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    龜板抑制破骨分化改善骨質(zhì)疏松性骨折

    2024-03-13 06:20:24張鵬陳弘林伍子賢余思瑤招文華尚奇何嘉輝陳桂鋒余富勇梁德江曉兵任輝余翔
    中國骨質(zhì)疏松雜志 2024年1期
    關(guān)鍵詞:龜板性骨折骨細(xì)胞

    張鵬 陳弘林 伍子賢 余思瑤 招文華 尚奇 何嘉輝 陳桂鋒 余富勇 梁德 江曉兵 任輝* 余翔,4*

    1.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東 廣州 510405

    2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510405

    3.廣州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510260

    4.廣東省中醫(yī)臨床研究院,廣東 廣州 510405

    骨質(zhì)疏松性骨折(osteoporotic fracture,OF)作為骨質(zhì)疏松癥最嚴(yán)重的并發(fā)癥,其發(fā)病率逐年升高,預(yù)計2035年我國髖部、椎體以及腕部OF約有483萬例,至2050年將達(dá)599萬例[1]。臨床多使用骨吸收抑制劑來治療OF,但這些藥物的臨床運用由于其使用過程中存在的并發(fā)癥而受到限制[2]。近年來,中醫(yī)藥在治療OF上展現(xiàn)出良好的療效,國內(nèi)外專家學(xué)者也逐漸開始關(guān)注這一領(lǐng)域[3-4]。

    龜板(plastrum testudinis,PT)具有補(bǔ)腎強(qiáng)骨的功效,近年來對龜板抗OF的研究越來越多,但多集中在PT促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化方面,研究表明龜板提取物及含藥血清對大鼠BMSCs有促增殖作用,在臨床上有較好的實際運用和發(fā)展前景[5]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能從多分子、多靶點、多途徑的角度闡述藥物干預(yù)疾病的治療原理[6]。因此,本文擬運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實驗驗證探討PT治療OF的潛在機(jī)制。

    1 資料與方法

    1.1 龜板化合物及靶點信息的獲取

    借助BATMAN數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)尋找龜板的相關(guān)活性物質(zhì)及其對應(yīng)靶點,將閥值“Score cutoff”設(shè)置為10[7]。

    1.2 骨質(zhì)疏松性骨折靶點集及龜板治療骨質(zhì)疏松性骨折的潛在靶點獲取

    在GeneCards(https://www.genecards.org/)和OMIM(https://www.omim.org)數(shù)據(jù)庫檢索得到OF靶點集,并借助R軟件將其與1.1中得到的靶點交集映射獲取兩者的交集靶點。

    1.3 龜板治療骨質(zhì)疏松性骨折的靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

    將交集靶點輸入至STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/),去除孤立蛋白后得到蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)信息,并將其導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2(http://www.cytoscape.org/)軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),借助網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析進(jìn)一步篩選核心靶點。

    1.4 龜板-活性成分-靶標(biāo)-骨質(zhì)疏松性骨折網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

    組建“龜板-活性成分-靶標(biāo)-骨質(zhì)疏松性骨折”四者之間的對應(yīng)信息,將其導(dǎo)入至Cytoscape 3.7.2 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化。

    1.5 GO生物過程富集分析

    交集靶點的GO生物過程(biological process,BP)富集分析通過R軟件完成,以點狀圖的形式展示顯著性排在前20的富集條目。此外,將交集靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件中進(jìn)行GO.BP富集分析,篩選出主要與OF相關(guān)的生物學(xué)過程(P<0.05),可視化展示上述生物學(xué)過程及其對應(yīng)的交集靶點。

    1.6 KEGG通路富集分析

    同樣利用R軟件對交集靶點進(jìn)行KEGG分析,將富集得到的信號通路(P<0.05)按照顯著性進(jìn)行排序展示,并構(gòu)建“通路-靶標(biāo)”之間的對應(yīng)關(guān)系,通過Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化展示[8]。

    1.7 實驗驗證

    1.7.1實驗動物:SPF級雌性SD大鼠30只,購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心。所有動物實驗均經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(No.TCMF1-2021068)。

    1.7.2實驗試劑:重組人RANKL(6449-TEC)購于美國R&D Systems公司,重組人M-CSF(11792-H08Y)購于北京義翹神州科技股份有限公司,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒購于美國Sigma公司,胎牛血清(FBS)、α-MEM培養(yǎng)基購于賽業(yè)生物科技有限公司,CCK8試劑購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司,龜板購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院(批號:KG37243537)。

    1.7.3龜板水提液的制備:參照本課題組前期研究基礎(chǔ)[9]。100 g龜板粉碎后,加1 L純水,微沸1 h,獲得提取液,剩余藥渣重復(fù)操作微沸2次后獲得提取液。所有提取液0.22 μm過濾除菌,分裝并密封后放置于-80 ℃冰箱保存。

    1.7.4OF大鼠模型的構(gòu)建及龜板的干預(yù):將30只雌性SD大鼠隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組、OF組和OF+PT組,每組10只。其中假手術(shù)組僅予術(shù)口切開,生理鹽水灌胃;根據(jù)既往報道的方法[10],OF組大鼠去除雙側(cè)卵巢3個月后,于L6椎體側(cè)造一直徑為3 mm、深度為3 mm的圓形骨缺損,以模擬骨質(zhì)疏松性椎體骨折后局部骨缺損狀態(tài);OF+PT組予構(gòu)建大鼠L6椎體OF模型,龜板水提液灌胃,灌胃濃度按照人和動物間體表面積折算的等效劑量比值換算為:3.15 g/(kg·d)。造模成功后,灌胃治療4周后處死各組大鼠并取材,取L6傷椎行micro-CT、HE染色評估OF模型大鼠骨缺損愈合的情況。

    1.7.5實驗細(xì)胞培養(yǎng):所有臨床實驗均通過本院倫理委員會的批準(zhǔn)(No.K[2019]129)。在本研究中,從確診為OF[11-12]的男性患者(n=3)中取外周靜脈血10 mL,均經(jīng)患者知情同意。根據(jù)文獻(xiàn)報道的方法[13],從血液樣本中提取人外周血單核細(xì)胞(human peripheral blood monocytes,HPBMs)進(jìn)行培養(yǎng)。

    1.7.6CCK8法檢測龜板對HPBMs活性的影響:取HPBMs以1×104/孔的密度接種于96孔板中,培養(yǎng)24 h后分為對照組和龜板干預(yù)組,對照組加入含25 ng/mL M-CSF的α-MEM培養(yǎng)基,龜板干預(yù)組加入含不同濃度梯度的龜板水提液和25 ng/mL M-CSF的α-MEM培養(yǎng)基,共設(shè)置5、10、20、30 μg/mL 4個濃度梯度,置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),分別于給藥后0、1、3、5、7 d取出1塊培養(yǎng)板,檢測HPBMs的吸光度值(OD 450 nm)。

    1.7.7TRAP染色鑒定龜板對HPBMs破骨分化的影響:取HPBMs以2×105個/cm2的密度接種于24孔板中,選取CCK8法檢測得到對HPBMs無細(xì)胞毒性的龜板水提液濃度進(jìn)行干預(yù),即用含25 ng/mL M-CSF、50 ng/mL RANKL及不同濃度龜板水提液的培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng),隔天換液。干預(yù)10 d后進(jìn)行TRAP染色,將具有3個以上細(xì)胞核,且細(xì)胞質(zhì)染成酒紅色的細(xì)胞定義為TRAP染色陽性(TRAP+)的成熟破骨細(xì)胞。

    1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 龜板成分及作用靶點信息

    通過BATMAN數(shù)據(jù)庫檢索去重后得到龜板6個活性成分,包括苯丙氨酸(Phenylalanine)、甲硫氨酸(Methionine)、蘇氨酸(Threonine)、碳酸鈣(Calcium Carbonate)、亮氨酸(Leucine)、天冬氨酸(Aspartic Acid),以及342個作用靶標(biāo)。

    2.2 龜板治療骨質(zhì)疏松性骨折的潛在靶點獲取

    共獲得OF相關(guān)靶點840個,與 342個PT靶點交集映射得到34個交集靶點。交集靶點信息見表1。

    表1 龜板治療骨質(zhì)疏松性骨折的潛在靶點基因

    2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)和龜板-活性成分-靶標(biāo)-骨質(zhì)疏松性骨折網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

    交集靶點構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)圖共涉及32個節(jié)點,126條邊。該網(wǎng)絡(luò)中有17個靶點蛋白的度值超過平均值(7.875),視其為核心靶點,詳見表2。龜板-活性成分-靶標(biāo)-骨質(zhì)疏松性骨折網(wǎng)絡(luò)圖由42個節(jié)點和79條邊組成,線條代表龜板、活性成分、作用靶點和骨質(zhì)疏松性骨折之間的對應(yīng)關(guān)系,網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析提示度值排名前3位的核心活性成分為苯丙氨酸(Phenylalanine,度值=21)、甲硫氨酸(Methionine,度值=9)、蘇氨酸(Threonine,度值=4)。

    表2 龜板治療骨質(zhì)疏松性骨折的核心靶點

    2.4 GO.BP富集分析

    GO.BP富集分析共獲得802個結(jié)果,主要涉及破骨分化的調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、糖皮質(zhì)激素反應(yīng)、NF-κB信號的正向調(diào)控、雌激素反應(yīng)、凋亡信號通路的調(diào)控等。此外,利用Cytoscape 3.7.2進(jìn)行交集靶點的GO.BP富集分析并篩選與OF密切相關(guān)的結(jié)果,主要涉及調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、激素代謝及細(xì)胞周期等生物過程。

    2.5 KEGG分析

    使用R軟件對34個靶點基因進(jìn)行KEGG分析,共得到67個結(jié)果,主要涉及與破骨分化、炎癥反應(yīng)、激素代謝密切相關(guān)的通路。篩選得到相關(guān)信號通路共有22條,詳見表3。

    表3 富集的信號通路

    2.6 Micro-CT及HE染色檢測龜板對OF模型大鼠骨缺損愈合的影響

    如圖1所示,micro-CT結(jié)果提示龜板可有效治療大鼠骨質(zhì)疏松性椎體骨折骨缺損,HE染色結(jié)果顯示龜板干預(yù)4周后可有更多骨形成,促進(jìn)OF大鼠椎體骨折骨缺損愈合。

    圖1 龜板干預(yù)4周后micro-CT和HE染色結(jié)果

    2.7 CCK8檢測龜板對HPBMs增殖的影響

    通過CCK8法檢測發(fā)現(xiàn),龜板水提液濃度在不超過10 μg/mL的情況下對HPBMs無細(xì)胞毒性,見圖2。

    圖2 CCK8 檢測結(jié)果

    2.8 TRAP染色鑒定龜板對HPBMs破骨分化的影響

    在不影響HPBMs增殖的相應(yīng)濃度龜板水提液干預(yù)下,發(fā)現(xiàn)隨著龜板水提液濃度的增加,成熟破骨細(xì)胞的數(shù)量明顯減少(圖3),差異具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1),這證明龜板能夠抑制RANKL誘導(dǎo)的HPBMs破骨分化。

    圖3 TRAP染色分析及量化

    3 討論

    3.1 活性成分、靶標(biāo)與PPI網(wǎng)絡(luò)分析

    通過對龜板-活性成分-靶標(biāo)-骨質(zhì)疏松性骨折網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)龜板6個活性成分分別調(diào)控34個靶點影響其對骨質(zhì)疏松性骨折的治療機(jī)制。如血漿苯丙氨酸(Phenylalanine)濃度升高可能會對骨骼狀況有不利影響,降低骨強(qiáng)度,增加骨折的風(fēng)險[14]。蘇氨酸(Threonine)是AKT(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)的蛋白底物,活化的AKT磷酸化蘇氨酸等多種底物參與調(diào)節(jié)成骨、破骨細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用的PI3K/AKT通路,影響成骨、破骨細(xì)胞的增殖、分化及凋亡,進(jìn)而影響骨密度[15]。碳酸鈣等礦物元素是機(jī)體骨代謝平衡的重要底物,可增加骨鈣含量和骨密度,對OF有較好的防治作用[16]。

    經(jīng)PPI網(wǎng)絡(luò)篩選后得到度值位列前三的作用靶點為FOS、TNF、BDNF,推測它們可能在龜板治療OF過程中起到關(guān)鍵作用。FOS是c-fos基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物編碼的蛋白,在調(diào)控細(xì)胞分裂、增殖、分化、凋亡等方面具有重要作用[17]。FOS與破骨細(xì)胞關(guān)系密切,FOS表達(dá)受抑制時破骨細(xì)胞數(shù)量隨之減少[18]。此外,FOS可通過影響RANKL-RANK介導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成信號傳導(dǎo)途徑,抑制破骨細(xì)胞生成[19]。因此,FOS對調(diào)節(jié)骨折愈合骨形成和骨吸收起著重要作用[20]。TNF與炎癥反應(yīng)密切相關(guān),可誘導(dǎo)M-CSF的表達(dá),NF-κB因子可被其激活進(jìn)而啟動RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成過程,增強(qiáng)骨吸收[21]。BDNF(腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子)與骨的發(fā)育有著密切的聯(lián)系,BDNF能促進(jìn)破骨細(xì)胞增殖分化[22]。另外,BDNF和IGF-1具有協(xié)同作用,它們共同調(diào)節(jié)ERK/p38 MAPK通路活性,促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和分化[23]。同時,有研究顯示BDNF基因可能通過MAPK通路調(diào)控成骨分化[24]。

    3.2 GO和KEGG分析

    GO分析結(jié)果所反映的內(nèi)容類似于PPI網(wǎng)絡(luò)規(guī)律,多涉及炎癥反應(yīng)、激素代謝和細(xì)胞周期(如破骨細(xì)胞分化)的調(diào)節(jié)。而KEGG分析結(jié)果反映的內(nèi)容也印證了PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析及GO分析結(jié)果所展現(xiàn)的規(guī)律。例如,TNF信號通路的相關(guān)研究表明,炎性因子TNF-α可促進(jìn)RANKL表達(dá),誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成[21]。MAPK信號通路可通過促進(jìn)骨保護(hù)素(OPG)表達(dá)[25],進(jìn)而與RANK競爭性結(jié)合RANKL,最終導(dǎo)致破骨細(xì)胞的凋亡[26];Estrogen(雌激素)信號通路可以協(xié)同Wnt等多條信號通路共同調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[27]。

    3.3 體內(nèi)外實驗分析

    近年來對龜板抗OF的研究越來越多,針對其起效機(jī)制的研究也主要集中于促進(jìn)BMSCs成骨分化方面[5],對于龜板影響破骨分化的機(jī)制鮮有報道。而本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),對破骨分化的調(diào)節(jié)可能是龜板抗骨質(zhì)疏松性骨折的重要機(jī)制。為了驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果的可靠性,本研究開展了動物實驗,證實龜板可有效治療OF模型大鼠的骨缺損,并且通過體外實驗首次探究了龜板干預(yù)下的OF患者HPBMs表型,發(fā)現(xiàn)龜板能顯著抑制HPBMs破骨分化。

    綜上所述,本研究結(jié)果提示龜板可能通過多種化合物、靶點和通路調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、激素代謝及細(xì)胞周期來治療OF,其中抑制破骨分化可能是龜板抗OF的重要機(jī)制。

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