因組分析

1.5.1 土壤樣品中DNA的提取 將每小區(qū)采集的土壤樣品放置于干冰泡沫箱帶回實(shí)驗(yàn)室,采用土壤基因組提取試劑盒,提取樣品DNA,采用Nanodrop核酸蛋白儀確保DNA的濃度及純度符合要求(OD260/OD280比值介于1.8～2.0)。

1.5.2 DNA文庫(kù)的構(gòu)建及檢測(cè) 依托北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行建庫(kù)和測(cè)序工作。取測(cè)定合格的DNA樣品,采用超聲破碎儀隨機(jī)將DNA片段化為約350 bp的長(zhǎng)度,再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾、加測(cè)序接頭、純化、PCR擴(kuò)增等步驟完成文庫(kù)的制備。使用Qubit2.0初步定量構(gòu)建的文庫(kù),稀釋為2 ng/μL,采用Agilent 2100檢測(cè)文庫(kù)的insert size,當(dāng)insert size符合預(yù)期后,使用熒光定量PCR對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行定量,保證文庫(kù)的有效濃度大于3 nmol/L,確保文庫(kù)質(zhì)量。

1.5.3 上機(jī)測(cè)序及數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析 待庫(kù)檢合格后,把不同文庫(kù)按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求混池后進(jìn)行Illumina HiSeq 4000測(cè)序,測(cè)序策略為PE150 bp,統(tǒng)計(jì)原始數(shù)據(jù)(Raw data)和有效數(shù)據(jù)(Clean data),并對(duì)數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行分析。提取數(shù)據(jù),獲得原始數(shù)據(jù),再進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾及質(zhì)控,去除含接頭和低質(zhì)量的讀長(zhǎng)(reads),包括:N堿基達(dá)到一定比例(設(shè)置為10 bp)、長(zhǎng)度小于40 bp、質(zhì)量值低于38、與接頭(adapter)之間重疊(overlap)超過(guò)一定閾值(設(shè)置為15 bp),再導(dǎo)入豬的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),過(guò)濾掉來(lái)自宿主豬的DNA污染,最終獲得過(guò)濾后的有效數(shù)據(jù),后續(xù)分析均基于此數(shù)據(jù)。利用SOAP denovo對(duì)有效數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝分析,將用于組裝的參數(shù)k-mer值設(shè)為55,對(duì)單個(gè)樣品進(jìn)行組裝,將得到的單樣品長(zhǎng)序列片段(saffolds)從N連接處打斷,得到不含N的序列片段(scaftigs)。保留大于500 bp的序列片段,采用MetaGene Mark進(jìn)行開(kāi)放閱讀框(ORF)預(yù)測(cè),得到的ORFs與NCBI中NR數(shù)據(jù)庫(kù)抽提出的細(xì)菌、真菌、古菌和病毒進(jìn)行序列比對(duì),參數(shù)設(shè)置期望值e-value≤1e-5,分析獲得物種注釋信息及豐度[17-19]。使用CARD數(shù)據(jù)庫(kù)提供的Resistance Gene Identifier (RGI)軟件,采用Lowest common ancestor(LCA)算法進(jìn)行ARO的注釋和豐度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)青脆李果實(shí)品質(zhì)的影響

由表1可知,從單果重來(lái)看,PS75處理單果重量最大,為(41.45±0.78) g,與PS50、PS25處理之間差異不顯著(P>0.05,下同),而顯著高于F100處理(P<0.05,下同),與PS100存在極顯著差異(P<0.01);就單果橫徑和單果體積來(lái)看,5個(gè)處理之間均不存在顯著差異。對(duì)不同施肥處理果實(shí)品質(zhì)進(jìn)行分析可知(表2),PS75處理果實(shí)水分含量最高,但與其它3個(gè)處理(PS25、PS50、PS100)的水分含量不存在顯著性差異,而PS25、PS75處理均顯著高于F100處理;維生素C含量最高為PS50處理,可溶性固形物含量和可溶性總糖最含量高的均為F100處理,但5個(gè)不同處理間不存在顯著差異?？梢?jiàn),施用豬糞水不會(huì)降低青脆李果品的品質(zhì),PS75和PS50處理可以提高青脆李果實(shí)外觀品質(zhì)。

表1 不同處理對(duì)青脆李果實(shí)外觀的影響

表2 不同處理對(duì)青脆李果實(shí)品質(zhì)的影響

2.2 不同處理對(duì)青脆李產(chǎn)量的影響

由圖1可知,就不同施肥處理青脆李產(chǎn)量結(jié)果來(lái)看,PS50處理的產(chǎn)量最高,達(dá)到(678.55±7.83) kg,與PS75、PS100處理不存在顯著差異(P>0.05),而顯著高于F100和PS25處理的產(chǎn)量(P<0.05)。可見(jiàn)PS50處理可以增加青脆李產(chǎn)量。

圖1 不同施肥處理對(duì)青脆李產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of different fertilization treatments on yield of green crisp plum

2.3 不同處理對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

土壤pH直接影響植株對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收,對(duì)于養(yǎng)分供應(yīng)及作物發(fā)育有重要意義[20-21]。土壤中有機(jī)質(zhì)包括土壤中各種形態(tài)的含碳化合物,影響土壤生產(chǎn)力、保肥及緩沖性能,是評(píng)價(jià)土壤肥力的重要指標(biāo)[22]。由表3可知,各處理間的pH變化幅度較小,土壤均呈堿性,pH 8.46～8.61,較試驗(yàn)開(kāi)始土壤pH(7.55)有明顯升高;各處理間F100處理的pH極顯著高于PS100處理(P<0.01)。各處理中全氮含量的變化幅度也較小,在0.08～0.09,而有機(jī)質(zhì)、堿解氮、有效磷、速效鉀、總砷、全銅、全鋅含量均不存在顯著性差異(P>0.05)。可見(jiàn),不同處理對(duì)青脆李生長(zhǎng)環(huán)境中土壤的基本理化指標(biāo)影響不明顯,未形成顯著的改善或影響。

表3 不同處理對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

2.4 土壤宏基因組測(cè)序結(jié)果

2.4.1 原始及有效序列統(tǒng)計(jì) 基于Illumina PE150測(cè)序策略對(duì)15份土壤樣本進(jìn)行宏基因組測(cè)序,共獲得189 721.46 Mb的原始數(shù)據(jù),過(guò)濾和質(zhì)控后得到189 499.98 Mb的有效數(shù)據(jù),總有效率達(dá)99.81%,15個(gè)小區(qū)樣品的詳細(xì)信息見(jiàn)表4。

表4 15個(gè)樣品宏基因組原始及有效數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.4.2 不同處理組樣品的菌群結(jié)構(gòu) 將15份土壤樣品測(cè)序、原始去冗后的預(yù)測(cè)基因在NCBI NR數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行注釋,共注釋4個(gè)界、198個(gè)門(mén)、192個(gè)綱、373個(gè)目、878個(gè)科、3800個(gè)屬、25 266個(gè)種。在門(mén)水平上的菌群結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2,假單胞菌門(mén)(Pseudomonadota)、放線菌門(mén)(Actinomycetota)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、Chloroflexota門(mén)、芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadota)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、Candidatus Rokubacteria門(mén)、亞硝化球菌門(mén)(Nitrososphaerota)、浮霉菌門(mén)(Planctomycetota)、硝化菌門(mén)(Nitrospirota)是優(yōu)勢(shì)菌群。5個(gè)處理樣品的優(yōu)勢(shì)菌群存在一定差異,從門(mén)水平上分析,PS100處理樣品中占比最高的為放線菌門(mén),占比24.03%,而F100、PS75、PS50、PS25處理樣品中占比最高均為假單胞菌門(mén),占比分別為18.89%、20.56%、23.59%、20.66%;從綱水平上分析,PS100處理樣品中占比最高的為放線菌綱,占比9.49%,而F100、PS75、PS50、PS25處理樣品中占比最高均為甲型變形菌綱(Alphaproteobacteria),占比分別為7.90%、8.48%、12.26%、8.57%?？梢?jiàn),土壤樣品中的優(yōu)勢(shì)菌群在門(mén)分類(lèi)級(jí)別上呈現(xiàn)出一定的差異,其中PS100處理菌群與其他處理存在明顯的差異。說(shuō)明,不同施肥處理方式會(huì)引起果樹(shù)種植土壤菌群的組成差異。

圖2 不同處理土壤細(xì)菌門(mén)水平相對(duì)豐度Fig.2 Relative abundance of bacterial phylum in soil under different treatments

2.4.3 不同處理中ARO的耐藥特性分析 通過(guò)對(duì)5個(gè)試驗(yàn)小區(qū)的15份土壤樣品中各耐藥類(lèi)型ARO數(shù)量分析發(fā)現(xiàn),樣品中檢出的ARO豐富多樣,15個(gè)土壤樣品中共檢出39種ARO,其中不同施肥處理F100、PS25、PS50、PS75、PS100檢出的ARO種類(lèi)數(shù)量分別為20、27、33、34、35種。本次檢出的39種ARO涉及糖肽類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、磷霉素類(lèi)、磺胺類(lèi)、外排泵類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、利福霉素類(lèi)7類(lèi)常見(jiàn)抗生素耐藥類(lèi)型及其他耐藥類(lèi)型(表5),其中,糖肽類(lèi)ARO檢出種類(lèi)最多,共檢出16種,占總檢出數(shù)的41.03%,包括vanY、vanX和vanW的變體;四環(huán)素類(lèi)7種,均為tet系列ARO,占總檢出數(shù)的17.95%;磷霉素類(lèi)和外排泵類(lèi)均4種,磺胺類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)各2種,利福霉素類(lèi)1種,其他類(lèi)ARO主要包括otrA、rpsL、rsmA。

表5 土壤中ARO類(lèi)別

由表6可知,本研究檢出的39種ARO共對(duì)應(yīng)5種抗生素耐藥機(jī)制類(lèi)型,包括:抗生素外排泵(Antibiotic efflux)、抗生素失活(Antibiotic inactivation)、抗生素靶點(diǎn)保護(hù)(Antibiotic target protection)、抗生素靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)改變(Antibiotic target alteration)、抗生素靶點(diǎn)替代(Antibiotic target replacement),其中抗生素靶點(diǎn)保護(hù)占比最高,達(dá)46.2%(18/39),其次分別為抗生素外排泵,達(dá)20.5%(8/39);抗生素失活,達(dá)17.9%(7/39);抗生素靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)改變,達(dá)12.8%(5/39),僅磺胺類(lèi)的dfrA16對(duì)應(yīng)抗生素靶點(diǎn)替代。從不同施肥處理檢出ARO分析可知,F100、PS25、PS50、PS75、PS100處理分別檢出25、26、34、35、35種ARO,所有樣品中均檢出的ARO有23種,包括糖肽類(lèi)11種ARO(vanYM、vanYG、vanYF、vanYB、vanYA、vanWI、vanWG、vanWB、vanTG、vanHO和vanG),磷霉素類(lèi)4種ARO(FosXCC、FosI、FosA8和murA),四環(huán)素類(lèi)2種ARO(tetM、tetW/N/W),外排泵類(lèi)3種ARO(qacJ、qacG、adeF),利福霉素類(lèi)helR以及其他類(lèi)的otrA、rpsL。而磺胺類(lèi)的dfrA16及銅綠假單胞菌毒力的基因rsmA在含豬糞便的PS100、PS75、PS50及PS25施肥處理中均有檢出,而在F100全化肥施肥處理中未檢出。

由圖3可知,PS100處理ARO的相對(duì)豐度和最高,達(dá)到212.72～223.44 ppm,而PS75、PS50和PS25處理的ARO相對(duì)豐度和值波動(dòng)幅度較小,在132.21～159.94 ppm,而F100處理的ARO相對(duì)豐度較添加豬糞的4個(gè)處理相對(duì)偏低,在101.19～126.64 ppm。此外,本研究采集樣品中ARO種類(lèi)達(dá)39種,但大部分ARO的相對(duì)豐度并不高,糖肽類(lèi)ARO的相對(duì)豐度占各樣品相對(duì)豐度總和的85.79%～95.37%,故糖肽類(lèi)ARO是采集各施肥處理組土壤中的主要ARO。將PS50和PS25處理相比,兩處理的ARO種類(lèi)分別為34、26種,ARO相對(duì)豐度和分別為132.21～159.94、141.45～161.21 ppm,對(duì)應(yīng)的耐藥機(jī)制均為5種,故PS50處理的ARO相對(duì)豐度和稍低于PS25處理,而PS50處理的ARO種類(lèi)又高于PS25處理;將PS50和PS75處理相比,ARO種類(lèi)分別為34、35種,ARO相對(duì)豐度和值分別為132.21～159.94、146.92～157.40 ppm,對(duì)應(yīng)的耐藥機(jī)制也均為5種,PS50處理的ARO相對(duì)豐度和低于PS75處理,且PS50處理的ARO種類(lèi)低于PS70處理。因此,從ARO種類(lèi)、豐度和耐藥機(jī)制的角度考慮,PS50和PS25處理均可作為施肥備選方式?？梢?jiàn),不同處理對(duì)青脆李生長(zhǎng)環(huán)境中土壤中的ARO具有一定的影響,豬糞水的施用量與環(huán)境土壤中ARO的種類(lèi)與相對(duì)豐度存在一定的正相關(guān)關(guān)系,PS50和PS25處理是替代化肥比較適宜的方式。

圖3 不同施肥處理組中土壤ARO的相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of soil ARO in different fertilization groups

3 討 論

3.1 不同處理對(duì)青脆李果實(shí)品質(zhì)的影響

科學(xué)施肥是實(shí)現(xiàn)豐產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的基礎(chǔ),施肥與果皮的外觀品質(zhì)具有密切聯(lián)系,肥料種類(lèi)和施肥量等均可影響果實(shí)品質(zhì)[23-24]。影響青脆李果實(shí)外觀和品質(zhì)的重要指標(biāo)包括果實(shí)大小、水分含量、維生素C、可溶性固形物及可溶性糖等。李雪玲等[25]研究農(nóng)家肥、緩釋肥及菌渣對(duì)安哥諾李李園的施肥效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)農(nóng)家肥可極顯著提高安哥諾李果實(shí)中鋅、鎂和可溶性固形物的含量,提高25.63%～82.61%。張志林等[26]發(fā)現(xiàn)有機(jī)肥替代化肥能顯著提高三華李果實(shí)品質(zhì),在增加果實(shí)維生素C和可溶性固形物含量的同時(shí),有效降低可滴定酸含量,50%無(wú)機(jī)肥N+50%有機(jī)肥N處理的效果更好。在本研究中,通過(guò)對(duì)李樹(shù)果實(shí)單果重、單果橫徑、單果體積等外觀指標(biāo),李樹(shù)產(chǎn)量、水分、維生素C、可溶性固形物、可溶性總糖等果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定,發(fā)現(xiàn)不同比例豬糞水施肥處理之間青脆李果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量的變化存在一定差異,其中PS75、PS50施肥組青脆李果實(shí)外觀品質(zhì)均較優(yōu),且PS50施肥組的維生素C含量最高。可見(jiàn),施用豬糞水替代部分化肥,能滿足青脆李生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)氮磷鉀三大元素及其他微量元素的需求,促進(jìn)植株對(duì)養(yǎng)分的吸收,且不會(huì)降低青脆李果品的品質(zhì)。

3.2 不同處理對(duì)青脆李產(chǎn)量的影響

作物的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)與生產(chǎn)過(guò)程中的水肥管理密不可分,若一味追求產(chǎn)量,大量施用化肥,而忽視有機(jī)肥的投入,可能導(dǎo)致農(nóng)田耕作層土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)破壞、減少,從而直接影響作物的生產(chǎn)能力[27]。鄭明強(qiáng)[28]通過(guò)對(duì)有機(jī)肥不同施用量對(duì)脆紅李產(chǎn)量及經(jīng)濟(jì)效益的影響,發(fā)現(xiàn)750 kg/hm2無(wú)機(jī)復(fù)合肥投入的前提下,配施12.0 t/hm2商品有機(jī)肥施用效果最佳,單產(chǎn)可達(dá)31 549.05 kg/hm2。張志林等[26]發(fā)現(xiàn),以有機(jī)肥替代化肥可以顯著提高三華李果園土壤養(yǎng)分、果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì),其中,50%無(wú)機(jī)肥N+50%有機(jī)肥N處理的效果更佳,產(chǎn)量達(dá)57 497.55 kg/hm2。在本研究中,也是PS50處理組青脆李的產(chǎn)量最高,這可能是因?yàn)橛袡C(jī)肥含有豐富的營(yíng)養(yǎng)元素,施入土壤后可持續(xù)提供李生長(zhǎng)發(fā)育所需的各種養(yǎng)分和活性物。

3.3 不同處理對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

土壤的物理和化學(xué)特性是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的基本指標(biāo)[29],土壤中所儲(chǔ)存的氮、磷、鉀、鈣、鎂等礦質(zhì)元素是植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要養(yǎng)分來(lái)源,但盲目、過(guò)量施用化肥可能導(dǎo)致土壤出現(xiàn)酸化、板結(jié)、養(yǎng)分流失等問(wèn)題[30-31]。趙躍等[32]研究表明,施用不同量的有機(jī)肥均可以提高土壤中有機(jī)質(zhì)、堿解氮、速效磷和速效鉀含量。但本研究中,各處理中青脆李生長(zhǎng)環(huán)境下土壤基本理化指標(biāo)變化幅度較小,其中,pH和全氮含量在各組間雖存在一定差異,但整體差異較小,而有機(jī)質(zhì)、堿解氮、有效磷、速效鉀、總砷、全銅、全鋅等指標(biāo)均不存在顯著性差異,可見(jiàn),與施用化肥相比,施用豬糞水對(duì)青脆李生長(zhǎng)環(huán)境下土壤中有機(jī)質(zhì)含量、氮、磷、鉀等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累和土壤養(yǎng)分等影響不明顯,究其原因可能與肥料特性有關(guān),化肥能迅速提高土壤速效養(yǎng)分含量但容易淋溶,而有機(jī)肥中的養(yǎng)分需經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的降解才能充分釋放。

3.4 土壤宏基因組測(cè)序結(jié)果分析

抗生素、動(dòng)物源性細(xì)菌及其耐藥基因在堆肥處理后仍可能有部分殘留,并在土壤中逐漸遷移或擴(kuò)散到較深的土壤層和地下水中,這種轉(zhuǎn)移過(guò)程不僅會(huì)改變土壤微生物的群落結(jié)構(gòu),同時(shí)還直接影響土壤活性[33]。土壤宏基因組測(cè)序分析結(jié)果顯示,豬糞水澆灌會(huì)引起果樹(shù)周?chē)寥谰旱慕M成差異,改變土壤中的優(yōu)勢(shì)菌群,PS100處理組占比最高的為放線菌門(mén),而F100、PS75、PS50、PS25處理組樣品中占比最高均為假單胞菌門(mén),但豬糞水的施加并不會(huì)顯著提高微生物菌群多樣性,盡管各組中優(yōu)勢(shì)菌群出現(xiàn)了變化,但菌群種類(lèi)并無(wú)差異,這與郭巨先等[34]研究結(jié)果類(lèi)似。本研究通過(guò)宏基因組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),本次送檢樣品中共檢出39種ARO,涉及7種抗生素耐藥基因類(lèi)別,對(duì)應(yīng)5種抗生素耐藥機(jī)制,隨著豬糞水施用比例的增加,土壤中ARO的種類(lèi)數(shù)量呈增加趨勢(shì),通過(guò)對(duì)PS75、PS50、PS25處理檢出ARO種類(lèi)、ARO相對(duì)豐度和值、對(duì)應(yīng)的耐藥機(jī)制種類(lèi)等綜合考慮,PS50與PS25處理均可作為施肥備選方式。此外,值得注意的是,有vanYM等11種糖肽類(lèi)、FosXCC等4種磷霉素類(lèi)、tetM等2種四環(huán)素類(lèi)、qacJ等3種外排泵類(lèi)、利福霉素類(lèi)helR等23種ARO在所有采集樣品中均檢出,而磺胺類(lèi)的dfrA16及銅綠假單胞菌毒力的基因rsmA在含豬糞便的施肥處理中均有檢出,尤其是murA及helR這2種結(jié)核病相關(guān)ARO在所有樣品中均存在,murA為磷霉素靶位蛋白基因,是結(jié)核分枝桿菌中磷霉素特異性耐藥基因,而helR是一種解旋酶樣蛋白,是利福霉素的特異性ARO,利福平是治療結(jié)核病的重要藥物。但豬糞供試養(yǎng)殖場(chǎng)自2020年運(yùn)行以來(lái),除少量用過(guò)磺胺類(lèi)藥物,從未使用過(guò)上述其他藥物,而該果園在試驗(yàn)前有在其他養(yǎng)殖場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)牛羊糞進(jìn)行施用,園內(nèi)除試驗(yàn)地外其他果樹(shù)在試驗(yàn)期也偶有施用牛羊糞,不排除上述耐藥基因來(lái)源于前期的殘留或遷移。各養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)抗菌藥物臨床應(yīng)用管理,進(jìn)一步規(guī)范獸醫(yī)抗生素的使用,嚴(yán)格遵守用藥和休藥期要求,做到合理用藥、規(guī)范用藥、科學(xué)用藥。

4 結(jié) 論

用腐熟后的豬糞水替代部分化肥,在李子樹(shù)基地施用是可行的。綜合青脆李品質(zhì)、產(chǎn)量、土壤質(zhì)量、細(xì)菌耐藥基因特性等因素,采用PS50處理方式(50%豬糞+50%化肥)作為青脆李施肥處理的最佳方式:每次施用2.750 m2/667 m2,每年施3次,分別在萌芽、壯果、冬前施用。在實(shí)際生產(chǎn)中商品化肥與腐熟后豬糞水有機(jī)肥的合理搭配施用對(duì)青脆李和生豬的生產(chǎn)都具有重要意義,可一定程度上提升李子的產(chǎn)量和品質(zhì),同時(shí)有效消納腐熟后豬糞水,實(shí)現(xiàn)雙贏。