雷公藤對腎臟的毒性與保護(hù)作用及機(jī)制的研究進(jìn)展

劉靈，張慧民，曹蓉，羅歡，楊艷，鄒攀，席洋，龔慧，江志超*，顏苗*（.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙 008；.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，長沙 00；.湖南省直中醫(yī)醫(yī)院，湖南 株洲 006；.梧州市工人醫(yī)院，廣西 梧州 00；.廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院，廣西 桂林 00）

雷公藤包含雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷公藤多苷等多種化合物，具有良好的抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等活性[1-2]，可用于治療一些炎癥性疾病和自身免疫性疾病[3]。糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）、腎病綜合征（nephrotic syndome，NS）等是進(jìn)展為終末期腎病（end-stage renal disease，ESRD）的常見原因，現(xiàn)有治療藥物療效有限[4-5]。近年來報道顯示雷公藤用于DN、NS模型有減輕蛋白尿、改善腎功能的作用[6-8]。但雷公藤同時也會損傷肝臟、生殖系統(tǒng)、腎臟等[9]，這使其臨床應(yīng)用受到限制。因此如何減毒增效是關(guān)鍵。根據(jù)病癥毒理學(xué)思想，需基于機(jī)體的疾病狀態(tài)考察中藥毒性，以摸索治療窗[10]，尋找調(diào)控毒、效作用的靶點(diǎn)蛋白，闡明雷公藤的毒、效“雙向”調(diào)控機(jī)制，實(shí)現(xiàn)“辨證控毒”。因此本文同時闡述雷公藤對腎臟的保護(hù)與損傷作用及機(jī)制，旨在為開展雷公藤量-效/毒研究提供參考。

1 雷公藤對腎臟的保護(hù)

1.1 抑制腎臟纖維化

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）中，上皮細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化，轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞，同時釋放細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)纖維化[11]。糖尿病以及高糖條件會引起腎細(xì)胞損傷，可出現(xiàn)EMT，雷公藤可下調(diào)EMT的相關(guān)調(diào)節(jié)通路，起到抑制纖維化的作用。適當(dāng)劑量范圍的雷公藤甲素可抑制NLRP3炎癥小體活化，改善足細(xì)胞EMT，也可以通過PTENK27-polyUb抑制腎上皮細(xì)胞EMT，通過miR-188-5p-PI3K-AKT通路抑制DN的EMT[12-14]。TGF-β1可通過Smad依賴途徑和Smad非依賴途徑（如激活p38和ERK 1/2），誘導(dǎo)纖維化[15]。雷公藤甲素可抑制Smad2激活，阻止細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成，又可激活p38和ERK 1/2，促進(jìn)ECM合成。在TGF-β1誘導(dǎo)的腎細(xì)胞中，雷公藤甲素增強(qiáng)了TGF-β1誘導(dǎo)的 p38、ERK 1/2信號激活，而抑制了Smad2的激活，進(jìn)一步抑制了ECM合成[16]。轉(zhuǎn)錄輔因子Ski通過阻斷Smad與CBP/P300結(jié)合，抑制TGF-β/Smad通路[17]。雷公藤甲素可上調(diào)Ski蛋白表達(dá)，從而抑制TGF-β1/Smad3通路，進(jìn)而降低纖維化程度[18]。大麻素受體2（cannabinoid receptor 2，CB2R）激動可減輕纖維化生成[19]，雷公藤紅素可抑制Smad3磷酸化，上調(diào)CB2R，從而減輕腎纖維化[20]。雷公藤多苷可抑制TLR4/NF-κB通路，減輕糖尿病（DM）大鼠腎臟間質(zhì)纖維化[21]。其中雷公藤多苷使DM大鼠腎小管上皮細(xì)胞E-cadherin上調(diào)，α-SMA下調(diào)，抑制了EMT。由此可見，雷公藤可抑制腎臟纖維化，主要涉及EMT、AKT、CB2R、TGF-β1/Smad信號通路以及TLR4/NF-κB通路。

1.2 抑制腎小球硬化

研究表明，雷公藤多苷通過上調(diào)SAMD7，下調(diào)p-SMAD2/3，減輕大鼠腎小球硬化[22]。NF-κB及p38 MAPK與腎小球損傷，腎小球硬化密切相關(guān)[23]，而雷公藤多苷可以下調(diào)DN模型大鼠腎臟中p38 MAPK，p-IκB，NF-κB（p65）的表達(dá)[24]，從而減輕腎小球硬化。

雷公藤甲素可通過調(diào)節(jié)PDK1/AKT/mTOR和miR-137/Notch1通路，抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖，減少腎小球系膜間質(zhì)ECM沉積，減輕DN腎小球硬化[25-26]。

因此，雷公藤可抑制腎小球硬化，可能涉及TGF/SMAD通路、PDK1/AKT/mTOR通路、miR-137/Notch1通路、p38 MAPK和NF-κB信號通路。

1.3 抗氧化

細(xì)胞氧化應(yīng)激時導(dǎo)致氧化自由基和活性氧（reactive oxygen species，ROS）過量產(chǎn)生[27]。急性腎損傷或者慢性腎病中，氧化應(yīng)激引起細(xì)胞損傷和腎功能受損[28-29]。研究發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素或雷公藤紅素上調(diào)DM、缺血-再灌注腎損傷或者急性腎損傷模型中腎臟抗氧化酶，如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），過氧化氫酶（catalase，CAT），谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR），下調(diào)脂質(zhì)過氧化物丙二醛（malondialdehyde，MDA），一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）和羰基化蛋白水平，起到保護(hù)腎臟的作用[30-32]。研究表明，雷公藤甲素誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS，激活腎細(xì)胞Nrf2通路，上調(diào)下游抗氧化酶表達(dá)，調(diào)節(jié)氧化還原平衡，減少細(xì)胞死亡[33]，雷公藤內(nèi)酯三醇可通過恢復(fù)Nrf2通路抗氧化應(yīng)激，減輕腎毒性[34]。

足細(xì)胞構(gòu)成腎小球?yàn)V過屏障，其結(jié)構(gòu)和功能對維持腎功能至關(guān)重要[35]。雷公藤可減輕蛋白尿，這與其保護(hù)足細(xì)胞相關(guān)[36-37]。無論是在體內(nèi)還是在體外的足細(xì)胞損傷模型[TGF-β1和氨基核苷嘌呤霉素（PAN）誘導(dǎo)]中，GADD45B均介導(dǎo)足細(xì)胞損傷、凋亡。ROS通過激活ROSGADD45B-p38 MAPK通路加重足細(xì)胞損傷[38]。而雷公藤甲素可通過抑制p38 MAPK和ROS產(chǎn)生減輕PAN引起的足細(xì)胞損傷，從而保護(hù)腎臟[39]。

1.4 抗炎

NF-κB介導(dǎo)的炎癥參與了腎臟病的發(fā)生和進(jìn)展，如DN、IgA腎病、狼瘡性腎炎[40-42]。研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素或雷公藤紅素下調(diào)了db/db或鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的DM模型腎臟NF-κB表達(dá)，減輕了腎損傷[43-44]。腎靶向的雷公藤甲素-葡萄糖胺共軛物（TPG）下調(diào)缺血-再灌注腎臟促炎細(xì)胞因子（TNF-α，IL-6，IL-1，TGF-β）和單核細(xì)胞趨化因子-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1），減輕了腎損傷[45]。雷公藤紅素抑制順鉑激活的NF-κB途徑[46]，減輕腎臟炎癥，改善腎功能。p53可通過NF-κB間接激活GADD45b，研究發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素可抑制p53-NF-κB-GADD45B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，保護(hù)足細(xì)胞，維持腎小球屏障功能[47]。

1.5 抗細(xì)胞凋亡

凋亡即細(xì)胞程序性死亡[48]，足細(xì)胞凋亡與腎病發(fā)生發(fā)展有關(guān)，足細(xì)胞缺失是DN發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制，而凋亡是足細(xì)胞缺失的重要原因[49-52]。雷公藤內(nèi)酯三醇可能通過抑制PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，恢復(fù)細(xì)胞存活來發(fā)揮其保護(hù)作用[53]。雷公藤苷組分n2對阿霉素誘導(dǎo)的NS大鼠模型有明顯的抗凋亡效應(yīng)，可上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2，下調(diào)促凋亡蛋白Bax和上游轉(zhuǎn)錄因子p53，抑制凋亡的效應(yīng)蛋白caspase 8、caspase 9和caspase 3裂解激活等[54]。同時也有研究發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素可下調(diào)凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）的表達(dá)水平[13]。

1.6 調(diào)節(jié)自噬

自噬是維持細(xì)胞代謝穩(wěn)態(tài)的重要生理過程。自噬激活可清除致病蛋白或受損的線粒體，起到治病或減毒作用[55-56]，但雷公藤甲素又可引起線粒體自噬產(chǎn)生肝毒性[57]。因此，自噬激活具有保護(hù)或損傷細(xì)胞的雙重作用。在DN中，自噬受到抑制[58]，激活自噬，可降解膠原蛋白和TGF-β1，抑制腎纖維化進(jìn)展[59]。研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素可保護(hù)IgA腎病患者的足細(xì)胞自噬[60]，同時雷公藤甲素可下調(diào) miR-141-3p/PTEN/AKT/mTOR通路[61]，雷公藤多苷可上調(diào)PI3K/AKT通路，均激活自噬[62]，起到腎臟保護(hù)作用。研究者發(fā)現(xiàn)雷公藤多苷片可通過抑制PI3K/AKT/mTOR自噬信號通路對DN大鼠腎臟損傷起到保護(hù)作用[63]。血紅素加氧酶-1（HO-1）參與調(diào)節(jié)自噬[64-65]。HO-1是催化血紅素分解的限速酶，可抗氧化、抗炎、保護(hù)細(xì)胞。雷公藤紅素可上調(diào)HO-1激活自噬，從而發(fā)揮抗炎、抗凋亡、抑制胰島素抵抗作用[66]。因此雷公藤通過調(diào)控HO-1、PI3K/AKT通路和PTEN/AKT/mTOR通路，激活DN自噬，減輕腎損傷。

1.7 免疫調(diào)節(jié)

NS是一種非常嚴(yán)重的腎病，接近12%的ESRD以及高達(dá)20%的兒童ESRD由NS引起。膜性腎?。╩embranous nephropathy，MN）是最常見的成人NS[67]。研究報道雷公藤多苷聯(lián)合他克莫司或潑尼松治療MN，其療效不亞于免疫抑制劑[68-70]。雷公藤甲素可促進(jìn)CD4＋T細(xì)胞分化為FoxP3＋Treg細(xì)胞，或上調(diào)miR-125a-5p，使Treg的比例增大，減輕腎臟損傷[71]。雷公藤多苷或雷公藤紅素可調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞平衡，減輕腎臟損傷或抑制自身免疫性炎癥[72-74]。雷公藤紅素下調(diào)Th17細(xì)胞STAT3，抑制Th17細(xì)胞產(chǎn)生，并上調(diào)Treg細(xì)胞STAT5、FoxP3，促進(jìn)Treg細(xì)胞增殖。雷公藤可抑制腎移植免疫排斥，研究發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素抑制了皮膚移植物受體小鼠供體特異性抗體（donor-specific antibody，DSA）的產(chǎn)生，減輕了腎移植損傷。同時，雷公藤甲素抑制B細(xì)胞分化為CD138與CD27漿細(xì)胞，且降低漿細(xì)胞分泌的IgG、IgA、IgM水平[75]。雷公藤可降低血漿炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-17）、趨化因子[MCP-1、IP10和干擾素誘導(dǎo)的單激素（Mig）]水平，降低腎臟補(bǔ)體C3、IgG沉積，抑制腎臟巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞和T細(xì)胞浸潤，從而治療腎小球腎炎、狼瘡性腎炎[76-78]。另外，雷公藤甲素類似物（5R）-5-羥基雷公藤內(nèi)酯（LLDT-8）上調(diào)了腎細(xì)胞Fcγ受體ⅡB（FcγRⅡB）的表達(dá)，使src同源2-含肌醇-5’-磷酸酶1[Src Homology 2（SH2）-containing inositol 5’-phosphatase，SHIP1]磷酸化，從而抑制了FcR下游激酶BTK激活，抑制免疫[77]。

綜上所述，雷公藤可能對NS、腎小球腎炎有效，同時也可抑制腎移植免疫排斥反應(yīng)。其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡、抑制免疫性炎癥有關(guān)。

1.8 損傷修復(fù)

Wnt信號在急性腎損傷和慢性腎病腎臟的再生和修復(fù)當(dāng)中起到重要作用[79]。雷公藤可通過降低DM大鼠腎臟中Wnt-1和β-catenin的表達(dá)，減輕腎損傷[80]。一定濃度的雷公藤甲素可抑制高糖誘導(dǎo)激活的Wnt3α/β-catenin通路，并進(jìn)一步抑制足細(xì)胞EMT[81]。另有報道稱雷公藤及其雷公藤甲素對Wnt/β-catenin信號通路具有調(diào)控作用[82-83]，提示雷公藤可能通過作用于Wnt/β-catenin，減輕腎損傷。

1.9 抑制細(xì)胞增殖

IL-6與IL-6受體結(jié)合，進(jìn)而磷酸化STAT3，可促進(jìn)細(xì)胞增殖，而細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子3（SOCS3）與JAK2相互作用，可抑制JAK2對STAT3的磷酸化激活，從而抑制細(xì)胞增殖。雷公藤甲素通過上調(diào)SOCS3，下調(diào)IL-6和IL-6受體抑制囊腫細(xì)胞增殖，延緩動物常染色體顯性遺傳性多囊腎病的進(jìn)展[84]。另外雷公藤甲素促進(jìn)Ca2＋依賴的囊腫細(xì)胞周期阻滯，從而抑制Pkd1-/-胚胎囊腫生成[85-86]。

雷公藤的腎臟保護(hù)機(jī)制見表1。

表1 雷公藤的腎保護(hù)機(jī)制Tab 1 Renoprotective mechanism of tripterygium wilfordii

2 雷公藤的腎毒性

2.1 氧化應(yīng)激損傷

核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）通路是機(jī)體內(nèi)的主要的抗氧化防御系統(tǒng)，下游抗氧化酶如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、SOD、CAT可清除機(jī)體內(nèi)過多的自由基和氧化物，保護(hù)腎臟[88]。研究發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素可明顯抑制Nrf2介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)，促進(jìn)氧化應(yīng)激，加重?fù)p傷[89-91]。雷公藤甲素可激活 GSK-3β/Fyn依賴的泛素化途徑，促進(jìn)Nrf2降解，誘導(dǎo)氧化損傷和凋亡[92]。Yang等[93]發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素會引起嚴(yán)重的氧化應(yīng)激，使大鼠腎臟SOD和GSH-Px活性顯著降低，MDA含量顯著增加，并導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)和功能嚴(yán)重受損，并且發(fā)現(xiàn)大鼠經(jīng)雷公藤甲素處理會產(chǎn)生大量ROS。

一定劑量的雷公藤多苷使腎臟谷胱甘肽（glutathione，GSH）、GST、GSH-Px、SOD、CAT以及抗炎因子IL-10表達(dá)明顯下降，而促炎因子TNF-α水平明顯上升，引起動物腎臟損傷[94-95]，這是由于雷公藤引起抗氧化酶表達(dá)下降，打破了機(jī)體內(nèi)氧化還原平衡，體內(nèi)ROS相對增多，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥激活，導(dǎo)致了腎臟損傷，ROS在雷公藤甲素誘導(dǎo)的腎損傷中起著關(guān)鍵作用。

2.2 凋亡激活

細(xì)胞凋亡包括外源性途徑（即死亡受體途徑）和內(nèi)源性途徑（由Bcl-2家族調(diào)控）。雷公藤甲素調(diào)節(jié)這兩條途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在腎小管上皮細(xì)胞中，雷公藤甲素首先上調(diào)跨膜糖蛋白Fas、Fas的配體FasL，促進(jìn)FasL結(jié)合Fas而激活外源性途徑；另一方面，雷公藤甲素上調(diào)大鼠腎小管上皮細(xì)胞線粒體表面Bcl-2家族蛋白Bax、Bid、Bad，而對抗凋亡的Bcl-2表達(dá)無影響，進(jìn)而激活內(nèi)源性途徑。除此之外，雷公藤甲素上調(diào)c-caspase3（cleavedcaspase3），促進(jìn)底物PARP（DNA剪切修復(fù)酶）分解，引起DNA損傷，最終導(dǎo)致凋亡[96]。雷公藤甲素可上調(diào)Bax、Bid、Bad、Fas和FasL的蛋白和mRNA的表達(dá)，以及上調(diào)Bax與Bcl-2的比值，引起腎小管細(xì)胞凋亡和腎臟損傷[93]。

2.3 藥物轉(zhuǎn)運(yùn)

腎臟的某些特殊轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)雷公藤腎毒性。在膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠模型中，雷公藤甲素加劇腎臟損傷，這是由于有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2將過量雷公藤甲素轉(zhuǎn)運(yùn)至腎小管細(xì)胞所致，藥物轉(zhuǎn)運(yùn)外排蛋白無法及時將多余雷公甲素排出而加重毒性[97]。雷公藤的腎毒性機(jī)制見表2及圖1。

圖1 雷公藤腎毒性機(jī)制Fig 1 Mechanism of renal toxicity of tripterygium

表2 雷公藤腎毒性機(jī)制Tab 2 Renal toxic mechanism of tripterygium wilfordii

3 總結(jié)與展望

臨床上常用的雷公藤制劑（雷公藤多苷片、雷公藤片與雷公藤雙層片等）時常引起急性腎衰竭等嚴(yán)重不良反應(yīng)[101]，如何減毒增效是雷公藤臨床毒理研究的重點(diǎn)。目前雖有炮制減毒、配伍減毒、化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾、新劑型改良的減毒增效方法[102]，但是許多方法僅適用于中草藥，且一些方法尚處于研究階段，并不能滿足臨床需要。另外，基于“證”進(jìn)行中藥安全性評價[10]，對雷公藤“證-量-效/毒”關(guān)系的深入研究或許能提供減毒新思路。一方面，該研究方式旨在摸索治療窗，在中醫(yī)“有故無殞”思想指導(dǎo)下，使用合適劑量減輕或者規(guī)避毒性。另一方面，旨在尋找調(diào)控毒/效轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵蛋白，以揭示“量-效/毒”關(guān)系的潛在機(jī)制。由于雷公藤作用于細(xì)胞的整個分子信號網(wǎng)絡(luò)，故可借助多種組學(xué)技術(shù)、生信分析等，找到雷公藤的作用通路和靶點(diǎn)以及毒性生物標(biāo)志物，揭示毒效機(jī)制，并對腎損傷進(jìn)行預(yù)警。

本文綜述了雷公藤在腎臟方面的保護(hù)與毒性作用及機(jī)制，其中雷公藤對氧化應(yīng)激有激活與抑制的雙向調(diào)控作用，一定濃度的雷公藤甲素誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS，激活了腎細(xì)胞Nrf2，下游抗氧化酶表達(dá)增多，調(diào)節(jié)氧化還原平衡，減少了細(xì)胞死亡[33]。而另一方面，雷公藤甲素又可以導(dǎo)致大量ROS產(chǎn)生導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷，產(chǎn)生腎毒性，且雷公藤甲素激活 GSK-3β/Fyn依賴的泛素化途徑，促進(jìn)Nrf2降解，誘導(dǎo)了氧化損傷和凋亡[92]。雷公藤這種雙向調(diào)控機(jī)制推測可能與雷公藤的劑量或干預(yù)時間有關(guān)。較低劑量、較短時間干預(yù)，細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)，Nrf2/ARE防御系統(tǒng)被激活而得以存活。而大劑量、長時間干預(yù)，細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)被破壞，細(xì)胞由于無法清除過量的自由基和氧化物而死亡。無獨(dú)有偶，使用低劑量dh404（一種Nrf2誘導(dǎo)劑）具有抗氧化、抗炎、抑制慢性腎病進(jìn)展的作用；但是高劑量反而會抑制Nrf2通路，加重蛋白尿和腎功能不全、炎癥[103]。對氧化應(yīng)激的雙向調(diào)控可能是雷公藤在實(shí)際運(yùn)用中實(shí)現(xiàn)“辨證控毒”的關(guān)鍵之處，而雷公藤劑量的把握是其中的核心。