金星散水提液誘導(dǎo)ECA-109細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的作用及機(jī)制研究

李博，雷琨，劉家邑，劉軍鋒*，張珍（.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，西安 7000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽(yáng) 72046；.北京中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，北京 00029）

食管癌（esophageal cancer，EC）是消化系統(tǒng)中常見(jiàn)的惡性腫瘤，主要類型為食管鱗狀細(xì)胞癌和食管腺癌。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年全世界有超過(guò)54萬(wàn)人死于食管癌。食管癌發(fā)病隱匿，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，然而治療效果相對(duì)有限，5年生存率僅20%[1-2]。因此，亟需尋找有效治療食管癌的藥物。

金星散方源于著名中醫(yī)腫瘤專家賈堃的效驗(yàn)方，由郁金20 g、白礬20 g、火硝20 g、重樓20 g、蟾酥3 g、紅硇砂6 g、雞子殼30 g、料姜石30 g、天南星30 g組成，可攻堅(jiān)破積、利氣止痛、養(yǎng)血健胃、強(qiáng)心滋補(bǔ)、扶正祛邪，增強(qiáng)機(jī)體抗病能力，使腫瘤細(xì)胞退變、體積縮小以至消失[3-5]。但其是否具有抗食管癌的作用，并不清楚。本研究應(yīng)用人食管癌ECA-109細(xì)胞，探究金星散水提液抗人食管癌的作用及其機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞

人食管癌ECA-109細(xì)胞（廣州吉妮歐生物科技有限公司）。

1.2 試藥

CCK-8檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：BS350A，蘭杰柯科技有限公司）；Hoechst 33342染料（貨號(hào)：C1028）、流式細(xì)胞術(shù)凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：C1062M）（碧云天生物公司）；流式細(xì)胞術(shù)周期試劑盒（貨號(hào)：WLA010a，萬(wàn)類生物科技有限公司）；ROS/Superoxide檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：ENZ-51010，美國(guó)Enzo Life Sciences 公司）；Caspase-3（貨號(hào)：9662，美國(guó)Cell Signaling Technology公司）；Nrf2（貨號(hào)：ab137550，Abcam公司）；山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗（HRP標(biāo)記，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；金星散全部藥材由陜西省中醫(yī)醫(yī)院藥房提供。

1.3 儀器

SW CJ-2FD型超凈工作臺(tái)（江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司）；IX73 倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯）；311型細(xì)胞培養(yǎng)箱、Thermo Multiskan GO多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；Western blot曝光儀器Chemi Doc XRS＋（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

ECA-109細(xì)胞置于含10%血清的1640培養(yǎng)基中（含雙抗），37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

2.2 金星散水提液（簡(jiǎn)稱JXS水提液）的制備

金星散根據(jù)賈堃原方配比由陜西省中醫(yī)醫(yī)院藥房提供，經(jīng)張紅研究員鑒定符合要求。煎藥前先預(yù)泡10 min，加水煎煮2次，每次武火燒開(kāi)，文火微沸40 min，合并煎液、濾過(guò)、濃縮、冷凍干燥，獲得干藥粉末50.92 g（1 g粉末相當(dāng)于4.1 g藥材）。稱取10 g干藥粉末到41 mL純化水中，熱溶解后離心取上清液，0.45 μm水性膜過(guò)濾，即得1 g·mL-1JXS水提液。

2.3 CCK-8測(cè)定ECA-109細(xì)胞活性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期ECA-109細(xì)胞，2×104/孔（含1%血清的1640培養(yǎng)基）接種于96孔板內(nèi)，24 h后換液加藥，以不同劑量（0.49～1000 μg·mL-1）或在不同時(shí)間（6～48 h）刺激結(jié)束時(shí)，加10 μL/孔CCK-8檢測(cè)液，顯色后應(yīng)用多功能酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定OD，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[6]。

2.4 Hoechst染色

種細(xì)胞條件同“2.3”項(xiàng)下，換液加藥，以不同劑量（31.25～250 μg·mL-1）或在不同時(shí)間（6～48 h）刺激結(jié)束后，每孔加入Hoechst 33342染色液（×1000）10 μL，避光37℃ 10 min，熒光顯微鏡下觀察并拍照[7]。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)對(duì)ECA-109細(xì)胞凋亡和周期的檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期ECA-109細(xì)胞，2×106/孔（含1%血清的1640培養(yǎng)基）接種于6孔板內(nèi)，24 h后換液加藥，不同濃度JXS水提液刺激48 h后，每?jī)煽资┮韵嗤碳ぃūＷC細(xì)胞數(shù)量），收集細(xì)胞上清液到離心管中，消化貼壁細(xì)胞后同樣收集細(xì)胞混懸液，合并細(xì)胞上清液并離心，棄上清液，按照凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)規(guī)定，加入FITC和PI染料并混勻，室溫避光，反應(yīng)20 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況[8]。

種細(xì)胞條件同上，不同濃度JXS 水提液刺激24 h后，收集懸浮和貼壁細(xì)胞，按照周期檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)規(guī)定，預(yù)冷PBS洗1次，70%乙醇固定，4℃過(guò)夜，染色前預(yù)冷PBS洗去固定液，加入100 μL RNase A，37℃ 30 min，再加入500 μL PI染色液并充分混勻，4℃避光放置30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化[9]。

2.6 ROS/Superoxide染色

種細(xì)胞條件同“2.3”項(xiàng)下，加藥刺激結(jié)束后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，加入ROS和Superoxide檢測(cè)試劑孵育30 min，Hank’s液200 μL每孔洗2次，最終每孔加100 μL Hank’s液，在熒光顯微鏡下觀察并拍照（綠色染色代表ROS，橙色或紅色染色代表Superoxide）。采用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)ROS（490 /525 nm）和Superoxide（550 /620 nm）水平，統(tǒng)計(jì)并分析[10]。

2.7 Western blot分析

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期ECA-109細(xì)胞，2×105/孔（含1%血清的1640培養(yǎng)基）接種于12孔板內(nèi)，換液加藥，細(xì)胞刺激結(jié)束后采用強(qiáng)RIPA（含蛋白酶和磷酸酶抑制）提取蛋白，高速離心10 min，取上清液，蛋白定量并調(diào)平。經(jīng)10% SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗4℃ 過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光試劑顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照。采用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行定量分析[11-13]。

3 結(jié)果

3.1 JXS水提液抑制ECA-109細(xì)胞活性

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度JXS水提液刺激ECA-109細(xì)胞48 h后，從3.9 μg·mL-1開(kāi)始均表現(xiàn)出抑制ECA-109細(xì)胞的活性，31.25～1000μg·mL-1抑制率分別為43.52%、56.14%、75.05%、75.46%、74.86%和74.71%（見(jiàn)圖1A）（P＜0.01），125 μg·mL-1抑制率為75.05%，是最有效的濃度，因此，選擇125 μg·mL-1分析其時(shí)間依賴性；JXS 水提液125 μg·mL-1刺激ECA-109細(xì)胞不同時(shí)間，結(jié)果顯示從12 h開(kāi)始表現(xiàn)出抑制細(xì)胞的活性（P＜0.05），24 h和48 h 抑制率分別為30.61%、70.21%（見(jiàn)圖1B）（P＜0.01），表明JXS水提液顯著抑制ECA-109細(xì)胞活性且呈劑量和時(shí)間依賴性。

圖1 JXS水提液對(duì)ECA-109細(xì)胞活性的影響（±s，n＝4）Fig 1 Effect of JXS aqueous extract on the ECA-109 cell viability（±s，n＝4）

3.2 JXS水提液誘導(dǎo)ECA-109細(xì)胞凋亡

顯微鏡下觀察250 μg·mL-1JXS水提液刺激ECA-109細(xì)胞不同時(shí)間后的形態(tài)學(xué)變化，與對(duì)照組相比較，JXS水提液刺激后的細(xì)胞體積縮小并變圓，細(xì)胞間連接消失，與周圍的細(xì)胞脫離，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)該特征細(xì)胞逐漸增加，到48 h基本全部發(fā)生變化（見(jiàn)圖2A）。Hoechst染色結(jié)果顯示，JXS水提液250 μg·mL-1刺激ECA-109細(xì)胞不同時(shí)間（6、12、24、48 h），細(xì)胞核發(fā)生固縮、變形和碎裂，核的形狀出現(xiàn)月牙狀或碎裂成若干塊，與對(duì)照組細(xì)胞核的均勻藍(lán)色相比發(fā)白發(fā)亮，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞核的這種變化不斷加劇，初步證明JXS水提液誘導(dǎo)ECA-109細(xì)胞凋亡呈時(shí)間依賴性（見(jiàn)圖2B）。給予JXS水提液不同濃度24 h刺激ECA-109細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)從31.25μg·mL-1開(kāi)始少量細(xì)胞核出現(xiàn)凋亡形態(tài)，62.5μg·mL-1大量增加，125和250 μg·mL-1細(xì)胞核基本出現(xiàn)凋亡特征，且數(shù)量急劇減少（見(jiàn)圖2C），推測(cè)細(xì)胞進(jìn)入凋亡后期細(xì)胞核碎裂，并發(fā)生自溶，因此細(xì)胞核大量減少，表明JXS水提液誘導(dǎo)ECA-109細(xì)胞凋亡呈劑量依賴性。

圖2 JXS水提液對(duì)ECA-109細(xì)胞形態(tài)（A）和細(xì)胞核Hoechst染色（B和C）的影響（±s，×400）Fig 2 Effect of JXS aqueous extract on the ECA-109 cell morphology（A）and nucleus Hoechst staining（B and C）（±s，×400）

流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI 雙染法檢測(cè)結(jié)果顯示JXS水提液刺激ECA-109細(xì)胞24 h后，不同濃度JXS水提液引起細(xì)胞膜內(nèi)磷酯酰絲氨酸蛋白外翻染色陽(yáng)性而細(xì)胞核碘化丙啶染色陰性的細(xì)胞數(shù)分別為27.8%、30.9%、40.7%、47.5%（見(jiàn)圖3A），說(shuō)明JXS水提液隨著濃度的增加，誘導(dǎo)ECA-109細(xì)胞凋亡的數(shù)量也隨之增多，進(jìn)一步證明JXS水提液誘導(dǎo)ECA-109細(xì)胞凋亡。Western blot分析凋亡通路的關(guān)鍵蛋白，發(fā)現(xiàn)JXS水提液刺激ECA-109細(xì)胞24 h，隨著JXS水提液濃度的增加，Caspase-3的表達(dá)降低（P＜0.01），Cleaved-Caspase-3蛋白水平升高（見(jiàn)圖3B～3D）（P＜0.05，P＜0.01），說(shuō)明JXS水提液?jiǎn)?dòng)Caspase-3介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路誘導(dǎo)ECA-109細(xì)胞凋亡。

圖3 JXS水提液對(duì)ECA-109細(xì)胞凋亡（A）及相關(guān)蛋白表達(dá)（B）的影響（±s，n＝3）Fig 3 Effect of JXS aqueous extract on the ECA-109 cell apoptosis（A）and related protein expression（B）（±s，n＝3）

3.3 JXS水提液阻滯ECA-109細(xì)胞周期在G2/M期

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低濃度JXS水提液31.25 μg·mL-1刺激ECA-109細(xì)胞24 h后，G0/G1期細(xì)胞數(shù)量大幅度減少（P＜0.01），S期細(xì)胞基本不變，G2/M期細(xì)胞顯著增加（見(jiàn)圖4A～4C）（P＜0.01），證明JXS水提液將ECA-109細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。

圖4 JXS水提液對(duì)ECA-109細(xì)胞周期的影響（±s，n＝3）Fig 4 Effect of JXS aqueous extract on the ECA-109 cell cycle（±s，n＝3）

3.4 JXS水提液誘導(dǎo)ECA-109細(xì)胞ROS/Superoxide水平升高

ROS/Superoxide染色結(jié)果見(jiàn)圖5，由圖5可知，JXS水提液刺激ECA-109細(xì)胞3 h時(shí)ROS水平在125和250 μg·mL-1少量升高（P＜0.01），6 h時(shí)在62.5、125和250 μg·mL-1均顯著升高（P＜0.01），綠色ROS陽(yáng)性染色也得出一致的結(jié)果；Superoxide檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，JXS水提液刺激ECA-109細(xì)胞3 h時(shí)，Superoxide水平基本無(wú)差異，6 h時(shí)在62.5、125和250 μg·mL-1均顯著升高（P＜0.01）。提示ROS水平從3 h時(shí)觸發(fā)，到6 h時(shí)大量升高，Superoxide水平在6 h顯著升高。綜上表明，JXS水提液刺激ECA-109細(xì)胞6 h后誘發(fā)氧化應(yīng)激。

圖5 JXS水提液對(duì)ECA-109細(xì)胞ROS/Superoxide水平的影響（±s，n＝4，×100）Fig 5 Effect of JXS aqueous extract on the ROS/Superoxide level in ECA-109 cell（±s，n＝4，×100）

3.5 JXS 水提液降低Nrf2蛋白的表達(dá)

Western blot蛋白分析結(jié)果顯示，不同濃度JXS水提液刺激ECA-109 6 h后Nrf2的表達(dá)逐漸降低（見(jiàn)圖6，P＜0.05，P＜0.01），而Nrf2是細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的關(guān)鍵蛋白，降低Nrf2水平會(huì)削弱細(xì)胞的抗氧化能力，提示JXS水提液可能是通過(guò)降低Nrf2蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。

圖6 JXS水提液對(duì)ECA-109細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝4）Fig 6 Effect of JXS aqueous extract on the Nrf2 protein expression in ECA-109 cell（±s，n＝4）

4 討論

本研究初步揭示了金星散抗食管癌的作用及機(jī)制，發(fā)現(xiàn)JXS水提液可誘導(dǎo)ECA-109細(xì)胞凋亡，且呈時(shí)間和劑量依賴性，并將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期；JXS水提液誘導(dǎo)ECA-109細(xì)胞氧化應(yīng)激繼而下調(diào)Nrf2蛋白的表達(dá)。其抗食管癌ECA-109細(xì)胞的作用，與下調(diào)Nrf2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激有關(guān)。

細(xì)胞凋亡通常不會(huì)引發(fā)宿主炎癥或免疫反應(yīng)，因此，選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是潛在的治療方法[10，14-16]。Caspase家族蛋白在凋亡信號(hào)通路中起到關(guān)鍵的作用，起始Caspases蛋白（Caspase-8、Caspase-9及Caspase-10）觸發(fā)凋亡程序，效應(yīng)Caspases（Caspase-3、Caspase-6及Caspase-7）引起凋亡發(fā)生[17-18]。Caspase-3活化是細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)志之一，Caspase-3被切割活化后成為Cleaved-Caspase-3，兩者此消彼長(zhǎng)[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)JXS水提液引起Caspase-3水平下降，Cleaved-Caspase-3水平升高；Hoechst染色表明JXS水提液刺激后細(xì)胞核發(fā)生皺縮和碎裂，體現(xiàn)出凋亡的細(xì)胞核典型特征，流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了JXS水提液抗人食管癌ECA-109細(xì)胞的作用。然而，金星散在體內(nèi)是否仍具有抗食管癌或其他腫瘤的作用，需要進(jìn)一步的研究來(lái)揭示。

細(xì)胞周期是指細(xì)胞從第一次分裂結(jié)束產(chǎn)生新細(xì)胞到第二次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過(guò)程[21]。腫瘤發(fā)生時(shí)，腫瘤細(xì)胞周期失調(diào)并無(wú)限增殖，阻滯細(xì)胞周期是抗腫瘤治療的有效手段之一[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，只有低質(zhì)量濃度31.25 μg·mL-1JXS水提液將ECA-109細(xì)胞阻滯在G2/M期，62.5μg·mL-1G2/M期阻滯作用較低，而125和250μg·mL-1與對(duì)照細(xì)胞的周期狀態(tài)基本一致（數(shù)據(jù)未顯示）?？梢?jiàn)，JXS水提液在低濃度時(shí)可一定程度地阻滯ECA-109細(xì)胞的周期，當(dāng)濃度增大時(shí)JXS水提液較大程度地抑制或者直接阻遏了細(xì)胞的增殖。

Nrf2作為調(diào)控抗氧化應(yīng)激的一種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在誘導(dǎo)機(jī)體的抗氧化應(yīng)答中起著重要作用[23]。正常情況下，氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，Keap1發(fā)生構(gòu)象變化而失活，解離的Nrf2聚集在細(xì)胞核中，激活下游的抗氧化酶，發(fā)揮抗氧化作用[24-27]。在腫瘤細(xì)胞中，Nrf2通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞代謝的重新編程加速腫瘤細(xì)胞增殖，有助于腫瘤的惡性表現(xiàn)，減少Nrf2激活將有助于腫瘤的治療[28]。研究發(fā)現(xiàn)JXS水提液在加藥刺激6 h后引起ECA-109細(xì)胞ROS/Superoxide水平顯著升高，Nrf2的表達(dá)水平顯著降低，提示JXS水提液通過(guò)下調(diào)Nrf2，降低ECA-109細(xì)胞的抗氧化能力，這可能是其觸發(fā)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)ECA-109細(xì)胞凋亡的原因。

綜上，金星散具有抗人食管癌細(xì)胞的作用，推測(cè)其機(jī)制與下調(diào)Nrf2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激有關(guān)。