葛根芩連湯聯(lián)合益生菌對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道菌群及相關(guān)炎癥因子的影響

李子伊，李淋雨，張紫園，邱宇，趙飛，戴敏，常艷，4*（.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，合肥 300；.益諾思生物技術(shù)南通有限公司，江蘇 南通 633；3.南通市海門長三角藥物高等研究院，江蘇 南通 633；4.上海益諾思生物技術(shù)股份有限公司，上海 003；5.江西中醫(yī)藥大學，南昌 330004）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種造成結(jié)腸損傷的非特異性慢性炎癥性疾病，在我國的發(fā)病率逐年升高，受到廣泛的關(guān)注。目前，普遍認為其發(fā)病機制涉及遺傳[1]、腸道屏障受損[2]、免疫系統(tǒng)失調(diào)[3]、腸內(nèi)微生物等因素[4]?，F(xiàn)代臨床用藥主要為氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑[5]、生物制劑[6]等，但這些藥物均存在不同程度的不良反應，導致患者依從性較差[7]。UC在中醫(yī)上屬“泄瀉”的范疇，此外還有“腹痛”“腸病”“久痢”等說法，總體病機可概括為脾虛濕盛，腸腑濕熱蘊結(jié)[8-11]。主治協(xié)熱下利的經(jīng)典名方葛根芩連湯（Gegen Qinlian decoction，GQD）越來越多地應用于腸道疾病的臨床治療中。該方由葛根、黃芩、黃連與炙甘草4味中藥相互配伍組成，既清熱化濕，又補氣益脾[12]。現(xiàn)代藥理研究表明，GQD具有抗炎和抑菌作用，其多種活性成分如黃芩苷、甘草黃酮、小檗堿等，能顯著減輕炎癥和氧化應激[13-16]。該方對UC的治療作用主要體現(xiàn)在控制疾病活動度、減輕相關(guān)炎癥因子的表達、調(diào)節(jié)腸道菌群失衡等方面[17-19]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群的變化也是UC的疾病表現(xiàn)之一，表現(xiàn)為菌群多樣性及豐富度及有益菌水平降低，條件致病菌水平增加，進而導致腸道炎癥反應加劇[20-23]。因此在用藥的基礎上合理地補充腸道有益菌，調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡，也逐漸成為治療UC的新思路。

臨床研究表明，GQD結(jié)合益生菌進一步控制UC患者的臨床癥狀，在促進腸道黏膜愈合、逆轉(zhuǎn)炎癥反應、調(diào)節(jié)腸道菌群失衡等方面有一定的優(yōu)勢[24-26]。本文應用GQD聯(lián)合益生菌對UC小鼠模型相關(guān)炎癥因子的表達以及腸道菌群的變化進行研究，揭示聯(lián)合用藥對腸道的保護作用，以期為后續(xù)的疾病治療及藥物研究提供參考。

1 材料

1.1 動物

45只6～8周齡SPF級健康雄性C57BL/6小鼠，體重（20±2）g [浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（浙）2020-0002]。所有動物均在光暗循環(huán)的SPF級動物房中飼養(yǎng)，溫度20～25℃，濕度40%～70%，自由攝食飲水。本研究經(jīng)益諾思生物技術(shù)南通有限公司動物護理和使用委員會（IACUC）批準，批準號為IACUC-2023-m-135a。

1.2 試藥

葛根、黃芩、炙甘草（廣東匯群中藥飲片股份有限公司），黃連（康美藥業(yè)股份有限公司），以上中藥飲片由安徽中醫(yī)藥大學方清影主任鑒定為正品，符合2022年版《中國藥典》規(guī)定。美沙拉嗪腸溶片（德國Losan Pharmma GmbH）；益生菌（上海信誼制藥總廠）；葡聚糖硫酸鈉（美國MP Biomedicals）；蘇木精-伊紅（HE）染色劑（武漢塞維爾生物科技有限公司）；便隱血試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）；白細胞介素（IL）-6、IL-10、腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所）；MagPure Soil DNA LQ試劑盒（廣州美基生物科技有限公司）；Qubit dsDNA Assay試劑盒（美國Life Technologies）；Tks Gflex DNA 聚合酶（日本Takara）。

1.3 儀器

高速冷凍離心機、分光光度計[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；超純水儀（美國默克公司）；正置白光拍照顯微鏡（日本尼康公司）；電子天平（上海天美天平儀器有限公司，精度：0.0001 g）；酶標儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]；PCR儀（美國伯樂公司）；電泳儀、凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）；生物分析儀（美國安捷倫公司）。

2 方法

2.1 模型建立、分組與給藥

適應期結(jié)束后，除正常組外，余小鼠均采用反復周期性自由飲用3%的葡聚糖硫酸鈉（DSS）溶液的方法進行造模[27]。即將3 g DSS以100 mL水溶解完全，得到3% DSS溶液使小鼠自由飲用連續(xù)7 d，每隔3日更換新的溶液，再換成正常飲用水飲用7 d，此為一個循環(huán)[28]，依次進行4個循環(huán)共56 d，見圖1。從給予DSS的前1日開始以及造模期間每周2次測量小鼠體重、觀察糞便情況、參照糞便隱血試劑盒說明書檢測隱血情況并進行疾病活動指數(shù)（DAI）評分[29]。

圖1 造模及治療周期Fig 1 Modeling and treatment cycle

造模第35日根據(jù)DAI評分，剔除掉造模失敗小鼠，即評分低于1分的小鼠。整個實驗共分為7組，正常組（Normal）、模型組（Model）、美沙拉嗪組（Mes）各5只，益生菌組（Probiotics）、益生菌聯(lián)合GQD低劑量組（GQD L＋Probiotics）、益生菌聯(lián)合GQD中劑量組（GQD M＋Probiotics）、益生菌聯(lián)合GQD高劑量組（GQD H＋Probiotics）各6只，于實驗第36日灌胃給藥。GQD依據(jù)原方及相關(guān)文獻研究的煎煮方式[30]，以5∶3∶3∶2的比例進行煎煮。所有藥材均加入8倍量雙蒸水浸泡，葛根先浸泡30 min，先武火煮沸后轉(zhuǎn)小火繼續(xù)煎煮20 min，再加入已浸泡30 min的剩余諸藥，煮沸后繼續(xù)煎煮30 min，三層紗布過濾后再加水復煎，合并兩次所得濾液，濃縮成2.54、5.08、10.16 g·kg-1的低、中、高劑量的藥液灌胃；益生菌用雙蒸水配制成0.3 g·kg-1藥液灌胃，聯(lián)合給藥組于中藥方劑給藥1 h后灌胃益生菌；美沙拉嗪腸溶片用雙蒸水配制成0.6 g·kg-1藥液灌胃。正常組及模型組灌胃等量生理鹽水，各給藥組均給藥21 d。

2.2 結(jié)腸長度測量及HE染色

動物采血結(jié)束后立即沿腸系膜縱軸剪開腸腔，迅速剖取盲腸至肛門段的腸組織，用冰生理鹽水沖洗污物，記錄長度，收集腸道中的糞便置-80℃冰箱中備測，將腸組織置于10%中性福爾馬林中固定，進行常規(guī)HE染色。將固定的結(jié)腸組織脫水、包埋、切4 μm厚片，隨后依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、75%酒精中脫蠟水化，經(jīng)蘇木素染液染3～5 min、分化、返藍、流水沖洗，進行梯度酒精脫水后放入伊紅染液中染色5 min，采用中性樹膠封片，用顯微鏡觀察并采集圖像分析。依據(jù)結(jié)果進行結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）評分[31]。

2.3 ELISA法檢測血清中炎癥因子IL-6、IL-10、TNF-α的表達情況

動物安樂死后，立刻心臟采血，靜置1 h后4℃、3000 g離心5 min，收集血清。采用ELISA試劑盒說明書的方法配制標準曲線、加樣、加入生物素抗原工作液、孵育、洗板、加入親和素工作液、洗板、加入顯色液及中止液最后采用酶標儀讀取各樣本OD值，檢測各組血清炎癥因子的表達情況。

2.4 腸道菌群16S rRNA測序

末次給藥結(jié)束后收集小鼠糞便樣品，對樣本的基因組DNA進行提取。利用分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度，將提取的DNA置于-20℃?zhèn)錅y。以提取的基因組DNA為模板，選擇16S rRNA基因的V3-V4區(qū)作為擴增和測序的目的區(qū)間，正向引物為343F：TACGGRAGGCAGCAG，反向引物為798R：AGGGTATCTAATCCT，進行PCR擴增，取純化過的擴增產(chǎn)物進行Qubit定量，調(diào)整濃度進行測序。采用Illumina NovaSeq 6000測序平臺，進行樣本2×250 bp雙端測序與分析，經(jīng)過引物剪切、質(zhì)量過濾、降噪、拼接、去嵌合體等質(zhì)控分析后。使用QIIME2軟件、R軟件、q2-featureclassifier軟件等對測序結(jié)果進行alpha多樣性、beta多樣性、菌群結(jié)構(gòu)組成等分析。

2.5 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)均采用SPSS 26.0軟件進行分析，以±s表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析ANOVA，組間兩兩比較采用LSD值進行檢驗，P＜0.05表明差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 聯(lián)合用藥對UC模型小鼠體重、DAI評分及結(jié)腸長度的影響

隨著給藥天數(shù)的增加，與Model組相比，Mes組、Probiotics組和3個劑量的聯(lián)合給藥組體重均呈恢復趨勢，Mes組及GQD H＋Probiotics組體重恢復趨勢最為顯著；給藥結(jié)束后，與Normal組相比，Model組DAI評分升高，結(jié)腸長度縮短（P＜0.01）；與Model組相比，各給藥組DAI評分均降低；同時Mes組及聯(lián)合給藥各組均恢復了結(jié)腸長度（P＜0.01）。Probiotics組有促進結(jié)腸長度恢復趨勢，見圖2。

圖2 給藥期間小鼠體重（A）、DAI評分變化（B）及治療后各組結(jié)腸長度（C）的比較Fig 2 Changes in body weight（A）and DAI score（B）during the administration and colon length（C）in each group

3.2 聯(lián)合用藥恢復UC模型小鼠組織病理學損傷

各組結(jié)腸HE染色結(jié)果顯示，Normal組小鼠腸組織各層結(jié)構(gòu)清晰，黏膜層上皮細胞形態(tài)正常，固有層腸腺數(shù)量豐富且排列緊密，肌層肌細胞排列規(guī)則、形態(tài)正常，未出現(xiàn)明顯的炎性變化。與Normal組相比，Model組小鼠腸組織可見大面積糜爛，黏膜層結(jié)構(gòu)消失，固有層腸腺壞死、結(jié)構(gòu)消失并伴大量炎癥細胞浸潤（黑色箭頭所示），肌層結(jié)構(gòu)較為松散，CMDI評分升高。與Model組相比，Mes組及聯(lián)合給藥各組固有層腸腺結(jié)構(gòu)恢復較好，僅有小面積炎性細胞浸潤，偶見上皮細胞壞死脫落，肌層結(jié)構(gòu)規(guī)則，GQD M＋Probiotics組和GQD H＋Probiotics組的恢復效果較為顯著，CMDI評分降低；而Probiotics組腸腺結(jié)構(gòu)有所恢復但仍存在中度炎性細胞浸潤的情況，CMDI評分高于聯(lián)合給藥組，見圖3。

圖3 各組結(jié)腸HE染色（×200）（A）及結(jié)腸病理評分（B）Fig 3 Colon HE staining（×200）（A）and CMDI scoring（B）in each groups

3.3 聯(lián)合用藥降低UC模型小鼠促炎因子的表達、升高抑炎因子的表達

與Normal組相比，Model組小鼠促炎因子IL-6、TNF-α的表達升高，而抑炎因子IL-10表達水平下降。經(jīng)治療后，與Model組相比，各給藥組均顯著下調(diào)促炎因子IL-6、TNF-α的表達，上調(diào)抑炎因子IL-10的表達。GQD M＋Probiotics組對抑炎因子IL-10的上調(diào)作用較其他聯(lián)合給藥組明顯，此外，各聯(lián)合給藥組對其他炎癥因子的表達情況均呈劑量依賴性，且與Probiotics組相比，GQD M＋Probiotics組及GQD H＋Probiotics組對炎癥因子的調(diào)節(jié)程度更為顯著，說明聯(lián)合用藥相較于單獨補充益生菌更能顯著調(diào)整炎癥因子的表達情況，對免疫反應進行干預，見表1。

表1 各組IL-6、IL-10、TNF-α的表達情況(±s，ng·mL-1)Tab 1 Expression of IL-6，IL-10，and TNF-α in each group (±s，ng·mL-1)

表1 各組IL-6、IL-10、TNF-α的表達情況(±s，ng·mL-1)Tab 1 Expression of IL-6，IL-10，and TNF-α in each group (±s，ng·mL-1)

注：與Normal組相比，＊＊P＜0.01；與Model組相比，#P＜0.05，##P＜0.01；與Probiotics組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。Note：Compared with the Normal group，＊＊P＜0.01；compared with the Model group，#P＜0.05，##P＜0.01；compared with the Probiotics group，△P＜0.05，△△P＜0.01.

組別IL-6IL-10TNF-α Normal組47.77±1.80365.76±4.60365.36±4.56 Model組99.34±3.12＊＊256.37±10.04＊＊469.06±10.61＊＊Mes組52.61±6.81##358.70±9.21##430.05±15.71#Probiotics組63.14±5.00##352.23±5.39##388.89±9.55##GQD L＋Probiotics組54.95±3.08##375.75±8.54##366.47±9.86##GQD M＋Probiotics組49.34±1.50##△407.07±12.14##△△358.35±9.53##GQD H＋Probiotics組45.71±1.43##△△395.80±22.98##△340.55±15.81##△

3.4 聯(lián)合用藥調(diào)節(jié)UC模型小鼠腸道菌群的平衡

3.4.1 小鼠腸道菌群alpha多樣性分析 alpha多樣性結(jié)果基于Simpson指數(shù)和Chao1指數(shù)進行分析，兩者分別側(cè)重于群落多樣性和群落豐富度。經(jīng)Simpson指數(shù)稀釋曲線分析得出，隨著測序深度的增加，曲線逐漸趨于水平，說明測序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中絕大部分微生物信息，且Simpson指數(shù)越高，表明群落多樣性越高，由此可見，Probiotics組的群落多樣性較高。Chao1指數(shù)分析圖反映了群落豐富度在組間的差異性，Chao1指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高。與Normal組相比，Model組的群落豐富度降低，而與Model組相比，Probiotics組、Mes組和GQD M＋Probiotics組的群落豐富度明顯升高，見圖4。

圖4 各組小鼠腸道菌群Simpson指數(shù)稀釋曲線圖（A）及Chao1指數(shù)分析圖（B）Fig 4 Simpson index dilution curve（A）and Chao1 index analysis（B）of the intestinal microbiota in each group

3.4.2 小鼠腸道菌群beta多樣性分析 采用主成分分析（PCoA）考察小鼠腸道菌群beta多樣性的差異，即群落組成越相似，反映在圖中的距離越接近。采用unweighted unifrac距離算法進行分析，結(jié)果顯示，Normal組和各給藥組分布于完全不同的象限，說明菌群物種組成出現(xiàn)了顯著變化；Probiotics組與Model組重疊度較大說明菌群物種組成有相似性；而其他給藥組與Model組處于完全不同象限，說明群落物種組成已經(jīng)發(fā)生了明顯變化；GQD M＋Probiotics組及GQD H＋Probiotics組的群落結(jié)構(gòu)分布較為接近且有部分重疊，說明群落物種組成有一定的相似性，見圖5。

圖5 各組小鼠腸道菌群主成分分析Fig 5 Principal component analysis of the intestinal microbiota in each group

3.4.3 門水平腸道菌群組成分析 基于門水平的腸道菌群Heatmap圖分析，各組小鼠腸道差異菌群主要由擬桿菌門（Bacteroidota）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、脫硫桿菌門（Desulfobacterota）、放線菌門（Actinobacteriota）、疣微菌門（Verrucomicrobiota）、彎曲桿菌門（Campilobacterota）、脫鐵桿菌門（Deferribacterota）等組成，見圖6。與UC最具有相關(guān)性的兩個菌門為Firmicutes和Bacteroidota，兩者的比值（F/B）變化被認為與UC疾病活動度相關(guān)[32]，與Normal組比較，Model組的Firmicutes的相對豐度降低，而Bacteroidota的相對豐度升高，Model組F/B下降，表明處于疾病活動期，腸道菌群失衡；與Model組相比，GQD M＋Probiotics組及GQD H＋Probiotics組的Firmicutes的相對豐度升高，而Bacteroidota的相對豐度降低，F(xiàn)/B顯著升高，表明聯(lián)合給藥后促進了腸道菌群恢復穩(wěn)態(tài)，以上差異均有統(tǒng)計學意義。

圖6 各組小鼠腸道菌群基于門水平分析Heatmap圖（A）、腸道中Firmicutes相對豐度（B）、Bacteroidota相對豐度（C）及兩者比值（F/B）分析圖（D）Fig 6 Heatmap of gut microbiota based on phylum level（A），analysis of Firmicutes relative abundance（B）and Bacteroidota relative abundance（C），and F/B ratio in the intestines of mice in each group（D）

3.4.4 屬水平腸道菌群組成分析 基于屬水平的腸道菌群Bar圖分析發(fā)現(xiàn)，各組菌群所包括的菌屬主要為Muribaculaceae、擬桿菌屬（Bacteroides）、毛螺菌屬NK4A136（Lachnospiraceae_NK4A136_group）、另枝菌屬（Alistipes）、普雷沃氏菌屬UCG-001（Prevotellaceae_UCG-001）、梭狀芽孢桿菌屬UGG-014（Clostridia_UCG-014）、Clostridia_vadinBB60_group、Muribaculum、擬普雷沃氏菌屬（Alloprevotella）、羅氏菌屬（Roseburia）、大腸埃希菌屬（Colidextribacter）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、Lachnoclostridium、沙門氏菌屬（Parasutterella）、顫螺菌屬（Oscillibacter）等，見圖7。根據(jù)群落相對豐度表達量分析，與Normal組相比，Model組下調(diào)了Muribaculaceae、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Alistipes、Roseburia、Lactobacillus等有益菌屬豐度，上調(diào)了Bacteroides、Colidextribacter、Clostridia_UCG-014等條件致病菌屬豐度，說明腸道菌群組成結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。經(jīng)給藥治療后，與Model組相比，GQD M＋Probiotics組回調(diào)了Lachnospiraceae_NK4A136_group、Alistipes、Roseburia、Lactobacillus等有益菌屬的豐度，而下調(diào)條件致病菌屬Bacteroides、Colidextribacter、Clostridia_UCG-014等，促進腸道菌群結(jié)構(gòu)恢復。GQD H＋Probiotics組主要上調(diào)Muribaculaceae，兩組均促使腸道菌群恢復穩(wěn)態(tài)，見表2。

表2 各組屬水平腸道菌群的相對豐度(±s，%)Tab 2 Relative abundance of gut microbiota at the genus level in each group (±s，%)

表2 各組屬水平腸道菌群的相對豐度(±s，%)Tab 2 Relative abundance of gut microbiota at the genus level in each group (±s，%)

注：與Normal組相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與Model組相比，#P＜0.05，##P＜0.01；與Probiotics組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。Note：Compared with the Normal group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；compared with the Model group，#P＜0.05，##P＜0.01；compared with the Probiotics group，△P＜0.05，△△P＜0.01.

NK4A136_groupAlistipesRoseburiaLactobacillusBacteroidesColidextribacterClostridia_UCG-014 Normal53.35±0.8516.14±2.32 6.63±0.280.85±0.060.84±0.03 2.45±0.260.63±0.011.03±0.06 Model組37.79±0.20＊＊ 9.53±1.76＊ 1.98±0.30＊＊0.18±0.03＊＊0.65±0.02＊27.24±3.93＊＊1.37±0.05＊＊1.59±0.09＊＊Mes組34.83±1.9012.69±2.82 3.02±0.330.04±0.030.35±0.03##24.52±2.391.20±0.05##0.40±0.06##Probiotics組35.82±2.22 9.96±0.71 9.42±1.69##0.51±0.010.92±0.08##12.48±0.26##1.28±0.030.93±0.20##GQD L＋Probiotics組41.58±0.81 3.48±0.68# 8.60±0.55##0.03±0.000.61±0.0510.87±0.19##0.75±0.01##△△1.52±0.16 GQD M＋Probiotics組26.74±0.5934.52±2.32##△△13.01±1.40##△1.90±0.33##△△0.84±0.07# 6.89±0.07##0.49±0.05##△△0.61±0.19##GQD H＋Probiotics組48.00±1.28##△△ 9.28±1.56 9.62±1.30##0.50±0.090.81±0.06#10.36±0.53##0.54±0.03##△△1.09±0.06#組別MuribaculaceaeLachnospiraceae_

圖7 各組小鼠屬水平腸道群落組成Bar圖Fig 7 Bar plot of the genus level of intestinal community composition in each group

4 討論

UC作為一種免疫介導的消化系統(tǒng)疾病，該病的發(fā)生和發(fā)展對患者的身心將都造成一定影響，病情嚴重者最終會進展成結(jié)直腸癌。在臨床和動物模型研究中，促炎細胞因子的分泌增加以及腸道菌群的紊亂都會對UC的發(fā)生發(fā)展造成一定的影響。本研究通過GQD與益生菌聯(lián)合，從炎癥因子表達及腸道菌群的平衡兩個方面對UC進行干預。實驗研究結(jié)果顯示GQD聯(lián)合益生菌可顯著恢復模型小鼠體重，降低DAI評分，減輕結(jié)腸病理損傷，減少炎性細胞對腸黏膜的浸潤，恢復結(jié)腸長度，調(diào)節(jié)炎癥因子表達，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡等，治療效果優(yōu)于單用益生菌及西藥，聯(lián)合用藥對于UC的治療更具優(yōu)勢性，同時為后續(xù)疾病研究及臨床用藥提供了思路和參考。

UC患者腸道菌群的失衡與炎癥因子的表達是相互影響的，兩者聯(lián)系密切，共同促使UC的病程發(fā)展。研究顯示，多數(shù)UC患者存在腸道內(nèi)環(huán)境紊亂現(xiàn)象，進而引發(fā)的一系列反應表現(xiàn)為：腸道有害菌增加，侵襲腸道黏膜，腸道屏障完整性喪失，細菌抗原易位性增加，破壞腸道黏膜正常功能，刺激腸黏膜發(fā)生炎癥反應，使促炎因子的表達增加，引發(fā)腸道炎癥，而此時腸道加強免疫反應抵御有害菌侵襲又會加劇腸道菌群的紊亂，給腸道環(huán)境造成嚴重負擔[33]。

在UC的發(fā)展過程中有眾多炎癥因子參與，其相互作用，介導細胞間的平衡而影響炎癥的發(fā)展[34-36]。IL-6能介導炎性反應的發(fā)生，可作為UC疾病活動度的決定性影響因素并具有多重免疫調(diào)節(jié)功能[37]。TNF-α可作用于腸黏膜上皮細胞啟動炎癥反應[38]。IL-10可減弱炎癥反應，并抑制由T細胞參與的有關(guān)免疫應答[39]。在本研究中，Model組小鼠血清促炎因子IL-6和TNF-α的表達升高而抑炎因子IL-10表達降低。在腸黏膜病理表現(xiàn)上也出現(xiàn)了大量的炎性細胞浸潤且腸黏膜結(jié)構(gòu)完整性喪失。而聯(lián)合給藥后可顯著回調(diào)促炎因子的過度表達，提高抑炎因子的表達，同時顯著修復腸黏膜病變，表現(xiàn)為炎性細胞浸潤面積降低，恢復腸黏膜結(jié)構(gòu)完整性。結(jié)果表明聯(lián)合用藥可通過改善腸黏膜病變以及炎癥因子的表達保護腸道屏障，藥理作用呈劑量相關(guān)。

從腸道菌群的變化來看，有研究表明，UC患者與正常人相比腸道菌群豐度降低且Firmicutes相對表達量降低而Bacteroidota相對表達量升高即表現(xiàn)為F/B比值降低，表明疾病處于活動期[40]。在本研究中，各組小鼠腸道差異菌門主要由Bacteroidota、Firmicutes、Proteobacteria、Desulfobacterota、Actinobacteriota等組成，Model組結(jié)果顯示F/B比值降低而聯(lián)合給藥組F/B比值顯著提高，調(diào)整了腸道菌群失衡的情況。通過腸道菌群alpha和beta多樣性分析得出Model組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，群落多樣性降低，而聯(lián)合給藥組顯著回調(diào)物種豐富度。從屬水平腸道菌群組成來看，在聯(lián)合給藥后，Muribaculaceae、Lactobacillus、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Alistipes、Roseburia豐度顯著增多，而條件致病菌Bacteroides、Clostridia_UCG-014、Colidextribacter的豐度顯著降低。有研究表明，TNF-α抑制劑治療后能顯著上調(diào)腸道菌群豐富度，增加Firmicutes、Lactobacillus和Roseburia的相對表達量，這些優(yōu)勢菌種能產(chǎn)生短鏈脂肪酸，影響結(jié)腸運動，減輕結(jié)腸炎癥[41]。此外，也有研究證實，IL-6對于條件致病菌Colidextribacter的表達成正相關(guān)，與Lactobacillus的表達成負相關(guān)[42]。在本研究中，聯(lián)合用藥在下調(diào)TNF-α和IL-6的同時促進了上述優(yōu)勢菌群相對表達量的增加，下調(diào)了條件致病菌的表達水平，揭示了腸道菌群與炎癥因子之間的相關(guān)性。

綜上，GQD與益生菌聯(lián)用可有效緩解DSS誘導的UC模型小鼠炎癥反應及腸道菌群失調(diào)狀態(tài)，從而修復腸道損傷，恢復腸道正常功能。本文只在炎癥及腸道菌群層面進行研究，后續(xù)將繼續(xù)對聯(lián)合用藥所觸發(fā)的炎癥通路及相關(guān)蛋白的表達情況進行擴展研究，更好地解釋聯(lián)合用藥的藥理機制，為疾病與藥物治療提供依據(jù)。