基于片段生長技術(shù)的PD-1/PD-L1小分子抑制劑的設(shè)計(jì)

趙東升，程鋮，廖偉科*（1.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽 550004；.貴州省化學(xué)合成藥物研發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，貴陽 550004）

腫瘤細(xì)胞在遺傳性以及表觀遺傳性方面與正常細(xì)胞差異顯著，能夠被免疫系統(tǒng)有效識(shí)別并清除，但腫瘤細(xì)胞會(huì)運(yùn)用不同的方式來避開免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。當(dāng)免疫檢查點(diǎn)分子過度表達(dá)或功能過強(qiáng)時(shí)，免疫功能將會(huì)受到抑制[1]，從而發(fā)生“免疫逃逸”的現(xiàn)象，加速腫瘤生長[2]。阻斷免疫檢查點(diǎn)分子的信號(hào)傳導(dǎo)成為治療腫瘤的常用方法，其中程序性細(xì)胞死亡受體1（PD-1）/程序性細(xì)胞死亡-配體1（PD-L1）通路是免疫檢查點(diǎn)中最具臨床價(jià)值的靶標(biāo)之一[3]。PD-1又叫CD279，是一種由272個(gè)氨基酸組成的跨膜蛋白[4]。PD-L1又叫CD274，是一種由290個(gè)氨基酸組成的跨膜蛋白[5]。PD-1和PD-L1的結(jié)合可以抑制T細(xì)胞的活性，減少自身免疫反應(yīng)，防止免疫系統(tǒng)過度反應(yīng)。在某些情況下，腫瘤細(xì)胞會(huì)利用這種機(jī)制來逃避免疫監(jiān)視，發(fā)生免疫逃逸從而促進(jìn)腫瘤的生長和擴(kuò)散[6]。隨著小分子與PD-1/PD-L1晶體復(fù)合物的解析，研究者們對(duì)于PD-1/PD-L1小分子抑制劑的開發(fā)也迎來蓬勃的發(fā)展階段，但是目前報(bào)道的小分子抑制劑均為聯(lián)苯母核結(jié)構(gòu)，且現(xiàn)有化合物臨床試驗(yàn)最高階段仍處于Ⅰ期臨床。因此，開發(fā)出結(jié)構(gòu)多樣性且安全有效的PD-1/PD-L1小分子抑制劑具有十分重要的意義。

藥物的從頭設(shè)計(jì)是一種不僅可以提出新型化學(xué)結(jié)構(gòu)，并且能夠滿足所需靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)特征的方法，這一方法隨著計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)的發(fā)展也逐漸受到眾多藥物化學(xué)家們的青睞[7]。相比虛擬篩選，藥物的從頭設(shè)計(jì)可以在分子片段生成的方式上尋找到特定性質(zhì)的全新結(jié)構(gòu)分子，在保留原有片段的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)分子結(jié)構(gòu)多樣性[8]。此前有報(bào)道幾種包含苯甲酰苯胺骨架的新型小分子，如圖1所示，這類分子不僅具有新穎的骨架結(jié)構(gòu)，也表現(xiàn)出良好的體內(nèi)外抑瘤活性[9-11]。為了保持新型的苯甲酰苯胺linker，本研究采用片段生長的從頭設(shè)計(jì)方法，以苯甲酰苯胺作為初始片段，將FDA化合物庫拆分為碎片，并在初始片段各位點(diǎn)迭代生長，進(jìn)一步將這一包含苯甲酰苯胺的數(shù)據(jù)庫作為對(duì)接篩選的對(duì)象，以期獲取潛在的PD-1/PD-L1小分子抑制劑。

圖1 4種苯甲酰苯胺骨架化合物Fig 1 Four benzanilide skeleton compound

1 材料與方法

1.1 平臺(tái)與軟件

本研究所有計(jì)算內(nèi)容均在北京并行超級(jí)計(jì)算中心平臺(tái)完成。

MolAICal軟件用于片段庫的準(zhǔn)備和片段生長[12]；AutoDock Vina軟件用于分子對(duì)接；AutoDock Tools軟件用來重置蛋白力場及原子類型；Pymol軟件用來進(jìn)行可視化結(jié)果分析[13]；Amber16軟件用來執(zhí)行分子動(dòng)力學(xué)模擬；Open Babel軟件用來作為格式間轉(zhuǎn)換。

1.2 數(shù)據(jù)庫準(zhǔn)備

從RCSB PDB（https：//www.rcsb.org/）蛋白數(shù)據(jù)庫獲取PD-L1蛋白（PDB ID：6r3k），使用AutoDock Tools程序?qū)ζ涮砑訕O性氫并合并非極性氫，刪除A、B兩條鏈并刪除水和溶劑分子，保存為pdbqt格式作為片段生長和分子對(duì)接的蛋白受體。從FDA官網(wǎng)獲取FDA分子庫，使用Open Babel軟件將其轉(zhuǎn)換為smi格式并打碎為片段，建立FDA碎片庫。

1.3 片段生長

使用AutoDock Vina將苯甲酰胺片段對(duì)接進(jìn)入PD-L1蛋白中，確定其初始構(gòu)象，將其各含氫鍵的原子定義為生長位點(diǎn)，以FDA碎片庫作為生長來源，生長范圍設(shè)定為30 ?×30 ?×30 ?，允許產(chǎn)生的新分子被迭代并且迭代次數(shù)為10。在迭代過程中，合成可行性較低的分子和相對(duì)分子量低于300、高于1000的分子即舍棄。產(chǎn)生的新分子根據(jù)打分進(jìn)行排序。

1.4 分子對(duì)接篩選

將片段生長建立的分子庫作為篩選的來源，PD-L1二聚體作為受體蛋白，每個(gè)小分子生成10個(gè)構(gòu)象，exhaustiveness設(shè)置為8，結(jié)合位點(diǎn)坐標(biāo)為x＝-7.118，y＝59.347，z＝-19.516。使用AutoDock Vina提交作業(yè)，保留打分靠前的分子。

1.5 分子動(dòng)力學(xué)模擬

將分子對(duì)接的結(jié)果作為分子動(dòng)力學(xué)模擬的初始構(gòu)象。然后對(duì)所有備選分子施加氫原子并進(jìn)行去質(zhì)子化。將小分子用Amber軟件中的antechamber程序施加bcc電荷和gaff2力場，并使用parmchk程序檢查該小分子是否還需要輔助力場參數(shù)。創(chuàng)建一個(gè)距離蛋白質(zhì)10 ?的溶劑立方體盒（cubic box），盒內(nèi)填充tip3p水模型，向配體-受體-溶劑體系中添加4個(gè)鈉離子以保持電中性。通過周期性邊界條件（PBC）消除邊界效應(yīng)。使各種組分的能量最優(yōu)化，其中蛋白質(zhì)、配體和抗衡離子的限制電位受到419 kJ/mol?2的力常數(shù)約束，水分子能級(jí)分布通過系統(tǒng)最小化調(diào)整以穩(wěn)定其狀態(tài)，同時(shí)進(jìn)一步最小化系統(tǒng)能量，蛋白和配體均成為另一組419 kJ/mol?2的力常數(shù)所約束。蛋白的骨架設(shè)有83.8 kJ/mol?2的力常數(shù)限制，并且只允許側(cè)鏈在進(jìn)行能量最小化時(shí)放松。釋放整個(gè)系統(tǒng)受到的限制并最大程度地降低其能量。體系能量優(yōu)化之后，在200 ps的等溫和等壓條件下，從10 K加熱到300 K，并在400 ps的平衡狀態(tài)模擬過程中進(jìn)行NPT系綜：等溫等壓系綜模擬。最后約束與氫原子相連的化學(xué)鍵并進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模擬，模擬積分步長設(shè)定為2 fs。

1.6 MM/GBSA結(jié)合自由能計(jì)算

結(jié)合自由能和每個(gè)殘基的分解自由能用Amber16中鑲嵌的MM/GBSA.py腳本計(jì)算。在MM/GBSA方法中，配體與蛋白質(zhì)受體結(jié)合形成絡(luò)合物的自由能可以用以下公式表示[14-15]：

ΔGbind＝ΔGcomplex-ΔGreceptor-ΔGligand＝ΔEinternal＋ΔEVDW＋ΔEelec＋ΔGGB＋ΔGSA

其中，ΔEVDW表示范德華相互作用，ΔEinternal表示內(nèi)能，ΔEelec表示靜電作用，ΔGGB和ΔGSA表示溶劑化自由能和非極性溶劑自由能。

1.7 PD-1/PD-L1阻斷實(shí)驗(yàn)

通過均相時(shí)間分辨熒光（HTRF）實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步測定受試化合物的IC50值。使用PD-1/PD-L1試劑盒（Cisbio公司），根據(jù)說明書操作：將抑制劑在二甲基亞砜（DMSO）中稀釋，然后用緩沖液連續(xù)稀釋到特定的濃度梯度（2.4～120 000 nmol·L-1），在12孔板上各加2 μL緩沖液，再加入4 μL Tag1-Pd-L1溶液、4 μL Tag2-Pd-1。在室溫下孵育15 min后，加入10 μL的anti-Tag1-Eu3＋和anti-Tag2-XL665。將板密封并在室溫下孵育2 h，用Envision讀取測試孔的信號(hào)值[16]。

2 結(jié)果與討論

2.1 片段生長

本研究的工作流程如圖2所示，以苯甲酰胺的初始片段經(jīng)過迭代后獲取了3891個(gè)分子，依據(jù)各分子與結(jié)合口袋的相互作用以及合成可行性保留排名前1000的分子進(jìn)一步作為虛擬篩選的數(shù)據(jù)庫來源；經(jīng)過AutoDock Vina對(duì)接打分后，保留打分最高的前8個(gè)分子（結(jié)構(gòu)如圖3所示，打分如表1所示），參照結(jié)合模式最終選取3個(gè)分子進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬并計(jì)算其MM/GBSA結(jié)合自由能，最終購買一個(gè)分子進(jìn)行體外活性驗(yàn)證。

表1 8個(gè)化合物對(duì)接打分(kJ·mol-1)Tab 1 Docking scoring of 8 compounds (kJ·mol-1)

圖2 抑制劑的發(fā)現(xiàn)流程Fig 2 Discovery process of inhibitors

圖3 8個(gè)候選化合物結(jié)構(gòu)Fig 3 Structure of 8 candidate compounds

2.2 結(jié)合模式分析

8個(gè)候選分子的結(jié)合模式如圖4所示。其中776191、J170、123641這3個(gè)具有更突出的結(jié)合模式。776191分子表現(xiàn)出最高的打分結(jié)果為-50.996 kJ·mol-1，并且與PD-L1形成非常豐富的氫鍵作用?？梢钥闯?，該分子與PD-L1二聚體蛋白C鏈上的66位谷氨酰胺，121位丙氨酸，D鏈上125位的精氨酸，123位的蘇氨酸，19位的苯丙氨酸，121位的丙氨酸，115位的甲硫氨酸共形成九根氫鍵相互作用，這些氫鍵將776191分子鉚定在PD-L1二聚體蛋白構(gòu)成的結(jié)合口袋里，展示了良好的結(jié)合作用。J170分子不僅與PD-L1蛋白C鏈的56位酪氨酸形成π-π堆積作用，還與C鏈的115位甲硫氨酸，121位丙氨酸，123位酪氨酸，D鏈的20位酪氨酸，54位異亮氨酸，56位酪氨酸，121位丙氨酸，123位酪氨酸形成疏水作用力，這些范德華作用驅(qū)動(dòng)J170更傾向進(jìn)入到蛋白的疏水空腔。123641分子與PD-L1蛋白也擁有良好的疏水作用，并且還與C鏈的56位酪氨酸，122位天冬氨酸，D鏈的123位酪氨酸，125位精氨酸形成氫鍵作用，此外123641還與C鏈的56位酪氨酸形成π-π堆積作用。

圖4 8個(gè)分子的結(jié)合模式Fig 4 Binding mode of 8 molecules

2.3 結(jié)合自由能計(jì)算

為了更精確地了解776191、J170、123641這3個(gè)分子的能量表現(xiàn)，本研究對(duì)其進(jìn)行了MM/GBSA的自由能計(jì)算，能量越低說明小分子與蛋白的復(fù)合物體系結(jié)合越強(qiáng)，結(jié)果如表2所示?？梢?76191表現(xiàn)出最低的結(jié)合自由能為-271.831 kJ·mol-1，其中范德華作用占據(jù)主導(dǎo)作用力為-362.720 kJ·mol-1，此外還具有-123.165 kJ·mol-1靜電作用提供的能量。在J170和123641兩個(gè)分子上同樣也是范德華占據(jù)主導(dǎo)作用，靜電作用力為次要作用，而極性溶劑化作用則大大地阻礙了復(fù)合物的結(jié)合。這一結(jié)果證明3個(gè)分子均是在疏水作用驅(qū)動(dòng)下與PD-L1蛋白發(fā)生緊密結(jié)合。

表2 3個(gè)化合物的結(jié)合自由能(kJ·mol-1)Tab 2 Binding free energy of 3 compounds (kJ·mol-1)

2.4 分子動(dòng)力學(xué)軌跡分析

由于776191具有較高的結(jié)合自由能，將其作為研究對(duì)象進(jìn)行動(dòng)力學(xué)軌跡分析。如圖5所示，綠色代表776191分子，紅色代表受體蛋白PDL1，黑色代表776191-PD-L1復(fù)合物體系?？梢钥闯?，在為期100 ns時(shí)長的生理環(huán)境模擬過程中，776191小分子表現(xiàn)出一定的波動(dòng)，但波動(dòng)幅度維持在3 ?左右，相對(duì)比于PD-L1受體蛋白可以看出，小分子的加入并未引起蛋白本身發(fā)生較大的波動(dòng)。鑒于776191分子本身的結(jié)構(gòu)特征，其包含較多的可旋轉(zhuǎn)鍵，不可避免地在運(yùn)動(dòng)過程中某些時(shí)刻發(fā)生鍵角的扭轉(zhuǎn)。因此可以認(rèn)為776191分子在模擬的運(yùn)動(dòng)過程中維持著一定的平穩(wěn)性。

2.5 PD-1/PD-L1阻斷實(shí)驗(yàn)

經(jīng)過上述實(shí)驗(yàn)最終確定了776191分子是最具有潛力的PD-L1小分子抑制劑，進(jìn)一步通過HTRF實(shí)驗(yàn)測定其體外PD-1/PD-L1抑制活性，如圖6所示，776191表現(xiàn)出中等的抑制活性，IC50為92 μmol·L-1。

圖6 HTRF法測定化合物776191的IC50Fig 6 IC50 determination of compound 776191 based HTRF assay

3 討論

PD-L1小分子抑制劑結(jié)構(gòu)多樣性的缺乏始終是阻礙其臨床發(fā)展的一大挑戰(zhàn)。本項(xiàng)研究通過確立一個(gè)新穎的苯甲酰苯胺片段，使用從頭設(shè)計(jì)的思路和片段生長的方法最終確證776191分子是一個(gè)具有一定PD-L1抑制活性的小分子抑制劑。

776191具有新穎的骨架結(jié)構(gòu)，然而其IC50為92 μmol·L-1的表現(xiàn)并沒有非常出色，這可能是由于以下原因引起：① 776191分子具有較多的氫鍵受體和可旋轉(zhuǎn)鍵，這可能造成極性溶劑對(duì)其結(jié)合能表現(xiàn)出214.702 kJ·mol-1的抑制作用；② 776191的溶解性存在一定的不足，這可能是影響其活性表現(xiàn)的直接原因。鑒于上述兩種原因，對(duì)776191在結(jié)構(gòu)上進(jìn)一步精簡優(yōu)化將可能獲得活性更加良好的分子，本研究為改造安全有效的PD-1/PD-L1小分子抑制劑奠定了理論基礎(chǔ)。