“金花”菌的分離鑒定及其對(duì)紫娟紅茶發(fā)酵品質(zhì)的影響

周祎煒，燕飛，2，3，4 ，曲東，2，4，李新生，2，3，4，謝侗，閆瑞瑞，習(xí)林杰，2，陳小華，2，3，4，趙璇，2，3，4

（1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 漢中 723000；3.陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 漢中 723000；4.陜西省“四主體一聯(lián)合”茶產(chǎn)業(yè)校企聯(lián)合研究中心，陜西 漢中 723000）

“紫娟”是云南省農(nóng)科院茶葉研究所于1985 年利用云南大葉群體國家級(jí)茶樹良種單株培育而成，因其芽尖、葉片、莖干、花萼、花梗和茶湯等多為紫紅色而得名[1]。茶樹鮮葉常用于制作干茶，具有較高的飲用價(jià)值及色素利用價(jià)值，其中的花色苷、總黃酮、咖啡因和鋅含量均高于大葉茶。此外，大量研究表明，紫娟茶還具有降血壓、降血糖、保護(hù)肝臟、增強(qiáng)記憶力、影響脂類代謝和抗氧化等作用。但紫娟綠茶湯色偏暗紫，相較于綠茶，紫娟茶鮮葉更適合制作紅茶。而高花青素含量又會(huì)讓茶湯產(chǎn)生澀感，“紫娟”制作的生茶澀感明顯、草香強(qiáng)烈，口腔有收斂，相較于其他品種茶葉其品質(zhì)與飲用口感欠佳。

“金花”菌是茯磚茶“發(fā)花”過程中形成的優(yōu)勢菌種，是目前研究較深入的發(fā)酵類真菌。茶葉經(jīng)“金花”菌發(fā)酵后，具有改善茶湯滋味與香氣、賦予茶葉多種活性生理功能的作用。人們最早從茯磚茶中發(fā)現(xiàn)了“金花”菌的存在，研究發(fā)現(xiàn)，“金花”菌可以使茶葉在發(fā)酵過程中布滿金黃色顆粒狀的“金花”，賦予茶葉獨(dú)特的風(fēng)味與滋味。齊祖同等[2]從茯磚茶中分離出優(yōu)勢菌株并通過形態(tài)學(xué)鑒定其為冠突散囊菌（Eurotirmcrstatum），它的無性型是針刺曲霉（AsperilusspiculosusBlaser），異名是冠突曲霉（A.crstatusRaper&Fenel）。劉作易等[3]對(duì)不同來源茯磚茶上的“金花”菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)茯磚茶中優(yōu)勢菌種為灰綠曲霉組謝瓦曲霉間型變種（A.Chevalierivar.intermediusThomandRaper）。Wang 等[4]通過多重聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）鑒定，從六堡茶中分離鑒定出一株優(yōu)勢菌為謝瓦曲霉。由于相似的特征，且同樣都能在茶葉中生長并產(chǎn)生金黃色的閉囊殼，因此，“金花”茶中的金色顆粒數(shù)量成為評(píng)價(jià)“金花”茶感官和品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的茯磚茶與“金花”黑茶相較于普通黑茶，具有更強(qiáng)的抗氧化功效，這也使得“金花”菌在茶葉中的應(yīng)用逐漸受到關(guān)注。現(xiàn)階段，“金花”菌發(fā)酵茶的接種方法主要為自然發(fā)花和人工接種發(fā)花兩種，自然發(fā)花多應(yīng)用于茯磚茶、六堡茶等傳統(tǒng)壓磚茶的生產(chǎn)，而人工接種發(fā)花技術(shù)主要以固體發(fā)酵菌劑與孢子懸液接種為主，人工發(fā)花技術(shù)相較于傳統(tǒng)的自然發(fā)花技術(shù)而言，具有污染率低、可控性高、生產(chǎn)周期較短的優(yōu)點(diǎn)。本研究為降低污染與縮短發(fā)酵周期，利用從茯茶中分離得到的“金花”菌，對(duì)紫娟紅茶進(jìn)行單菌株固態(tài)發(fā)酵，探究“金花”菌發(fā)酵對(duì)紫娟紅茶主要成分與活性的影響，以期為紫色茶樹資源的深加工及其營養(yǎng)活性功效開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茯磚茶：陜西怡澤茯茶有限公司；紫娟茶鮮葉：采自陜西省漢中市特殊教育園藝圃試驗(yàn)地茶園并采用傳統(tǒng)紅茶工藝加工制成。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dwxtrose agar，PDA）、馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蘆丁、甲醇、磷酸、福林酚、乙腈（均為色譜純）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：美國Sigma公司；沒食子酸（gallic acid，GA）（純度≥99%）：上海麥克林生化科技有限公司；L-茶氨酸（純度≥99%）：北京百靈威科技有限公司；兒茶素（catechin，C）、表兒茶素（epicatechin，EC）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、表沒食子酸兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、表沒食子酸酯兒茶素（epigallocatechin，EGC）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）、沒食子酸兒茶素（gallocatechin，GC）（純度均≥98%）：上海同田生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

H1850R 低溫冷凍離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；BH-2 光學(xué)顯微鏡：日本奧林巴斯公司；1260 高效液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；BMJ-160C 霉菌培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-2D 型超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；ULD1602012 紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；SMY-2000 色差儀：北京盛名揚(yáng)科技開發(fā)有限責(zé)任公司；JY-6CHZ-1B 型茶葉烘焙機(jī)：福建佳友茶葉機(jī)械智能科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 “金花”菌的分離純化、形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定

“金花”菌的分離純化、形態(tài)學(xué)觀察以及基因測序參考張?jiān)碌萚5]的方法?！敖鸹ā本蛛x于涇陽散裝茯磚茶，并命名為JH-1。將純化菌株接種于PDA 培養(yǎng)基，于28 ℃恒溫培養(yǎng)10 d，觀察、記錄菌落的生長狀況，并通過光學(xué)顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建采用鄰接法（neighbor-joining algorithm，NJ），選擇全部位點(diǎn)構(gòu)建系統(tǒng)樹，自展值（Bootstrap）1 000 次檢驗(yàn)。

1.3.2 孢子懸液制備

取單菌落PDA 培養(yǎng)基，在無菌操作條件下，用接種環(huán)將黃色閉囊殼刮下，懸浮于150 mL 裝有玻璃珠的無菌水中，置于搖床1 min 使菌均勻分散，調(diào)整孢子液濃度為1×108CFU/mL，將“金花”菌孢子引種至含200 mL 液體PDB 培養(yǎng)基的錐形瓶中，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)置為180 r/min，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，冷藏備用。

1.3.3 紫娟“金花”茶樣品的制備

“金花”散茶的制備參考Xu 等[6]的方法并稍作修改，基本工藝流程：紫娟紅茶→稱樣→復(fù)水→滅菌（汽蒸）→接種→發(fā)花→干燥→“金花”散茶。

每組取50 g 紫娟紅茶（共5 組），置于250 mL 錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min，在室溫下放置30 min 后，使用“金花”菌孢子懸液（接種量為35%）接種5 組滅菌紫娟紅茶，紫娟紅茶組作為對(duì)照組進(jìn)行指標(biāo)測定。調(diào)整含水量至60%，使茶葉充分濕潤，在28 ℃的霉菌培養(yǎng)箱中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，每2 d 取出一組。在60 ℃茶葉烘焙機(jī)中干燥3 h，得到茶樣，發(fā)酵10 d 后取出全部樣品，分別為紫娟紅茶組（對(duì)照組）、發(fā)酵0 d 組、發(fā)酵2 d組、發(fā)酵4 d 組、發(fā)酵6 d 組、發(fā)酵8 d 組、發(fā)酵10 d 組。

1.3.4 發(fā)酵茶“金花”菌數(shù)量測定

參照GB 4789.15—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》中的方法，對(duì)各發(fā)酵茶樣“金花”菌及其他真菌數(shù)量進(jìn)行測定。

1.3.5 發(fā)酵茶色差測定

茶湯的制作：取烘干茶樣3 g，加入煮沸蒸餾水120 mL 沖泡5 min，趁熱過濾，將濾液采用煮沸蒸餾水定容至150 mL。濾液冷卻至室溫，用色差儀測定，3 次重復(fù)。其中，L*值代表明度；a*值代表紅綠色度，正值表示紅色程度，負(fù)值表示綠色程度；b*值代表黃藍(lán)色度，正值表示黃色程度，負(fù)值表示藍(lán)色程度。△E*值代表總色差，它通常是以數(shù)值的形式表示的色差，即兩種顏色之間的差異程度。

1.3.6 功能成分含量及抗氧化活性的測定

茶多酚、兒茶素含量參考GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》測定；水浸出物含量參考GB/T 8305—2013《茶水浸出物測定》測定；總花青素含量采用酸性乙醇提取并利用分光光度法進(jìn)行測定[7]；總黃酮含量采用三氯化鋁比色法測定；游離氨基酸含量參考GB/T 8314—2013《茶游離氨基酸總量的測定》測定；茶色素含量參考紅茶色素系統(tǒng)分析法測定?？寡趸钚裕―PPH 自由基清除率、ABTS+自由基清除率）參考張波[8]的方法進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 “金花”菌的鑒定結(jié)果

2.1.1 菌落形態(tài)結(jié)構(gòu)特征

“金花”菌的菌落形態(tài)結(jié)構(gòu)特征如圖1 所示。

圖1 “金花”菌的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of 'golden-flower' fungus

由圖1 可知，在PDA 培養(yǎng)基28 ℃溫度下培養(yǎng)10 d，前4 d 菌落生長較平整且分布稀疏，形態(tài)為完整的同心圓，顏色整體為淺黃色，由里到外依次為土黃色、白色，菌落中央有棕黃色的菌核，邊緣整齊；背面整體為棕黃色，周圍呈土黃色，外圍呈白色。第6~10 天，菌落稀疏較平，表面形態(tài)變?yōu)榻q粉狀，顏色從內(nèi)到外變淺，依次為黑棕色、棕色、土黃色，同時(shí)產(chǎn)生的菌核顏色明顯加深，培養(yǎng)皿出現(xiàn)無色透明水珠；背面整體呈現(xiàn)黑棕色，周圍土黃色，菌落中間稍有皺縮。通過菌落形態(tài)特征將JH-1 初步鑒定為曲霉屬真菌。

2.1.2 顯微鏡形態(tài)結(jié)構(gòu)特征

菌株在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)特征如圖2 所示。

圖2 菌株在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of strain under light microscope

由圖2 可知，JH-1 菌株分生孢子形態(tài)呈球形或橢圓形，顏色為暗黃色；子囊果呈球形或近球形，具有豐富的隔菌絲與子囊果，子囊果相互纏繞，并伴生在菌絲間，內(nèi)部含有豐富的子囊。隨著菌株的生長發(fā)育，子囊果破裂釋放出子囊，成熟后釋放子囊孢子。結(jié)合菌落形態(tài)與光學(xué)顯微鏡結(jié)果可知JH-1 菌株為曲霉屬真菌，觀察結(jié)果與黃浩等[9]的研究結(jié)果一致。冠突曲霉、謝瓦曲霉和阿姆斯特丹曲霉在形態(tài)特征上類似，均能形成黃褐色閉囊殼[4]。冠突曲霉和謝瓦曲霉之間的區(qū)別僅在于前者真菌子囊孢子凸面較為粗糙而后者較光滑，推測可能與冠突曲霉子囊孢子發(fā)育的成熟程度有一定的關(guān)系。

2.1.3 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔（internal transcribed spacer，ITS）序列比對(duì)結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育樹

優(yōu)勢菌株ITS PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析及系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3、圖4 所示。

圖3 優(yōu)勢菌株ITS PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析Fig.3 Electrophoretic analysis of ITS PCR amplification products of dominant strain

圖4 鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed by adjacent method

由圖3 可知，利用通用引物NS1 和ITS4 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增獲得菌株內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1 和2，測序顯示，菌株P(guān)CR 長度為533 bp，且呈現(xiàn)單一、明亮的條帶，表明分離得到的菌株DNA 純度較高、無污染。通過ITS 在NCBI 上blast 比對(duì)，結(jié)果顯示，該菌株JH-1 序列與數(shù)據(jù)庫中謝瓦曲霉、冠突曲霉、阿姆斯特丹等序列同源性達(dá)到99% 以上，然后將JH-1 菌株基因序列測序結(jié)果分別與曲霉屬曲霉組內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)菌株的相應(yīng)序列進(jìn)行Clusta W 比對(duì)。由圖4 可知，JH-1 菌株與謝瓦曲霉（Aspergilluschevalieri）標(biāo)準(zhǔn)菌株MH859013.1 聚為一支，且自展支持率為100%。因此，綜合菌落形態(tài)特征、光學(xué)顯微結(jié)構(gòu)特征、ITS 區(qū)序列比對(duì)以及多基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析，綜合鑒定菌株JH-1 為謝瓦曲霉。

2.2 發(fā)酵茶中“金花”菌數(shù)量分析

“金花”菌的數(shù)量和質(zhì)量一般作為判斷茯磚茶質(zhì)量好壞的直接標(biāo)準(zhǔn)。紫娟紅茶發(fā)酵過程中發(fā)花情況及孢子數(shù)量見表1。

表1 紫娟紅茶發(fā)酵過程中發(fā)花情況及孢子數(shù)量Table 1 Situation of 'flowering' and number of spores during fermentation of Zijuan black tea

由表1 可知，發(fā)酵2 d 組謝瓦曲霉菌數(shù)量最少，為15.0 CFU/g，發(fā)酵8 d 組和發(fā)酵10 d 組茶樣中謝瓦曲霉數(shù)量均達(dá)到105CFU/g，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，謝瓦曲霉數(shù)量呈指數(shù)倍增長。紫娟紅茶“金花”菌數(shù)量超過2×105CFU/g，達(dá)到GB/T 32719.5—2018《黑茶第5 部分：茯茶》的規(guī)定。

2.3 不同發(fā)酵階段茶湯色澤的變化

色差儀通過模擬人眼辨別顏色的過程，利用三變數(shù)原理，可以消除在判別顏色的過程中因主觀因素造成的誤差，對(duì)茶湯色澤的測定更加精準(zhǔn)[10]。在紫娟紅茶發(fā)酵過程中，2 d 取樣一次并測定發(fā)酵茶茶湯的色差值。不同發(fā)酵階段茶湯色差的變化見表2，不同發(fā)酵時(shí)間紫娟紅茶茶湯見圖5。

表2 不同發(fā)酵階段茶湯色差的變化Table 2 Changes of color difference of tea soup in different fermentation stages

由表2、圖5 可知，對(duì)照組茶湯外觀亮度L*值為22.45，顯著低于發(fā)酵0、2、4、6 d 組，說明“金花”茶發(fā)酵工藝對(duì)紫娟紅茶湯色色澤的影響明顯，原因可能是復(fù)水與汽蒸使紫娟紅茶中的色素物質(zhì)浸出和分解，從而導(dǎo)致發(fā)酵前期（0~6 d）試驗(yàn)組茶湯亮度L*值顯著大于對(duì)照組。隨發(fā)酵時(shí)間的延長，L*值下降趨勢明顯，說明發(fā)酵對(duì)茶湯亮度變化影響較大，發(fā)酵結(jié)束時(shí)L*值為14.87。對(duì)照組紅綠色度a*值為23.59，呈亮黃色，顯著高于發(fā)酵0~4 d 組，與發(fā)酵6 d 組差異不顯著。發(fā)酵0~2 d，a*值降低，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵4~10 d，a*值增加，發(fā)酵結(jié)束時(shí)的a*值為32.88，此時(shí)的茶湯呈紅褐色。b*值代表黃藍(lán)色度，發(fā)酵0 d 組的b*值為29.24，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，b*值的變化呈現(xiàn)總體波動(dòng)上升的趨勢，發(fā)酵結(jié)束時(shí)b*值增長至53.21。2~4 d 和8~10 d 的△E*值變化較顯著，說明這兩個(gè)時(shí)期發(fā)酵過程中色素物質(zhì)變化較劇烈，發(fā)酵8~10 d 茶湯呈現(xiàn)紅褐色，與對(duì)照組相比變化明顯。

2.4 不同發(fā)酵階段功能成分含量及抗氧化活性分析

2.4.1 茶多酚含量的變化

茶多酚是茶葉中多酚物質(zhì)的混合物，是茶葉的主要代表物質(zhì)，同時(shí)也是茶葉中澀味的主要來源之一[11]，茶多酚含量影響著茶葉醇和滋味與茶湯色澤的形成。紫娟紅茶發(fā)酵過程中茶多酚含量的變化見圖6。

圖6 紫娟紅茶發(fā)酵過程中茶多酚含量的變化Fig.6 Changes of tea polyphenol content during fermentation of Zijuan black tea

由圖6 可知，在發(fā)酵過程中茶多酚含量總體呈下降趨勢，與對(duì)照組相比，發(fā)酵0 d 組茶多酚含量顯著降低2.2%。可能是因?yàn)榘l(fā)酵茶制作過程中，在汽蒸工藝的影響下，高溫、高壓導(dǎo)致茶多酚在發(fā)酵初期發(fā)生氧化和分解。與對(duì)照組相比，茶多酚含量下降最多的是發(fā)酵10 d 組，下降了6.01%。這種變化主要是因?yàn)橹x瓦曲霉在生長代謝過程中分泌出大量多酚氧化酶、過氧化物酶等胞外酶，將茶多酚轉(zhuǎn)化為茶黃素、茶紅素等呈色物質(zhì)；同時(shí)，在發(fā)酵過程中，由于高濕、高溫的作用，茶多酚發(fā)生非酶促反應(yīng)、自動(dòng)水解等反應(yīng)，也會(huì)導(dǎo)致茶多酚含量的下降。隨著發(fā)酵程度的加深，紫娟紅茶茶多酚含量明顯降低，進(jìn)而使茶湯滋味逐漸醇和、甘厚。

2.4.2 兒茶素含量的變化

兒茶素又稱茶單寧，是茶葉中的主要功能成分，占茶葉干物質(zhì)質(zhì)量的12%~24%，同時(shí)也是茶葉苦澀滋味的主要來源之一[12]。利用液相色譜法對(duì)紫娟紅茶發(fā)酵過程中的兒茶素單體含量進(jìn)行測定，結(jié)果如表3 所示。

表3 紫娟紅茶發(fā)酵過程中各類兒茶素含量的變化Table 3 Changes of catechin content during fermentation of Zijuan black tea

由表3 可知，部分兒茶素含量出現(xiàn)了不同程度的下降，與對(duì)照組相比，發(fā)酵10 d 組C、EGC、GC、GCG、EGCG 含量均顯著下降（p<0.05），降幅分別為69.6%、55.6%、23.2%、41.5%、81.1%，其中EGCG 下降最為明顯，兒茶素中ECG 在發(fā)酵過程中降幅最小。非酯型兒茶素與酯型兒茶素比值的大小是影響茶湯滋味品質(zhì)是否醇和苦澀的重要指標(biāo)之一，由于微生物強(qiáng)烈的代謝反應(yīng)，同時(shí)在濕熱的影響下，導(dǎo)致兒茶素發(fā)生氧化和異構(gòu)化轉(zhuǎn)化等化學(xué)反應(yīng)，從而使大量酯型兒茶素降解為簡單兒茶素[13]，發(fā)酵10 d 組較對(duì)照組非酯型兒茶素與酯型兒茶素比值增大了133.2%，二者比值的增大而使發(fā)酵茶滋味醇和，苦澀味減輕。

2.4.3 水浸出物含量的變化

茶葉的滋味通常是由茶多酚、可溶性糖、氨基酸、咖啡堿等水溶性物質(zhì)構(gòu)成的一種多味復(fù)合體。紫娟紅茶發(fā)酵過程中水浸出物含量的變化見圖7。

圖7 紫娟紅茶發(fā)酵過程中水浸出物含量的變化Fig.7 Change of water extract content during fermentation of Zijuan black tea

由圖7 可知，發(fā)酵0~2 d，水浸出物含量顯著上升（p<0.05），這可能是因?yàn)槲⑸镌谏L過程中，為了滿足自身所需不斷進(jìn)行養(yǎng)分?jǐn)z取，從而促進(jìn)水溶性物質(zhì)不斷溶出[14]，發(fā)酵第4 天開始，紫娟紅茶中的水浸出物含量開始顯著下降，可能是由于隨著茶葉中水分含量的減少，謝瓦曲霉由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)為生殖生長，需要大量的營養(yǎng)物質(zhì)維持自身必須的代謝和繁殖，從而吸收利用紫娟紅茶中的水溶性物質(zhì)[13]。發(fā)花后期（發(fā)酵8~10 d）紫娟紅茶水浸出物含量變化并不顯著，這可能是不溶性物質(zhì)在多酚氧化酶、纖維素酶的作用下分解浸出，與謝瓦曲霉生長繁殖所利用的水溶性物質(zhì)達(dá)到了動(dòng)態(tài)的平衡。

2.4.4 總花青素含量的變化

花青素是一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，屬生物類黃酮化合物，同時(shí)也是紫娟紅茶苦澀味的來源之一[15]，紫娟紅茶則因富含花青素具有很強(qiáng)的抗氧化活性和顯著的降血壓功效[16]，但花青素含量同樣影響著紫娟紅茶品質(zhì)。紫娟紅茶發(fā)酵過程中總花青素含量的變化見圖8。

圖8 紫娟紅茶發(fā)酵過程中總花青素含量的變化Fig.8 Changes of total anthocyanin content during fermentation of Zijuan black tea

由圖8 可知，在發(fā)酵過程中紫娟紅茶總花青素含量整體呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢，與對(duì)照組相比，發(fā)酵0 d組總花青素含量顯著降低約36.63%，降低了2.22 mg/g?？赡苁前l(fā)酵茶制作過程中，在汽蒸過程的影響下，由于高溫與高壓的作用花青素發(fā)生了降解。發(fā)酵4~10 d，總花青素含量明顯升高，出現(xiàn)這種現(xiàn)象主要是因?yàn)橹x瓦曲霉在生長繁殖過程中分泌的多種胞外酶作用于茶葉細(xì)胞壁，改變了其通透性，從而有利于鍵合態(tài)黃酮類化合物的釋放[17]。紫娟紅茶經(jīng)發(fā)酵后，花青素在微生物胞外酶的影響下發(fā)生降解[18]，含量降低，有助于降低紫娟紅茶本身的苦澀味，促進(jìn)回甘滋味的形成。

2.4.5 總黃酮含量的變化

黃酮類化合物具有柔和的澀感，是茶葉品質(zhì)的一個(gè)重要影響因子[19]，也是茶葉滋味的貢獻(xiàn)物之一，具有良好的清除自由基能力，是一種具有良好抗氧化活性的多酚物質(zhì)[20]，黃酮類物質(zhì)的變化與紫娟紅茶茶湯滋味的醇化和茶湯色澤的形成呈正相關(guān)。紫娟紅茶發(fā)酵過程中總黃酮含量的變化如圖9 所示。

圖9 紫娟紅茶發(fā)酵過程中總黃酮含量的變化Fig.9 Changes of total flavone content during fermentation of Zijuan black tea

由圖9 可知，紫娟紅茶經(jīng)發(fā)酵后，茶葉總黃酮含量總體呈下降趨勢，與對(duì)照組相比，發(fā)酵2 d 組總黃酮含量降低最多（2.74 mg/g），降幅約為46.77%。發(fā)酵8、10 d 組分別降低了35.03%、33.33%（2.06、1.96 mg/g）。發(fā)酵2 d 后，總黃酮含量呈現(xiàn)上升趨勢，與發(fā)酵2 d 組相比，發(fā)酵4、6、8、10 d 組均顯著增加，其中發(fā)酵10 d組總黃酮含量增加幅度最大（0.788 mg/g），約為25.13%。與對(duì)照組相比，發(fā)酵0、2、4、6、8、10 d 組總黃酮含量降低的原因一方面可能是汽蒸工藝使黃酮類物質(zhì)在高溫、高壓的作用下發(fā)生降解，另一方面，紫娟紅茶在發(fā)酵過程中，謝瓦曲霉分泌多酚氧化酶、過氧化氫酶等蛋白酶，從而導(dǎo)致黃酮類化合物出現(xiàn)降解。發(fā)酵4~10 d組總黃酮含量出現(xiàn)明顯上升的原因可能是謝瓦曲霉生長過程中分泌的胞外酶作用于紫娟紅茶細(xì)胞壁，增加了細(xì)胞壁的通透性，降低了對(duì)黃酮類物質(zhì)溶出的滯礙作用，從而導(dǎo)致總黃酮含量顯著增加[21]。

2.4.6 游離氨基酸含量的變化

游離氨基酸是茶葉滋味和香氣形成的重要前體物質(zhì)，氨基酸含量的增減對(duì)茶葉鮮爽味的形成有直接影響[22]。紫娟紅茶發(fā)酵過程中游離氨基酸含量的變化見圖10。

圖10 紫娟紅茶發(fā)酵過程中游離氨基酸含量的變化Fig.10 Changes of free amino acid content during fermentation of Zijuan black tea

由圖10 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，游離氨基酸的含量呈下降的趨勢，與對(duì)照組相比，發(fā)酵2、4、6、8、10 d 組均顯著降低（p<0.05），其中發(fā)酵10 d 組游離氨基酸含量下降最多，降幅達(dá)到35%。一方面可能是因?yàn)橹x瓦曲霉在發(fā)花期間，生長繁殖過程中利用了茶葉中的氨基酸作為自身所需的氮源物質(zhì)，從而造成氨基酸含量的顯著下降[23]；另一方面，在紫娟紅茶發(fā)酵過程中，由于溫度與濕度的變化，造成氨基酸與其他多酚類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)從而生成色素類物質(zhì)或與糖類物質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致氨基酸含量的下降[24]。

2.4.7 茶色素含量的變化

茶色素是茶葉湯色品質(zhì)形成的關(guān)鍵物質(zhì)，茶色素分為茶黃素、茶紅素及茶褐素，是茶葉中多酚類物質(zhì)的水溶性氧化產(chǎn)物，是構(gòu)成茶湯滋味和色澤的重要物質(zhì)[25]。紫娟紅茶發(fā)酵過程中各茶色素含量變化如圖11所示。

圖11 紫娟紅茶發(fā)酵過程中茶紅素及茶褐素動(dòng)態(tài)變化Fig.11 Changes of thearubigins and theabrownin during fermentation of Zijuan black tea

由圖11 可知，隨發(fā)酵不斷進(jìn)行，茶黃素總量逐漸下降，發(fā)酵0 d 時(shí)茶黃素含量為0.169%，發(fā)酵10 d 后下降至0.077%，降幅達(dá)到54.4%。茶黃素含量在發(fā)酵0~2 d 和8~10 d 時(shí)下降最為明顯。相較于發(fā)酵0 d組，發(fā)酵10 d 組茶紅素含量降低了3.151%，降幅達(dá)到50.3%，發(fā)酵8~10 d 茶紅素含量小幅上升。紫娟紅茶發(fā)酵0~8 d 茶褐素含量增加了5.53%，其中發(fā)酵6~8 d茶褐素含量增加最為明顯，增幅達(dá)33.8%。主要是因?yàn)樵凇鞍l(fā)花”過程中謝瓦曲霉分泌的胞外酶及濕熱作用下，茶色素發(fā)生相互轉(zhuǎn)化，在發(fā)花后期會(huì)因?yàn)椴瓒喾游镔|(zhì)氧化形成茶褐素[26-27]，這與Xiao 等[28]的研究結(jié)果一致。除此之外，謝瓦曲霉在生長繁殖過程中也會(huì)利用茶葉中的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行代謝轉(zhuǎn)化，從而分泌水溶性褐色色素，茶色素的變化有利于紫娟紅茶茶湯色澤的形成。紫娟紅茶隨發(fā)酵時(shí)間的延長，茶紅素及茶黃素會(huì)進(jìn)一步聚合成為茶褐素[29]。因此茶褐素含量在發(fā)酵過程中不斷增加，茶黃素與茶紅素含量隨著發(fā)酵程度的加深明顯下降。說明發(fā)酵期間茶色素含量的變化與微生物的生理活動(dòng)直接相關(guān)。

2.5 紫娟紅茶發(fā)酵過程中抗氧化活性變化

通過DPPH 自由基清除率和ABTS+自由基清除率兩個(gè)抗氧化活性指標(biāo)來評(píng)價(jià)紫娟紅茶發(fā)酵過程中抗氧化活性的變化，結(jié)果如圖12 所示。

圖12 紫娟紅茶發(fā)酵過程中對(duì)DPPH 自由基和ABST+自由基的清除能力Fig.12 Scavenging capacity of DPPH radicals and ABST+ radicals during fermentation of Zijuan black tea

由圖12 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，紫娟紅茶的兩個(gè)抗氧化活性指標(biāo)都呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢，與對(duì)照組相比，發(fā)酵0 d 組的DPPH 自由基清除率和ABTS+自由基清除率均顯著下降（p<0.05），可能由于高溫滅菌導(dǎo)致紫娟紅茶中的某些抗氧化活性物質(zhì)急劇降低。在發(fā)酵4~10 d 時(shí)，紫娟紅茶的DPPH 自由基清除率和ABTS+自由基清除率逐漸升高，發(fā)酵結(jié)束分別達(dá)到75.52% 和82.39%，說明謝瓦曲霉在發(fā)酵紫娟紅茶時(shí)能較明顯提升紫娟紅茶的抗氧化活性，其原因可能是謝瓦曲霉發(fā)酵過程中，在微生物代謝的作用下，促進(jìn)了紫娟紅茶中總黃酮及花青素等活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化與浸出[30]，從而提升其抗氧化活性。

3 結(jié)論

結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從茯茶中分離的“金花”菌屬謝瓦曲霉，利用該謝瓦曲霉對(duì)紫娟紅茶進(jìn)行單菌株人工接種“發(fā)花”處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫娟紅茶“發(fā)花”過程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，謝瓦曲霉數(shù)量極顯著增加，發(fā)酵8 d 后數(shù)量與質(zhì)量均達(dá)到茯茶標(biāo)準(zhǔn)；茶湯湯色變化明顯，顏色從亮黃轉(zhuǎn)變?yōu)槌燃t，湯色的變化與茶葉中不同茶色素含量的變化結(jié)果一致。發(fā)酵過程中紫娟紅茶茶多酚、兒茶素、水浸出物、游離氨基酸、茶黃素及茶紅素均整體出現(xiàn)不同程度的下降，總花青素、總黃酮等功能性成分含量均整體呈升高的趨勢，紫娟紅茶DPPH 自由基與ABTS+自由基清除率呈先降低后升高的變化趨勢。研究結(jié)果表明，向高花青素、口感苦澀的紫娟紅茶中接種謝瓦曲霉，隨著謝瓦曲霉的生長、代謝活動(dòng)以及多種胞外酶的分泌，會(huì)促使紫娟紅茶內(nèi)含物質(zhì)的改變，使得茶葉中的理化成分降解、聚合以及相互轉(zhuǎn)化，進(jìn)而影響紫娟紅茶的品質(zhì)與活性功能。利用單一“金花”菌發(fā)酵紫娟紅茶，可以有效避免雜菌污染、縮短發(fā)酵周期，通過謝瓦曲霉發(fā)酵紫娟紅茶不僅可以有效減少其苦澀味成分含量、促進(jìn)紫娟茶湯色的形成，還可以為紫色茶樹資源的利用與“金花”菌在食品及茶葉行業(yè)的產(chǎn)品開發(fā)提供參考。