Toll樣受體在冠心病中的研究進(jìn)展及靶向藥物分析

張景，王可，來利紅（河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院 心內(nèi)科，河南 洛陽 471003）

以冠心?。╟oronary heart disease，CHD）為代表的心血管疾病是全球人類死亡的常見原因[1]。研究發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)介導(dǎo)產(chǎn)生的炎性信號參與了CHD的發(fā)病[2]。病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）激活多種模式識別受體，其中Toll樣受體（Tolllike receptors，TLRs）在冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。研究表明平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞均可表達(dá)TLRs。TLR2和TLR4 表達(dá)于富含脂質(zhì)和動脈粥樣硬化斑塊部位，參與動脈粥樣硬化相關(guān)炎癥反應(yīng)[3]。TLR7和TLR9具有加速或減輕動脈粥樣硬化的雙向調(diào)節(jié)作用[4]?？傊贑HD的發(fā)生、進(jìn)展、斑塊的不穩(wěn)定及破裂等各個時期，TLRs信號均發(fā)揮著重要作用，大量研究表明，抑制TLRs可以在一定程度上減少血管炎癥和動脈粥樣硬化斑塊的形成進(jìn)而減緩疾病的進(jìn)展[4]。

1 Toll樣受體簡介

Toll樣受體是Ⅰ型跨膜模式識別受體，通過識別PAMPs在固有免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。截至目前，在人類和小鼠中共發(fā)現(xiàn)13種TLRs[6]，其中10種在人類中，12種在小鼠中[7]。根據(jù)TLRs的細(xì)胞定位和特異性配體將其分為兩大類，其中一類在細(xì)胞表面表達(dá)并識別微生物的膜組分，例如脂質(zhì)、脂蛋白等（TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR11）；另一類在細(xì)胞內(nèi)如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等囊泡的表面上表達(dá)，識別微生物核酸（TLR3、TLR7、TLR8和TLR9）[4]。TLRs主要由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三個功能區(qū)構(gòu)成[8]。胞外區(qū)是與配體結(jié)合的特異部位，由十到二十余個存在較大差異的富含亮氨酸重復(fù)序列組成?？缒^(qū)是富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域。胞內(nèi)區(qū)由于其保守結(jié)構(gòu)和人類白細(xì)胞介素1受體（interleukin-1 receptor，IL-1R）結(jié)構(gòu)相似，故被稱為 TIR結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域是TLRs向下游轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的樞紐部位。依據(jù)募集到TLRs的不同配體，可將TLRs信號傳導(dǎo)途徑大致分為兩類：髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴性通路和β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（Toll/interleukin-1 receptor domain containing adaptor inducing interferonβ，TRIF）依賴性通路[8]。當(dāng)內(nèi)源性或外源性配體被TLRs識別并結(jié)合后，程序性激活MyD88或TRIF及其下游蛋白，通過核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）、干擾素調(diào)節(jié)因子（interferon regulatory factor，IRF）等信號通路釋放腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、Ⅰ型干擾素（typeⅠinterferon，IFN-Ⅰ）等炎性因子，最終參與動脈粥樣硬化等多種疾病的發(fā)生發(fā)展[2]（見圖1）。

圖1 TLRs信號在動脈粥樣硬化中的調(diào)節(jié)機(jī)制Fig 1 Regulatory mechanism of TLRs signaling in atherosclerosis

2 TLRs與CHD

固有免疫系統(tǒng)在激活炎癥級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致組織損傷過程中起著關(guān)鍵作用。TLRs激活后介導(dǎo)炎癥介質(zhì)參與CHD的發(fā)生。TLRs識別PAMPs后，通過釋放促炎細(xì)胞因子和誘導(dǎo)適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)來保護(hù)心肌細(xì)胞免受病原體的侵害[9]。它們還可以通過損傷相關(guān)的分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）檢測血管中的脂質(zhì)沉積，并引發(fā)無菌炎癥，對CHD起保護(hù)作用[10]。然而，TLRs的過度激活可能引起持續(xù)性炎癥刺激進(jìn)而打破免疫耐受。當(dāng)TLRs識別到其相應(yīng)配體時，DAMPs會介導(dǎo)細(xì)胞因子風(fēng)暴加速心肌及血管受損。因此，TLRs在CHD中扮演著復(fù)雜的雙重調(diào)節(jié)作用。

2.1 TLR2與CHD

既往研究發(fā)現(xiàn)TLR2激活與CHD有著密切的關(guān)聯(lián)。Wen等[11]通過生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)TLR2與動脈粥樣硬化的發(fā)生有關(guān)。TLR2在心肌細(xì)胞中高表達(dá)，并通過與MyD88結(jié)合激活NF-κB信號通路以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生從而介導(dǎo)心肌炎癥、心肌纖維化、心肌細(xì)胞凋亡和心肌梗死等過程[12-13]。TLR2亦可通過激活中性粒細(xì)胞和自由基介導(dǎo)的內(nèi)皮損傷而誘導(dǎo)缺血再灌注后冠狀動脈內(nèi)皮功能障礙[14]。此外，心肌梗死患者外周血單核細(xì)胞的TLR2表達(dá)和體外缺氧介導(dǎo)的單核細(xì)胞的TLR2表達(dá)和促炎細(xì)胞因子表達(dá)呈時間依賴性增加，這表明，急性心肌梗死患者的TLR2上調(diào)和循環(huán)單核細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子表達(dá)增加與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)[15]。生物信息學(xué)技術(shù)亦發(fā)現(xiàn)TLR2的上調(diào)可能對急性心肌梗死具有較好的篩選價值[16]。相反，在缺乏TLR2的小鼠中觀察到動脈粥樣硬化進(jìn)展受限、巨噬細(xì)胞募集減少和促炎細(xì)胞因子釋放減少[17]。因此，TLR2介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在CHD的整個發(fā)病過程中發(fā)揮著重要的作用。

2.2 TLR4與CHD

TLR4是心臟組織中最常見的TLR，是心臟炎癥和凋亡過程的關(guān)鍵介質(zhì)[3]。研究表明，TLR4可能參與動脈粥樣硬化形成及動脈粥樣斑塊向易損斑塊的進(jìn)展，貫穿于單核細(xì)胞活化、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血管平滑肌細(xì)胞纖維化以及巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞形成的整個過程[18]。冠狀動脈中TLR4激活后，亦可通過MyD88/NF-κB信號誘導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，并且可能通過協(xié)同作用促進(jìn)TLR2信號的傳導(dǎo)，加速冠狀動脈斑塊不穩(wěn)定和破裂，最終導(dǎo)致冠狀動脈閉塞[11]。研究發(fā)現(xiàn)，不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死患者循環(huán)單核細(xì)胞中TLR4表達(dá)升高[19]。類似地，與健康個體相比，急性心肌梗死患者的心肌和血漿中TLR4和促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6、IL-10和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）的表達(dá)增加。此外，與Tlr-KO小鼠相比，WT小鼠心肌梗死后α平滑肌肌動蛋白上調(diào)，表明TLR4加劇了心臟重構(gòu)并增強(qiáng)了梗死區(qū)域纖維化[20]。而抑制TLR4信號可以減少動脈粥樣硬化病變過程中巨噬細(xì)胞的浸潤，減少斑塊[21]。TLR4缺陷小鼠模型由于左室重塑減少，心肌梗死后梗死面積顯著減小，存活率提高[22]。研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死大鼠中的活性氧（reactive oxygen species，ROS）和NF-κB水平明顯高于對照組；進(jìn)一步的探索揭示心室旁核（paraventricular nucleus，PVN）內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活通過TLR4/NF-κB信號通路和ROS的產(chǎn)生參與心肌梗死后的交感興奮；此外，抑制PVN中TLR4和NF-κB可減輕交感神經(jīng)過度活躍和心肌梗死后的室性心律失常[23]。這一系列發(fā)現(xiàn)表明TLR4與CHD的發(fā)病有著密切關(guān)聯(lián)。

2.3 TLR7與CHD

TLR7是一種定位于核內(nèi)體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的胞內(nèi)受體，顯著表達(dá)于病毒感染及自身免疫性疾病中，在冠狀動脈疾病中亦可表達(dá)[24]。除免疫細(xì)胞外，TLR7還在內(nèi)皮細(xì)胞、動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞和血小板中表達(dá)，這些細(xì)胞在血管和心臟事件中高度活躍[25]。研究表明巨噬細(xì)胞通過TLR7/MyD88信號途徑誘導(dǎo)TNF-α、IL-6和IL-10等細(xì)胞因子的釋放而發(fā)揮炎癥作用[25-26]。TLR7亦可識別斑塊形成過程中宿主細(xì)胞凋亡后釋放的內(nèi)源性ssRNAs，進(jìn)而形成免疫風(fēng)暴，加劇心肌細(xì)胞的損傷及動脈粥樣硬化斑塊形成[24]。更為嚴(yán)重的是，TLR7可導(dǎo)致心肌梗死后不良左心室重塑[27]。TLR7激活的血小板可加速中性粒細(xì)胞聚集，增加血栓形成的風(fēng)險[28]。而另一方面，TLR7可能干擾TLR2和TLR4的炎癥效應(yīng)，減少單核細(xì)胞趨化蛋白-1的產(chǎn)生，并減少巨噬細(xì)胞在動脈粥樣硬化病變中的聚集，抑或是通過降低血漿膽固醇來發(fā)揮其潛在的保護(hù)作用[28-29]。TLR7這種促進(jìn)與抑制動脈粥樣硬化的雙向調(diào)節(jié)機(jī)制可能是由于其介導(dǎo)的抗炎細(xì)胞因子IL-10與促炎細(xì)胞因子的相互拮抗。

2.4 TLR9與CHD

除TLR2、TLR4和TLR7外，TLR9對血管炎癥和動脈粥樣硬化的發(fā)展亦有貢獻(xiàn)。動脈粥樣硬化病變過程中血管壞死釋放未甲基化的寡核苷酸CpG基序，作為內(nèi)源性配體被TLR9識別，從而激活巨噬細(xì)胞發(fā)揮固有免疫效應(yīng)，促進(jìn)IL-6、干擾素（INF）-α等炎癥因子的產(chǎn)生，加快泡沫細(xì)胞的聚集以及動脈粥樣硬化斑塊的形成，亦可增加CD4＋T細(xì)胞對血管平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞毒活性[30]。類似地，漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（plasmacytoid dendritic cells，pDCs）通過TLR9信號活化，產(chǎn)生IFN-Ⅰ等促炎因子加劇血管病變。一項小鼠研究顯示，與遠(yuǎn)端或非梗死區(qū)相比，心肌梗死區(qū)Tlr9基因表達(dá)增加[31]。TLR9的刺激會損害急性血管損傷后的再內(nèi)皮化，不改變內(nèi)皮依賴性血管舒張，同時增加Apoe-/-小鼠的斑塊形成。但也有一些研究者認(rèn)為，TLR9除了加速動脈粥樣硬化斑塊的形成，還對動脈粥樣硬化具有潛在的保護(hù)作用。TLR9通過調(diào)節(jié)能量代謝和血管生成改善心肌梗死后的心臟功能[32]。此外，研究者發(fā)現(xiàn)某些藥物（如養(yǎng)心舒脈顆粒）可以通過TLR9/MyD88/NF-κB信號通路調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，減輕動脈粥樣硬化[33]。TLR9在動脈粥樣硬化中的雙向調(diào)節(jié)作用體現(xiàn)出TLR9的獨特機(jī)制。

3 靶向TLRs藥物治療CHD

TLRs靶向治療最初的臨床應(yīng)用主要集中在腫瘤和感染，但越來越多的證據(jù)表明，TLRs在動脈粥樣硬化中發(fā)揮重要作用，選擇性靶向TLRs可能成為一個有前景的CHD治療策略。

3.1 TLR2調(diào)節(jié)劑

阻斷TLR2途徑被認(rèn)為可以抑制動脈粥樣硬化過程中細(xì)胞因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白質(zhì)產(chǎn)生?？筎LR2單克隆抗體可通過減少NF-κB介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子、白細(xì)胞內(nèi)流和促凋亡信號通路，減少梗死面積并改善心功能[34]。T2.5是具有治療潛力的抗TLR2抗體之一，其通過抑制心臟中的巨噬細(xì)胞募集和炎癥來預(yù)防血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心臟纖維化[8]。同樣作為TLR2抗體的Opn301，可以阻斷TLR2誘導(dǎo)的細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)，改善心臟功能并減少缺血再灌注損傷小鼠的梗死面積[6]。丹參素通過抑制巨噬細(xì)胞TLR2/NFκB 信號通路發(fā)揮顯著的抗炎作用，這一現(xiàn)象支持了其在治療動脈粥樣硬化和心臟的缺血再灌注損傷中的療效[35]。人參皂苷Rh1通過阻斷脂多糖與TLR2和TLR4的結(jié)合來抑制脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥和細(xì)胞凋亡[36]。此外，黃芪甲苷可以上調(diào)miR-101a表達(dá)，從而抑制TLR2的表達(dá)，具有潛在的抗炎活性和治療心血管疾病的作用[37]。

3.2 TLR4調(diào)節(jié)劑

一些心血管藥物可以通過減弱TLR4信號來發(fā)揮多效抗炎和抗動脈粥樣硬化作用。例如他汀類藥物可以抑制TLR4/MyD88信號傳導(dǎo)并引起免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡讘?yīng)答來降低氧化應(yīng)激，也可通過降低TLR2和TLR4的表達(dá)抑制NF-κB途徑來介導(dǎo)動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定[6]。阿托伐他汀可顯著降低TLR4和NF-κB的表達(dá)水平，同時下調(diào)TNF-α水平，并且可以抑制C-反應(yīng)蛋白誘導(dǎo)的TLR4過表達(dá)和人CD14單核細(xì)胞促炎細(xì)胞因子的大量釋放。噻唑烷二酮類藥物的抗動脈粥樣硬化作用也可能是通過抑制TLR4信號通路而實現(xiàn)的[17]。此外，柯里拉京（一種水溶性鞣質(zhì)）通過抑制TLR4-NF-κB/MAPK信號通路的激活來對抗M1型巨噬細(xì)胞極化和炎癥，從而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用[38]。益生元菊粉已被證明可以降低脂多糖管腔濃度并減輕Apoe-/-小鼠的動脈粥樣硬化[6]。大黃通過調(diào)節(jié)血脂及抑制TLR4和炎癥因子的表達(dá)，也顯示出抗動脈粥樣硬化和斑塊穩(wěn)定特性。盡管這些藥物尚未應(yīng)用于CHD的治療，但它們可能通過靶向TLR4信號傳導(dǎo)來預(yù)防動脈粥樣硬化的形成。

3.3 TLR7調(diào)節(jié)劑

TLR7在動脈粥樣硬化過程中調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，平衡促炎-抗炎細(xì)胞因子的分泌。研究發(fā)現(xiàn)，TLR7拮抗劑通過干擾其配體來阻斷TLR7信號傳導(dǎo)，從而減少新生內(nèi)膜、管腔狹窄和泡沫細(xì)胞的形成，同時減少了動脈壁巨噬細(xì)胞浸潤[26]?？菃慰雇ㄟ^選擇性抑制TLR7下游的IL-1β水平進(jìn)而改善心血管結(jié)局，并且具有降低血脂的作用[24]。腦心通顯著抑制腦缺血時大腦皮層和心臟中TLR7的表達(dá)，可能在一定程度上減少動脈粥樣硬化的發(fā)生[39]。黃連解毒湯可通過調(diào)節(jié)TLR7/MyD88/NF-κB通路抑制氧化低密度脂蛋白干預(yù)的RAW264.7源性泡沫細(xì)胞炎癥反應(yīng)，這可能是黃連解毒湯抗動脈粥樣硬化的分子機(jī)制之一[40]。加味補(bǔ)陽還五湯抑制TLR7及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)改善主動脈細(xì)胞的炎性浸潤程度和斑塊管腔占比[41]。這些研究表明TLR7及下游通路的阻斷可能是一種有效的CHD治療方法。有研究用TLR7配體咪喹莫特刺激小鼠后，觀察到IL-10和TNF-α的分泌濃度與咪喹莫特劑量成正相關(guān)。考慮到IL-10和TNF-α分別為典型的抗炎和促炎因子，因此，該研究表明TLR7的活化能夠雙向調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[24]。目前TLR7激動劑及拮抗劑在CHD中可能帶來的影響仍不清楚，因此未來需要開展更多的研究，以更好地了解其治療效果。

3.4 TLR9調(diào)節(jié)劑

研究發(fā)現(xiàn)，通過干預(yù)TLR9配體來調(diào)控免疫反應(yīng)，進(jìn)而控制動脈粥樣硬化的發(fā)展，可作為心臟缺血或其他損傷后組織修復(fù)的治療措施。E6446是一種具有口服生物活性的TLR9抑制劑，小鼠實驗表明其可通過阻斷TLR9與配體的結(jié)合，從而預(yù)防左心室擴(kuò)張、心功能不全及纖維化的發(fā)生或延緩其進(jìn)展[42]。羥氯喹可以通過阻斷TLR9與其配體的結(jié)合，進(jìn)而抑制IFN-Ⅰ的產(chǎn)生來減輕心肌梗死程度[43]。解毒祛瘀滋陰方可通過促進(jìn)膽固醇外排，抑制TLR9/MyD88激活，緩解系統(tǒng)性紅斑狼瘡合并動脈粥樣硬化的癥狀[44]。養(yǎng)心舒脈顆粒通過TLR9/MyD88/NF-κB信號通路調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，減輕動脈粥樣硬化程度[33]。Wang等[45]報道了抗菌肽CRAMP通過激活心肌細(xì)胞中TLR9/AMPKα途徑改善心肌梗死中的心功能障礙?？紤]到TLR9有促動脈粥樣硬化和抗動脈粥樣硬化的雙向調(diào)節(jié)作用，需要更好地了解TLR9激動劑和抑制劑的治療效果，以實現(xiàn)把TLR9作為治療靶點的CHD治療策略。

截至目前，一些靶向TLRs治療CHD的潛在藥物已被發(fā)現(xiàn)，其療效及安全性亦被探索，匯總見表1。

表1 TLR調(diào)節(jié)劑在冠心病臨床開發(fā)中的潛在作用Tab 1 Potential role of TLR modulators in clinical development of CHD

4 總結(jié)展望

TLRs激活引發(fā)的促炎活性可能是促進(jìn)動脈粥樣硬化病變發(fā)展的關(guān)鍵因素。因此該信號通路可能作為CHD潛在的治療靶點。然而，靶向TLRs的調(diào)節(jié)治療是否可以改變CHD的進(jìn)展尚未可知?？傊?，TLRs信號是一把雙刃劍，作為生理和病理介質(zhì)發(fā)揮雙重作用，因此在開發(fā)相關(guān)藥物時，必須掌握這一通路的信號強(qiáng)度。此外，最佳干預(yù)時機(jī)的確定亦極其重要。值得注意的是，人體內(nèi)有許多信號通路，存在相互串?dāng)_的現(xiàn)象，并且人和小鼠之間的物種差異可能會加大轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的難度。因此，基于免疫的心血管治療仍存在許多不確定性。目前對TLRs的研究還很有限，需要對TLRs信號及其交叉通路進(jìn)行更深入地研究。