槐米藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑與配方顆粒的HPLC特征圖譜相關(guān)性研究及量值傳遞分析

任晶，劉俊潼，鄢必新，白冰，展月，張慶賀*，陳長(zhǎng)寶*（.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，長(zhǎng)春 307；.吉林修正藥業(yè)新藥開發(fā)有限公司，長(zhǎng)春 3003）

槐米為豆科植物槐（SophorajaponciaL.）的干燥花蕾，其性微寒，味苦，具有涼血止血、清肝瀉火的功效，可用于便血、痔血、血痢、崩漏、衄血、肝熱目赤、頭痛眩暈等癥狀的治療[1]。槐米含有黃酮、皂苷、甾醇等成分，主要活性成分為蘆丁、槲皮素等黃酮類化合物[2]，其有效成分具有抗癌防癌、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化等多種活性，能夠改善心肌循環(huán)、清熱解毒、降血脂、軟化血管。我國是中藥槐米的原產(chǎn)地，在全國多地均有種植，資源豐富[3]?；泵着浞筋w粒是以槐米藥材為原料，經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒而成，經(jīng)中醫(yī)臨床配方后，供患者即沖即服的顆粒[4-5]。配方顆粒與藥材之間的藥效存在著較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，目前對(duì)槐米的質(zhì)量評(píng)價(jià)大多還著重于蘆丁的含量測(cè)定，如果僅用某成分的含量限度作為質(zhì)量控制指標(biāo)，較難全面地說明配方顆粒的整體質(zhì)量。目前有槐米藥材的指紋圖譜研究相關(guān)報(bào)道，但尚無對(duì)槐米及其制劑產(chǎn)品之間的相關(guān)性研究，更缺乏槐米藥材-飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑-配方顆粒特征圖譜之間的相關(guān)性研究。為保證槐米配方顆粒安全、有效、質(zhì)量可控，本研究建立了槐米藥材-飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑-配方顆粒的HPLC特征圖譜，對(duì)其相關(guān)性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并考察量值傳遞規(guī)律，不僅能全面控制配方顆粒的質(zhì)量，而且能反映配方顆粒制備工藝的穩(wěn)定性，為槐米配方顆粒制備全過程的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

戴安U3000高效液相色譜儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；MS105DU型電子天平、TOLEDO XPR2型百萬分之一分析天平（梅特勒-托利多公司）；SB25-12DT型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 材料

水仙苷（批號(hào)：111997-201501，純度：93.1%）、蘆?。ㄅ?hào)：100080-202012，純度：91.6%）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷（批號(hào)：112007-201602，純度：90.8%）、異鼠李素（批號(hào)：110860-202012，純度：99.1%）、異槲皮苷（批號(hào)：111809-202205，純度：96.3%）、槲皮素（批號(hào)：100081-201610，純度：99.1%）（中國食品藥品檢定研究院）；乙腈為色譜純（默克股份有限公司）；乙醇、甲醇、磷酸（分析純，北京化工廠）；其他試劑均為分析純。在全國范圍內(nèi)共收集樣品15批，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)陳長(zhǎng)寶教授鑒定為豆科植物槐（SophorajaponciaL.）的干燥花蕾，由修正藥業(yè)配方顆粒工藝研究室制成同批號(hào)飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒，批號(hào)及藥材具體來源見表1。

表1 樣品信息Tab 1 Sample information

2 方法與結(jié)果

2.1 槐米藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑與配方顆粒的HPLC 特征圖譜

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX SB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～15 min，17%～20%A；15～25 min，20%～25%A；25～35 min，25%～35%A；35～50 min，35%～45%A）；流速1.0 mL·min-1；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)257 nm；進(jìn)樣量5 μL。

2.1.2 參照物溶液制備 取槐米對(duì)照藥材0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率25 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，作為對(duì)照藥材參照物溶液。另取蘆丁、水仙苷對(duì)照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，作為對(duì)照品參照物溶液。

2.1.3 供試品溶液制備 根據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求（征求意見稿）》，制備槐米的標(biāo)準(zhǔn)湯劑（每克標(biāo)準(zhǔn)湯劑相當(dāng)于3.0 g 飲片），編號(hào) C1～C15，具體方法如下：取槐米飲片100 g，精密稱定，加10倍量水浸泡30 min，武火煮沸，文火保持微沸30 min，趁熱濾過；藥渣加8倍水煎煮，武火煮沸，文火保持微沸 30 min，趁熱濾過，合并兩次煎液，減壓濃縮，冷凍干燥得標(biāo)準(zhǔn)湯劑粉末。

稱取槐米藥材、飲片粉末（均過四號(hào)篩）約0.1 g，標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒粉末（研細(xì)）約0.03 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率25 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 測(cè)定 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各5 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄50 min色譜圖，見圖1～2。

圖1 對(duì)照特征圖譜（R）及槐米藥材（A）、飲片（B）、標(biāo)準(zhǔn)湯劑（C）、配方顆粒（D）HPLC特征圖譜Fig 1 Reference characteristic chromatogram（R），and HPLC characteristic chromatogram of raw herbs（A），pieces（B），standard（C），and formula granules（D）of 15 batches of FSI

圖2 槐米藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒HPLC對(duì)照特征圖譜Fig 2 HPLC characteristic chromatogram of SFI raw herbs，decoction pieces，standard decoction，and formula granules

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 專屬性試驗(yàn) 分別取空白溶液、對(duì)照品溶液及供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果如圖3所示，供試品溶液色譜在與各對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的保留時(shí)間處具有相同的色譜峰，指認(rèn)了蘆丁、異槲皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、槲皮素、異鼠李素6種成分，且空白溶劑無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖3 專屬性試驗(yàn)HPLC色譜圖Fig 3 HPLC chromatograms of specific test

2.2.2 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，分別對(duì)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果顯示各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD范圍分別為0.05%～0.11%和0.15%～2.5%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取供試品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法分別制備6份供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別對(duì)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積進(jìn)行考察，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD范圍分別為0.04%～0.15%和0.12%～2.8%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、18、24 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD范圍分別為0.02%～0.12%和0.17%～2.1%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.3 共有峰的標(biāo)定

將槐米配方顆粒的HPLC特征圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件”（2012版）對(duì)色譜圖進(jìn)行匹配，經(jīng)比較分析后確定7個(gè)共有峰，同法采集藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑的特征圖譜，發(fā)現(xiàn)藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑均有7個(gè)共有峰，與對(duì)照特征圖譜相似度均達(dá)到了0.90以上[6-7]，見表3。選擇峰5（水仙苷）為參照峰，因?yàn)樘J丁峰面積較大，超過總峰面積的50%，不適宜作為參照峰來計(jì)算其他峰的相對(duì)峰面積比，5號(hào)峰峰面積適中，所以選擇5號(hào)峰作為參照峰。

表3 15批槐米藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒特征圖譜的相似度Tab 3 Similarity of the characteristic chromatograms of 15 batches of SFI raw herbs，decoction pieces，standard decoction，and formula granules

2.4 相關(guān)性分析

從整體上看，槐米藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑及配方顆粒HPLC特征圖譜的1～7號(hào)峰是共有峰。結(jié)果顯示，15批次槐米藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒特征圖譜相似度分別在0.931～1.000，說明槐米藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒相似度極高，能夠較好地保留藥材的特征性成分，具有整體物質(zhì)的一致性，其化學(xué)成分相關(guān)性較好[8]。飲片經(jīng)過現(xiàn)代化提取、濃縮等工藝制成配方顆粒后主要化學(xué)成分組成基本相同，制得的槐米配方顆粒與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)湯劑具有一定的等效性，表明槐米配方顆粒的制備工藝穩(wěn)定、可行[9]。

2.5 含量測(cè)定及量值傳遞分析

2.5.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-1%冰醋酸溶液（32∶68）；檢測(cè)波長(zhǎng)257 nm；流速1 mL·min-1；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL。理論塔板數(shù)按蘆丁峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。

2.5.2 溶液的制備 取蘆丁對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.05 mg的溶液，即得。供試品溶液制備方法同“2.1.3”項(xiàng)下。

2.5.3 指標(biāo)成分的含量及轉(zhuǎn)移率的測(cè)定 精密吸取各供試品溶液10 μL，按“2.5.1”項(xiàng)下方法對(duì)15批槐米藥材、飲片、提取物膏粉、配方顆粒、標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行含量測(cè)定[10]，按照以下公式計(jì)算蘆丁轉(zhuǎn)移率：槐米藥材-飲片轉(zhuǎn)移率（%）＝槐米飲片中指標(biāo)成分的含量/槐米藥材中指標(biāo)成分的含量×100%；槐米飲片-提取物膏粉轉(zhuǎn)移率（%）＝槐米提取物膏粉中指標(biāo)成分的含量×出膏率/槐米飲片中指標(biāo)成分的含量；槐米飲片-配方顆粒轉(zhuǎn)移率（%）＝槐米配方顆粒中指標(biāo)成分的含量×出膏率/槐米飲片中指標(biāo)成分的含量/干膏粉占比；槐米飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑轉(zhuǎn)移率（%）＝槐米標(biāo)準(zhǔn)湯劑中指標(biāo)成分的含量×出膏率/槐米飲片中指標(biāo)成分的含量；出膏率（%）＝干膏重/飲片質(zhì)量×100%。結(jié)果見表4。

表4 15批樣品含量及轉(zhuǎn)移率測(cè)定結(jié)果Tab 4 Determination of content and transfer rate of 15 batches of samples

2.5.4 量值傳遞分析 標(biāo)準(zhǔn)湯劑是配方顆粒中間體和成品標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)鍵參照物，本研究得到的15批槐米飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑轉(zhuǎn)移率范圍為43.43%～59.00%，均值為51.19%；出膏率范圍為28.57%～34.21%，均值為32.07%；指標(biāo)成分含量范圍為26.30%～35.34%，均值為31.11%；對(duì)槐米配方顆粒生產(chǎn)過程中各關(guān)鍵環(huán)節(jié)樣品進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明各環(huán)節(jié)轉(zhuǎn)移率、出膏率及指標(biāo)性成分含量均在標(biāo)準(zhǔn)湯劑范圍內(nèi)，量值傳遞較好[11]。本研究中飲片-配方顆粒蘆丁轉(zhuǎn)移率略低于同批次飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑轉(zhuǎn)移率，可能由于標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備為冷凍干燥，未添加輔料；配方顆粒在生產(chǎn)過程中為噴霧干燥，制備過程中增添少量輔料，生產(chǎn)過程中出現(xiàn)指標(biāo)成分損失，造成轉(zhuǎn)移率略低。

3 討論

本研究在對(duì)特征圖譜方法建立過程中，分別采用甲醇、70%甲醇、乙醇不同提取溶劑及熱回流、超聲不同提取方法進(jìn)行考察，從提取的全面性、穩(wěn)定性、操作便捷性等方面進(jìn)行考察，最終選擇槐米提取溶劑為甲醇，提取方法為超聲提取法，提取時(shí)間為0.5 h。分別考察不同檢測(cè)波長(zhǎng)，結(jié)果表明在257 nm時(shí)各成分色譜行為較好，綜合考慮其出峰數(shù)量、峰形、響應(yīng)值等情況，選定檢測(cè)波長(zhǎng)為257 nm；考察柱溫為25、30、35℃的色譜圖，結(jié)合色譜峰分離度、對(duì)稱性及實(shí)際室內(nèi)溫，選定柱溫為30℃[12]。分別考察了乙腈-0.1冰醋酸、乙腈-0.05%、乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫，并對(duì)上述洗脫條件進(jìn)行調(diào)整，結(jié)果表明以乙腈-0.1%磷酸水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，色譜峰分離效果較好，峰形較好[13]。

配方顆粒作為中藥飲片改革的新趨勢(shì)，具有免煎煮、便于調(diào)配及攜帶、使用靈活、用藥精準(zhǔn)等優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)制劑工藝加工而成的中藥配方顆粒已失去了飲片所具有的外觀辨別特征，在顯微結(jié)構(gòu)下也不易鑒別，并且以單一成分衡量質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)很難反映配方顆粒的整體特征，特征圖譜能最大限度獲取配方顆粒、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、飲片及藥材之間的化學(xué)信息，高效地將中藥配方顆粒的內(nèi)在信息反饋在圖譜中，直觀觀察和評(píng)價(jià)內(nèi)在質(zhì)量[14]。本研究中，槐米藥材-飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑及配方顆粒的對(duì)照?qǐng)D譜的主要峰基本一致，主要化學(xué)成分組成基本相同，建立的 HPLC 特征圖譜確定了7個(gè)共有峰，并指認(rèn)了6個(gè)色譜峰，該分析方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，能較全面地反映槐米藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑及配方顆粒的內(nèi)在質(zhì)量[15]。通過對(duì)蘆丁含量及轉(zhuǎn)移率的測(cè)定，并以槐米標(biāo)準(zhǔn)湯劑為參照基準(zhǔn)，對(duì)槐米進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，全面反映了槐米配方顆粒量值傳遞情況，從而實(shí)現(xiàn)配方顆粒質(zhì)量專屬性與整體性的綜合管控，提高了配方顆粒質(zhì)量整體控制水平。