四川草地型藏綿羊雜交羊群中FecB基因的檢測與分析

陳 勇，楊小林，黃向月，牟 桑，雍 軍，余康健，蘇元君，李星亮

（阿壩藏族羌族自治州畜牧科學(xué)技術(shù)研究所，四川 紅原 624402）

綿羊的多胎性狀是綿羊多產(chǎn)、高產(chǎn)的基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ecB基因是在綿羊身上識別出的第一個高繁殖力主效基因，攜帶FecB等位基因的綿羊群體的繁殖力顯著高于不含有該基因的群體。研究人員對中國很多地方綿羊品種都進行了FecB檢測，發(fā)現(xiàn)至少9個品種存在FecB突變［1］，主要存在于小尾寒羊和湖羊中。故本研究選用湖羊、小尾寒羊作為母本，分別與草地型藏綿羊（賈洛羊）、薩福克羊公羊進行雜交，后對雜交F1代羊群進行FecB基因檢測，計算各基因型的基因頻率，并跟蹤F1 代母羊的產(chǎn)仔情況，為后期優(yōu)化、篩選和制訂草地型藏綿羊多羔多胎雜交育種計劃提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗羊群及血樣采集6 個試驗羊群分別為湖羊、小尾寒羊、草地型藏綿羊（賈洛羊）等純系以及草地型藏綿羊（♂）×小尾寒羊（♀）、薩?？搜颍ā幔敛莸匦筒鼐d羊（♀）、湖羊（♂）×草地型藏綿羊（♀）等雜交F1代羊。均飼養(yǎng)于若爾蓋縣，健康狀況良好。

根據(jù)羊群數(shù)量大小，等比例選取一定數(shù)量的羊只采集血樣。91只試驗羊于頸靜脈處采血5～10 mL，加入混有1%肝素鈉的抗凝管中，混勻后保存在－20 ℃冰柜中備用［2］。

1.2 試驗羊群的飼養(yǎng)管理 試驗組的湖羊、小尾寒羊、薩?？搜蚣捌潆s交F1 代羊每天放牧約8h；日補飼2次，上午、下午各喂1次；成年羊每天補飼玉米粒0.2 kg/只，補飼全價顆粒飼料0.08 kg/只；羔羊每天補飼玉米粒0.08 kg/只，補飼全價顆粒飼料0.08 kg/只；實行規(guī)范化驅(qū)蟲和免疫預(yù)防。對妊娠母羊、產(chǎn)后母羊及羔羊進行精細(xì)化飼養(yǎng)管理，對于產(chǎn)羔多但又少奶的哺乳母羊，務(wù)必對其羔羊?qū)嵤┤斯げ溉椋M量減少羔羊不必要的死亡。

1.3 DNA 提取方法 采用SDS 方法按說明書步驟提取試驗羊只血樣DNA，電泳檢測條帶后，保存于－20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 多羔多胎基因擴增PCR 采用10 μL 體系：DNA模板1μL，上下游引物各0.5μL，2×Easy TaqPCR Super Mix（＋dye）5μL，用ddH2O 補足10 μL。

擴增引物序列參考NY/T 1672-2008 標(biāo)準(zhǔn)，預(yù)期擴增片段大小為140 bp。

上游引物：GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG；下游引物：CAAGATGTTTTTCATGCCTCATCAAC ACGGTC。

1.4.1 PCR 擴增體系10 μmol/L 的上下游引物各1μL，SYBR PCRSuperMix 10 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O6 μL，總反應(yīng)體積為20 μL。

PCR 擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共33 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.4.2 PCR 產(chǎn)物檢測及測序5 μL 的擴增產(chǎn)物加上1μL上樣緩沖液（Loading Buffer），5μL DM2000 DNAMarker，于120 V下電泳30 min，凝膠成像儀下觀察產(chǎn)物的擴增情況。

1.5FecB基因型分型 分裝5 μL 的PCR 擴增產(chǎn)物送北京擎科生物科技股份有限公司（成都分公司）測序，檢測目標(biāo)位點的堿基多態(tài)性。

另取5 μL PCR擴增產(chǎn)物用AvaⅡ限制性內(nèi)切酶進行酶切，酶切反應(yīng)體系如下［5］：PCR擴增產(chǎn)物5μL，10×NEBBuffer 5μL，AvaⅡ酶1μL，雙蒸水39 μL。整個體系的混合在冰上操作，振蕩、離心后置于37 ℃恒溫箱中過夜。5 μL 的擴增產(chǎn)物加上1μL 上樣緩沖液（Loading Buffer），5μL DM2000DNAMarker，于200V電壓下電泳30min，凝膠成像儀下觀察產(chǎn)物的擴增情況。

1.6 統(tǒng)計分析 對測序結(jié)果和FecB基因酶切結(jié)果進行判定、統(tǒng)計，并用卡方檢驗分析各試驗羊群的Hardy-Weinberg平衡情況。統(tǒng)計3個雜交組合羊群母羊的第一胎產(chǎn)羔情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 擴增結(jié)果 由圖1 可知，在100 bp 和250 bp 之間有1 條特異性擴增片段，與預(yù)期擴增片段大小一樣，約為140 bp。

圖1 FecB基因PCR擴增結(jié)果

2.2 PCR-RFLP 檢測結(jié)果 將擴增產(chǎn)物（A1～C3）酶切，電泳結(jié)果顯示出3 種不同的基因型，如圖2 所示。其中A1、A2、A3 為野生型（++型，無FecB拷貝，140bp/140bp）；B1、B2、B3 為雜合型（B+型，一個FecB拷貝的攜帶者，140 bp/110 bp）；C1、C2、C3為純合型（BB型，兩個FecB拷貝的攜帶者，110 bp/110 bp）。

圖2 FecB基因擴增產(chǎn)物AvaⅡ酶切結(jié)果

2.3 基因分型結(jié)果及Hardy-Weinberg 平衡檢驗 湖羊、小尾寒羊、賈洛羊等純系樣本不符合Hardy-Weinberg平衡條件，故不做卡方檢驗。

由表1 可見，藏×小F1 代群體中三個基因型頻率分別為0.05、0.21和0.74，且野生型（++型）是該群體中的優(yōu)勢基因型。薩×藏F1代群體中沒有檢測出純合型（BB 型），只檢測出雜合型（B+型）和野生型（++型），二者基因型頻率分別為0.20和0.80，且野生型（++型）是該群體的優(yōu)勢基因型。湖×藏F1代群體中沒有檢測出純合型（BB型），只檢測出雜合型（B+型）和野生型（++型），二者基因型頻率分別為0.70和0.30，且雜合型（B+型）是該群體的優(yōu)勢基因型。經(jīng)卡方（χ2）檢驗，藏×小、薩×藏、湖×藏組合的P值分別為0.423、0.940、0.232，均大于0.05，說明三個雜交組合F1 代群體滿足Hardy-Weinberg平衡條件。

表1 試驗羊群多胎基因分型結(jié)果與卡方檢驗

2.4 三個雜交組合F1代母本的產(chǎn)仔數(shù)情況 由表2 可知，湖×藏、薩×藏組合的產(chǎn)羔均數(shù)分別為1.4、1.1頭，低于藏×小組合（2.1頭）。

3 討論

3.1FecB基因的導(dǎo)入情況 產(chǎn)羔數(shù)是直接影響?zhàn)B羊業(yè)經(jīng)濟效益的重要因素。鑒于草地型藏綿羊繁殖力較低［4］，本研究著力通過雜交方式在草地型藏綿羊中導(dǎo)入FecB基因來提高繁殖力?；蚍中徒Y(jié)果顯示，藏×小F1 代群體中存在三種基因型［7］，即BB 型、B+型和++型，薩×藏F1 和湖×藏F1 代群體中存在兩種基因型，B+型和++型，且B+基因型頻率分別為0.20、0.70，說明FecB基因已經(jīng)在草地型藏綿羊3 個雜交群體中導(dǎo)入成功。

3.2 基因型頻率分析 研究發(fā)現(xiàn)藏×小、湖×藏、薩×藏三個雜交F1 代群體雖未進行人工選擇，但均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。同時，群體內(nèi)BB 基因型頻率較低，分別為0.05、0、0，后期隨著雜交群體的自繁、擴群，群體中BB型基因頻率逐漸增加［6］，從而不斷提高子二代、三代等群體的產(chǎn)仔均數(shù)。

3.3 產(chǎn)羔數(shù)差異分析 若爾蓋縣地處青藏高原東北邊緣，養(yǎng)殖環(huán)境多為高海拔（3 300 m以上）及高寒地區(qū)，所以本研究選擇已能適應(yīng)本地區(qū)氣候環(huán)境的綿羊品種（小尾寒羊、薩?？搜?、湖羊）和本地草地型藏綿羊（賈洛羊）作為試驗對象。小尾寒羊和湖羊是中國知名的產(chǎn)多羔型品種，產(chǎn)羔率平均為229%～270%，一般作為配套組合雜交母本。本研究發(fā)現(xiàn)，選擇小尾寒羊作為母本，雜交F1 代產(chǎn)羔數(shù)量平均為2.2 頭。相對應(yīng)的，以湖羊作為父本，雜交F1代產(chǎn)羔數(shù)量平均僅有1.4頭，說明以多羔型品種作為母本的雜交（藏×?。〧1代的產(chǎn)羔數(shù)量明顯多于以多羔型品種為父本的雜交（湖×藏）F1代的產(chǎn)羔數(shù)量。這一點這與卡那提沙力克［7］報道的結(jié)果基本一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，母本小尾寒羊可能攜帶有少量野生型（++型）基因，三個雜交組合F1代FecB基因的B 配子的基因頻率各不相同，但藏×小、湖×藏雜交F1代組合的B基因型頻率分別為0.14、0.11，前者仍高于后者。因此，以小尾寒羊或者湖羊作為雜交母本，其雜交F1 代的FecB基因頻率高，更有利于FecB基因在藏綿羊群體中的導(dǎo)入。

4 結(jié)論

通過分子生物學(xué)手段對草地型藏綿羊與小尾寒羊、薩?？?、湖羊等雜交后代群體進行FecB基因分型，發(fā)現(xiàn)F1代雜交群體均成功導(dǎo)入了FecB基因，母羊產(chǎn)仔均數(shù)有一定的提高。在對比分析不同的雜交組合方式后，確定以多羔型品種綿羊（小尾寒羊）作為雜交組合的母本，其FecB基因聚合優(yōu)勢更大，產(chǎn)羔數(shù)更多。