離子色譜法測定別嘌醇中嗎啉殘留

趙曉亞，鄭文惠，耿一楠，劉曉，常艷，丁俊飛（華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司，北京 101111）

別嘌醇（allopurinol），化學(xué)名為1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-醇，是臨床上治療痛風(fēng)的常用藥物[1]。此外，研究表明別嘌醇對腎病也有良好的治療效果[2]，還可作為腫瘤溶解綜合征低危患者和血尿酸正常的中?；颊叩氖走x初始藥物[3]。別嘌醇治療痛風(fēng)的主要藥用原理是別嘌醇及其代謝產(chǎn)物氧嘌呤醇通過抑制黃嘌呤氧化酶的活性，使尿酸生成減少[4]。目前，別嘌醇常用的工業(yè)化合成路線如圖1所示[5-6]。其中，別嘌醇合成工藝中的重要起始物料嗎啉，在后續(xù)反應(yīng)中可通過精制去除。由于別嘌醇常采用“一鍋法”合成路線，即生成5-氨基-1-H-吡唑-4-甲酰胺半硫酸鹽[5]，合成路線較短，有殘留嗎啉的風(fēng)險，因此需嚴格控制嗎啉殘留量。參考致癌效力數(shù)據(jù)庫（CPDB）提供的1547種化合物結(jié)構(gòu)[7]，嗎啉結(jié)構(gòu)與1，4二氧己環(huán)結(jié)構(gòu)類似，具有潛在警示結(jié)構(gòu)。因此，按照潛在致突變性雜質(zhì)的要求制定嗎啉限度為1.8 μg·g-1[8]。

圖1 別嘌醇原料藥的工藝路線Fig 1 Process route of allopurinol API

目前，別嘌醇及其制劑的雜質(zhì)相關(guān)研究內(nèi)容較多[9-10]，但尚未發(fā)現(xiàn)對別嘌醇中嗎啉進行檢測的標準[11-13]或文獻。嗎啉檢測通常采用氣相色譜法[14-15]、離子色譜法[16]、液相色譜法[17]等分析方法，其中，離子色譜法具有簡便、快速、靈敏度高，以及對強堿溶液的強耐受性等優(yōu)點。本研究基于離子色譜法測定別嘌醇中的痕量嗎啉，該法靈敏度高、專屬性好、準確度高，不僅能夠較好地滿足別嘌醇中嗎啉的質(zhì)量控制要求，為別嘌醇質(zhì)量標準的提升提供了科學(xué)依據(jù)，同時也為其他化合物中嗎啉的檢測提供了參考方法。

1 材料

1.1 儀器

ICS5000型離子色譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；Mettler ToledoXP205 電子分析天平（十萬分之一，梅特勒-托利多國際有限公司）；CS12陽離子色譜柱（250 mm×4.0 mm，美國賽默飛世爾科技公司）；Dionex OnGuard Ⅱ H固相萃取小柱（美國戴安公司）。

1.2 試藥

嗎啉對照品（色譜級，批號：5002D30W，含量：99.6%，Alfa Aesar化學(xué)有限公司）；別嘌醇原料藥[批號：4019Ⅱ181101，含量：99.4%；批號：4019Ⅱ181102，含量：99.5%；批號：4019Ⅱ181103，含量：98.9%，華潤雙鶴藥業(yè)（商丘）有限責(zé)任公司]；甲烷磺酸（分析純，北京伊諾凱科技有限公司）；氫氧化鋰（分析純，中國醫(yī)藥集團有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用IonPac CS12（250 mm×4.0 mm）陽離子色譜柱為分析柱，IonPac CG12（50 mm×4.0 mm）為保護柱；以8 mmol·L-1甲烷磺酸溶液為淋洗液A，40 mmol·L-1甲烷磺酸溶液為淋洗液B，梯度洗脫程序見表1；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：500 μL；抑制器：CERS 300（4 mm）；抑制電流為161 mA；柱溫為30℃。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution procedure

2.2 溶液配制

2.2.1 稀釋劑 取 0.01 mol·L-1氫氧化鋰溶液，用H型固相萃取小柱濾過，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取別嘌醇40 mg置10 mL量瓶中，加約3/4量瓶體積稀釋劑，置90℃加熱1 h溶解，放冷，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，冰箱放置1 h后，用0.45 μm聚醚砜濾膜濾過，即得。

2.2.3 對照品儲備液 精密稱取嗎啉36 mg，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，移取1 mL，置100 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，再移取1 mL，置50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 對照品溶液 精密移取對照品儲備液1 mL置10 mL量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 專屬性與系統(tǒng)適用性試驗

分別取稀釋劑、對照品溶液和供試品溶液各500 μL，進樣分析，記錄色譜圖見圖2。結(jié)果顯示，稀釋劑和別嘌醇均不干擾嗎啉檢測，嗎啉的保留時間為16.840 min，該色譜條件下與相鄰雜質(zhì)峰最小分離度為1.5；連續(xù)6針對照品溶液色譜圖中嗎啉峰面積RSD為1.5%，供試品溶液前后兩針對照品溶液色譜圖中嗎啉峰面積RD為3.7%。結(jié)果表明該方法專屬性與系統(tǒng)適用性良好。

圖2 稀釋劑、對照品溶液及供試品溶液離子色譜圖Fig 2 Ion chromatograms of diluent，standard solution and sample solution

2.4 檢測限（LOD）和定量限（LOQ）

取嗎啉對照品儲備液，用稀釋劑逐級稀釋合適的倍數(shù)后進行測試，以信噪比（S/N）約為10時的進樣濃度為其定量限，繼續(xù)稀釋，以S/N約為3時的進樣濃度為其檢測限。結(jié)果顯示嗎啉的定量限質(zhì)量濃度為1.487 ng·mL-1，相當(dāng)于供試品質(zhì)量濃度0.37 μg·g-1，檢測限質(zhì)量濃度為0.5558 ng·mL-1，相當(dāng)于供試品質(zhì)量濃度0.14 μg·g-1。

2.5 線性關(guān)系考察

取對照品儲備液，分別稀釋制成含嗎啉0.001 487～0.014 87 μg·mL-1的系列溶液，分別精密量取線性溶液各500 μL，注入離子色譜儀，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸。結(jié)果顯示嗎啉線性回歸方程為：Y＝1.107X-0.0004，r＝0.9991，Y軸截距占100%響應(yīng)值的百分比為5.2%。嗎啉在0.001 487～0.014 87 μg·mL-1內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.6 加樣回收試驗

精密稱取別嘌醇（4019Ⅱ181103批次）40 mg，平行10份，分別置10 mL量瓶中，按照3個濃度準確加入對照品儲備液，加稀釋劑至3/4量瓶體積，置90℃加熱1 h，溶解，放冷，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，冰箱放置1 h后，用0.45 μm聚醚砜濾膜濾過，作為50%、100%、150%濃度水平的加樣回收試驗溶液，每個濃度水平平行配制3份，進樣測定。結(jié)果回收率均在89.99%～118.00%，RSD均小于9.0%，所建立的方法的回收率較好（見表2）。

表2 加樣回收試驗Tab 2 Recoveries

2.7 重復(fù)性考察

取“2.6”項下100%水平回收率溶液作為加標供試品溶液，注入離子色譜儀，分別測定6份加標供試品溶液中嗎啉的含量。結(jié)果表明6份重復(fù)性溶液中嗎啉含量均值為1.8 μg·g-1，RSD為12.3%。表明本方法具有良好的重復(fù)性。

2.8 穩(wěn)定性考察

對照品溶液在室溫下放置46.5 h，各時間點峰面積與0 h峰面積的變化值均在0.0%～3.8%，表明對照品溶液在46.5 h內(nèi)穩(wěn)定。加標供試品溶液在室溫下放置38 h后，各時間點峰面積與0 h峰面積的變化值均在1.2%～3.8%內(nèi)，表明加標供試品溶液在38 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 耐用性試驗

取100%水平回收率溶液作為加標供試品溶液，分別用不同色譜柱、不同流速0.9～1.1 mL·min-1、不同日期以及不同實驗員操作，其他條件不變，測定加標供試品溶液中嗎啉的含量。結(jié)果表明，與原條件結(jié)果比較，RD在0.0%～10.5%。因此，色譜條件發(fā)生微小變化不影響嗎啉的檢測，耐用性良好。

2.10 樣品中嗎啉含量測定

分別取4019Ⅱ181101、4019Ⅱ181102、4019Ⅱ-181103批次別嘌醇原料藥配制供試品溶液，按外標法以峰面積計算嗎啉的含量。結(jié)果顯示，3批別嘌醇供試品中均未檢出嗎啉。

3 討論

3.1 檢測方法選擇

目前，嗎啉檢測通常以氣相色譜法為主，采用溶液直接進樣，結(jié)合氫火焰離子化檢測器[14-15]。但文獻報道基于氣相色譜法檢測嗎啉檢出限最低為2.01 μg·mL-1[14]，靈敏度較低。離子色譜法[18-20]具有簡便、快速、靈敏度高，以及對強堿溶液的強耐受性等優(yōu)點。張于等[16]曾采用離子色譜-間接紫外檢測法對實驗室合成的嗎啉樣品進行分析，且檢測限小于0.45 ng·mL-1。本研究直接選用離子色譜-電導(dǎo)檢測器法對別嘌醇中痕量嗎啉進行檢測，無需結(jié)合紫外檢測器，檢測限低，結(jié)果準確可靠。

3.2 溶劑選擇

2020年版《中國藥典》載明別嘌醇在0.1 mol·L-1氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液中易溶[8]，但鈉離子和鉀離子在該色譜柱體系下，與嗎啉分離較差。經(jīng)篩選，發(fā)現(xiàn)采用0.01 mol·L-1氫氧化鋰，以H型固相萃取小柱濾過后的溶液為溶劑時，別嘌醇能夠溶解完全，且鋰離子和嗎啉的分離得到了極大改善。本研究最終選用0.01 mol·L-1氫氧化鋰為溶劑。該溶劑的合理選擇和處理方法，為本方法開發(fā)成功的關(guān)鍵性因素。

3.3 淋洗液條件優(yōu)化

本研究對淋洗液的濃度和梯度分別進行了考察。結(jié)果表明采用8 mmol·L-1甲烷磺酸溶液為淋洗液，等度洗脫，運行時間為180 min時，樣品中的所有雜質(zhì)才能完全洗脫。但以8 mmol·L-1和40 mmol·L-1甲烷磺酸溶液為淋洗液進行梯度洗脫時，45 min內(nèi)能將樣品中所有的雜質(zhì)完全洗脫，且65 min內(nèi)可完全平衡回初始梯度，極大地節(jié)省了檢測時間。

3.4 小結(jié)

本文采用離子色譜法實現(xiàn)了別嘌醇中嗎啉進行有效的控制，按照潛在致突變性雜質(zhì)的要求制定嗎啉限度為1.8 μg·g-1[8]，方法學(xué)考察結(jié)果表明，在此試驗條件下，嗎啉在0.001 487～0.014 87 μg·mL-1與峰面積線性關(guān)系良好，檢測限為0.5558 ng·mL-1，專屬性強、靈敏度高，可有效避免樣品假陰性，滿足雜質(zhì)定量檢測要求，可作為別嘌醇中痕量嗎啉的質(zhì)量控制方法，同時也可以作為其他化合物中嗎啉含量測定的參考方法。