STAT3在阿爾茨海默病小鼠認(rèn)知障礙發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制研究

王玨，陳佩弦，何玲，孫逸（中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，南京 211198）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種慢性神經(jīng)退行性疾病，是老年癡呆癥的主要病因，其臨床特征是以記憶力減退為常見(jiàn)癥狀的進(jìn)行性認(rèn)知障礙[1]?！妒澜绨柎暮Ｄ?bào)告》指出，目前全球范圍內(nèi)的AD患者約有5000萬(wàn)名，預(yù)計(jì)到2060年，將增長(zhǎng)到1.38億[2]。AD的兩個(gè)主要組織病理學(xué)標(biāo)志物是細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）和細(xì)胞外的β-淀粉樣蛋白斑塊沉積（β-amyloid protein plaque，SP），分別由過(guò)度磷酸化的Tau（microtubule-associated protein tau，Tau）蛋白和β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）組成[3]。但是，基于清除Aβ或降低過(guò)度磷酸化的Tau蛋白的藥物開(kāi)發(fā)策略屢次失敗[4]。

隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的提高，在對(duì)Aβ假說(shuō)進(jìn)行修正和深入研究的同時(shí)，新的致病假說(shuō)也不斷被提出，其中顱內(nèi)神經(jīng)炎癥已經(jīng)被確定為AD的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素[5]。流行病學(xué)研究顯示，使用非甾體抗炎藥可預(yù)防或減緩AD的進(jìn)程[6]。AD患者腦組織和腦脊液中包含多種促炎介質(zhì)，腦內(nèi)淀粉樣斑塊周?chē)せ畹哪z質(zhì)細(xì)胞增多[7]。近期的研究發(fā)現(xiàn)，信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducers and activators of transcription，STAT3）是炎癥信號(hào)的重要調(diào)節(jié)因子[8]。AD模型病理過(guò)程和AD患者腦中也檢測(cè)到了活化形式的STAT3上調(diào)[9]。STAT3表達(dá)上升伴隨著小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活和增殖，這些反應(yīng)加劇了腦內(nèi)的神經(jīng)炎癥，使腦內(nèi)的病理環(huán)境進(jìn)一步惡化，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致患者的認(rèn)知和學(xué)習(xí)能力進(jìn)一步降低[8]。STAT3的抑制或許可以成為改善AD癥狀的新途徑。

氯硝柳胺（nicolsamide，NIC）是WHO批準(zhǔn)的首選滅螺藥，已在臨床應(yīng)用50余年[10]，主要通過(guò)影響細(xì)胞線粒體、溶酶體以及乳酸脫氫酶等多種細(xì)胞酶的活性，參與細(xì)胞的氧化磷酸化，引起細(xì)胞凋亡和自噬性死亡[11-12]。氯硝柳胺是公認(rèn)的STAT3抑制劑，可抑制巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，在治療腫瘤、細(xì)菌病毒感染、糖尿病、心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)退行性疾病等方面具有潛在的應(yīng)用效果[13]。因此，本研究擬以氯硝柳胺為工具藥，探討STAT3在AD小鼠認(rèn)知障礙發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制。

1 材料

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)、新物體識(shí)別視頻分析系統(tǒng)、Y迷宮、穿梭實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)（北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技有限公司）；Morris水迷宮（上海吉量軟件科技有限公司）；ANY-maze動(dòng)物行為分析系統(tǒng)（美國(guó)Stoelting公司）；腦立體定位儀及適配器、動(dòng)物顱骨鉆（成都泰盟科技）；微量注射泵（保定蘭格恒流泵）；分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器）；渦旋混合器（海門(mén)市其林貝爾儀器制造）；KD-160型電子秤（TANITA公司）；手持組織勻漿器（寧波新芝生物科技）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀）；恒溫孵箱（德國(guó)Heraeus）；酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)）；恒溫磁力攪拌器（江蘇省金壇市榮華儀器）；PHS-25 pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器）；掌上離心機(jī)（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器）；Mini-PROTEAN Tetra手灌膠系統(tǒng)、Mini-PROTEAN Tetra電泳和轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（Bio-Rad）；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（上海天能）；水平搖床（海門(mén)市其林貝爾儀器）；切片掃描儀（濱松）；冰凍切片機(jī)（Leica）。

β-淀粉樣蛋白1-42（Aβ1-42）粉末（Sigma-Aldrich）；單克隆抗體Aβ、Tau和P-Tau（Ser396）（Santa Cruz），PSD95、β-actin、白細(xì)胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α（Proteintech），STAT3、P-STAT3（Tyr705）、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體（Proteintech）；SOD、MDA檢測(cè)試劑盒（南京建成）；GSH試劑盒（Boxbio）；ECL試劑盒（上海雅酶）；HE染色試劑盒（Solarbio）。氯硝柳胺（MedChemExpress，批號(hào)：15718）。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

8周齡SPF級(jí)C57BL/6J雄性小鼠，體重22～25 g [上海必凱科翼生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0006]。飼料和墊料來(lái)自中國(guó)藥科大學(xué)江寧校區(qū)藥學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度22～25℃，相對(duì)濕度50%～70%，自然光線，自由飲水和進(jìn)食。小鼠先適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，再進(jìn)行后續(xù)具體實(shí)驗(yàn)。

36只C57BL/6J雄性小鼠按體重隨機(jī)分為3組，每組12只，分別為模型組（model）、氯硝柳胺給藥組[NIC，25 mg/（kg·d）[14]]、對(duì)照組（control）。模型組和給藥組在適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行雙側(cè)海馬注射Aβ溶液，對(duì)照組注射相同體積的生理鹽水。給藥組灌胃給予氯硝柳胺溶液（溶媒為1%DMSO、4%聚乙二醇、95%生理鹽水），劑量為25 mg/（kg·d）[14]，持續(xù)7 d，對(duì)照組和模型組灌胃相同體積的溶媒。

2.2 小鼠AD模型的建立

2.2.1 Aβ1-42溶液的配制 將凍存的Aβ1-42粉末從冰箱中取出，梯度升溫至室溫，加入適量生理鹽水溶解并超聲10 min，使其終濃度為82 pmol·μL-1，37℃孵育7 d。之后分裝老化好的Aβ1-42寡聚體，于-20℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 小鼠雙側(cè)海馬腦立體定位注射Aβ剪除小鼠后眼角到兩耳間的毛發(fā)，使用75%乙醇消毒表皮后剪開(kāi)頭皮暴露顱骨，棉簽蘸取少量30%過(guò)氧化氫溶液擦拭創(chuàng)面，使得顱骨縫清晰可見(jiàn)。定位坐標(biāo)由小鼠腦立體定位圖譜確定，使用小動(dòng)物顱骨鉆鉆穿顱骨；將打孔后的小鼠于腦立體定位儀上固定，微量進(jìn)樣器與小鼠顱骨鉆孔平面垂直，緩慢勻速進(jìn)針。使用自動(dòng)進(jìn)樣泵緩慢勻速推入5 μL生理鹽水或Aβ1-42溶液。結(jié)束注射后留針90 s，再緩慢完成出針；注射完成后，縫合頭皮，消毒創(chuàng)口。

2.3 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 將小鼠活動(dòng)區(qū)域（50 cm×50 cm×40 cm的敞口箱體）劃分為中央?yún)^(qū)域和四周區(qū)域，將小鼠置于曠場(chǎng)裝置中央，記錄5 min內(nèi)小鼠自由探索活動(dòng)軌跡，評(píng)價(jià)指標(biāo)為活動(dòng)距離和中央?yún)^(qū)停留時(shí)間。

2.3.2 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為適應(yīng)日、訓(xùn)練日和測(cè)試日。第1日為適應(yīng)日，將小鼠放入未放置物體的敞口箱中令其自由活動(dòng)10 min以減少環(huán)境壓力。第2日為訓(xùn)練日，在敞口箱內(nèi)放置兩個(gè)相同物體，置入小鼠令其探索5 min。第3日為測(cè)試日，與第2日過(guò)程相同，只是將其中一個(gè)物體替換成不同的物體。記錄測(cè)試日小鼠對(duì)兩個(gè)物體的探索時(shí)間，即對(duì)舊物體探索時(shí)間（familiar）和對(duì)新物體探索時(shí)間（novel），可由此計(jì)算偏好指數(shù)＝novel/（familiar＋novel），評(píng)價(jià)小鼠對(duì)新物體的好奇程度，大于0.5則視為小鼠更樂(lè)于探索新物體。

2.3.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)周期為6 d，分為空間記憶采集實(shí)驗(yàn)和空間搜索實(shí)驗(yàn)?？臻g記憶采集實(shí)驗(yàn)：每只小鼠依次從四個(gè)入水點(diǎn)背對(duì)池壁置入水池，每次時(shí)間為90 s，全程錄像并記錄游泳軌跡；若小鼠成功站上臺(tái)面超過(guò)10 s則自動(dòng)停止采集，并將第一次碰到臺(tái)面的時(shí)間記為潛伏期。如在90 s內(nèi)未成功登上臺(tái)面10 s，則需人為牽引小鼠至平臺(tái)并使其在平臺(tái)逗留30 s，此時(shí)潛伏期記為90 s。平臺(tái)低于水面1 cm為不可見(jiàn)平臺(tái)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：第6日撤去平臺(tái)，選取目標(biāo)象限對(duì)角象限的入水點(diǎn)將小鼠置于水中，每只小鼠均需完成90 s的游泳并全程記錄軌跡。

2.4 Western blot實(shí)驗(yàn)

將從小鼠海馬和皮層獲得的組織放在含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液中。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)從新鮮組織中提取細(xì)胞蛋白質(zhì)和核蛋白。蛋白樣品用SDS-PAGE凝膠分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用封閉液在室溫下封閉3 h，并與單克隆抗體Aβ1-42，Tau和P-Tau（Ser396），PSD95，β-actin，IL-1β，TNF-α，STAT3，P-STAT3（Tyr705）孵育過(guò)夜，然后將膜與HRP的山羊抗兔抗體和抗小鼠IgG抗體分別在室溫下孵育60 min。使用ECL試劑盒曝光蛋白質(zhì)條帶，并使用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)掃描。通過(guò)灰度分析（ImageJ軟件）定量相對(duì)蛋白表達(dá)水平，并使用β-actin灰度進(jìn)行歸一化分析。

2.5 血清SOD、GSH和MDA水平檢測(cè)

每只小鼠眼眶取血，置于1.5 mL離心管中，室溫條件靜置30 min后，3000 r·min-1離心 10 min獲得血清，根據(jù)相應(yīng)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)分別測(cè)定SOD、MDA和GSH含量。

2.6 蘇木精-伊紅染色法（HE染色）

新鮮取材，經(jīng)固定、石蠟包埋，切片5 μm。蘇木素染液染色2～20 min，蒸餾水洗去浮色。分化液分化10～60 s，純水滴加或浸洗2次，每次3～5 min。置伊紅染液60 s，傾去多余染色液后快速脫水。經(jīng)透明和封片后用掃描儀觀察。

2.7 數(shù)據(jù)分析

Western blot結(jié)果采用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)GraphPad Prism 7.0軟件分析后以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示，進(jìn)行單因素方差分析和多重比較檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用GraphPad Prism 7.0軟件繪圖。

3 結(jié)果

3.1 抑制STAT3改善AD小鼠認(rèn)知功能障礙

3.1.1 抑制STAT3對(duì)AD小鼠自發(fā)活動(dòng)和探索能力的影響 如圖1所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠的總活動(dòng)距離無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但中央?yún)^(qū)停留時(shí)間顯著減少（P＜0.001），表明小鼠呈現(xiàn)明顯的焦慮情緒，且空間探索欲望能力顯著降低。與模型組相比，氯硝柳胺給藥組小鼠的中央?yún)^(qū)停留時(shí)間顯著增加（P＜0.01）。以上研究表明抑制STAT3可以顯著改善AD小鼠的焦慮癥狀，提高其空間探索能力。

圖1 抑制STAT3對(duì)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中AD小鼠的自發(fā)活動(dòng)和探索能力的影響Fig 1 Effect of STAT3 inhibition on spontaneous activity and exploratory ability of mice with Alzheimer’s disease in open field experiment

3.1.2 抑制STAT3對(duì)新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中識(shí)別記憶能力的影響 如圖2A所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠對(duì)舊物體的探索時(shí)間顯著增多（P＜0.01），對(duì)新物體的探索時(shí)間顯著減少（P＜0.01）。同時(shí)如圖 2B所示，模型組小鼠對(duì)新物體的識(shí)別指數(shù)顯著降低（P＜0.01），表明AD模型小鼠存在物體識(shí)別記憶能力缺陷。與模型組相比，氯硝柳胺給藥組小鼠的新物體識(shí)別指數(shù)顯著增高（P＜0.01），以上研究表明抑制STAT3可以顯著改善AD小鼠的物體識(shí)別和記憶能力。

圖2 抑制STAT3對(duì)新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中識(shí)別記憶能力的影響Fig 2 Effect of STAT3 inhibition on recognition and memory ability in New object recognition experiment

3.1.3 抑制STAT3對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響 Morris水迷宮的第1～5日為不可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練期。如圖3A所示，在共計(jì)5 d的定位航行實(shí)驗(yàn)中，各組小鼠游泳速度無(wú)顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明各組小鼠的視力和游泳能力基本一致。圖3B結(jié)果顯示，定位航行1～5 d各組小鼠逃避潛伏期隨著訓(xùn)練時(shí)間的增加而呈現(xiàn)不同程度的縮短。與同時(shí)期對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠潛伏期顯著升高（P＜0.01），而氯硝柳胺給藥組小鼠的逃避潛伏期相對(duì)于模型組顯著降低（P＜0.01），說(shuō)明模型組小鼠存在明顯的空間學(xué)習(xí)記憶障礙，且與STAT3的激活相關(guān)，抑制STAT3后可在一定程度上改善AD小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶障礙。

圖3 抑制STAT3對(duì) Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)中空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響Fig 3 Effect of STAT3 inhibition on spatial learning and memory in Morris water maze test

水迷宮實(shí)驗(yàn)第6日，通過(guò)穿臺(tái)次數(shù)以及目標(biāo)象限停留時(shí)間考察了各組小鼠的空間記憶能力，結(jié)果如圖3C及3D所示。與對(duì)照組相比，模型組小鼠的穿臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間顯著減少（P＜0.001），表明模型組小鼠出現(xiàn)了明顯的空間記憶損害。與模型組相比，氯硝柳胺給藥組小鼠穿臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間均顯著增加（P＜0.01，P＜0.001），說(shuō)明抑制STAT3后可在一定程度上改善AD小鼠的空間記憶能力。

3.1.4 抑制STAT3對(duì)AD小鼠皮層和海馬區(qū)中病理及功能性蛋白表達(dá)影響 如圖4所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠海馬和皮層中Aβ1-42和P-Tau的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01，P＜0.001），而PSD95表達(dá)水平顯著降低（P＜0.001）。與模型組相比，氯硝柳胺給藥組小鼠海馬和皮層中的P-Tau和Aβ1-42表達(dá)量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），而PSD95表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果提示AD的發(fā)生與STAT3的激活有關(guān)，且抑制STAT3能改善AD病理標(biāo)志物的表達(dá)和神經(jīng)元的損傷。

圖4 抑制STAT3對(duì)阿爾茨海默病小鼠皮層和海馬區(qū)中病理及功能性蛋白表達(dá)影響Fig 4 Effect of STAT3 inhibition on pathological and functional protein expression in cortex and hippocampus of mice with Alzheimer’s disease

3.2 抑制STAT3減輕AD小鼠神經(jīng)炎癥

如圖5所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠海馬和皮層中P-STAT3、IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01，P＜0.001），而STAT3的表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異（P＞0.05），表明STAT3在Tyr705的磷酸化水平顯著提高，STAT3被激活后炎癥因子水平顯著提高則表明神經(jīng)炎癥發(fā)生發(fā)展。與模型組相比，氯硝柳胺給藥組小鼠海馬和皮層中的P-STAT3、IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），表明STAT3在Tyr705位點(diǎn)的磷酸化水平顯著降低，STAT3被抑制后炎癥因子水平顯著降低則表明神經(jīng)炎癥的發(fā)生發(fā)展被抑制。結(jié)果提示神經(jīng)炎癥的發(fā)生發(fā)展與STAT3的激活有關(guān)，且抑制STAT3能減輕神經(jīng)炎癥，最終改善AD小鼠的認(rèn)知障礙。

圖5 抑制STAT3對(duì)阿爾茨海默病小鼠皮層和海馬區(qū)中炎癥因子表達(dá)的影響Fig 5 Effect of STAT3 inhibition on the expression of inflammatory factors in cortex and hippocampus of mice with Alzheimer’s disease

3.3 抑制STAT3減輕AD小鼠氧化應(yīng)激

如圖6所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中GSH和SOD含量均顯著降低，MDA含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，氯硝柳胺給藥組小鼠血清中GSH和SOD含量均顯著升高，MDA含量顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果顯示抑制STAT3能夠增加小鼠體內(nèi)抗氧化物質(zhì)的產(chǎn)生。

圖6 抑制STAT3對(duì)阿爾茨海默病小鼠血清中氧化應(yīng)激相關(guān)因子表達(dá)的影響Fig 6 Effect of STAT3 inhibition on the expression of oxidative stress related factors in serum of mice with Alzheimer’s disease

3.4 抑制STAT3治療AD小鼠腦結(jié)構(gòu)損傷且抑制劑氯硝柳胺無(wú)明顯毒性

AD患者的海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)會(huì)隨著疾病發(fā)展出現(xiàn)不同程度的損傷，而病理組織切片可以觀察到這一現(xiàn)象[15]。圖7A顯示，模型組小鼠海馬細(xì)胞數(shù)量減少，并出現(xiàn)形態(tài)學(xué)損傷，但氯硝柳胺給藥組細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)均有不同程度恢復(fù)。給藥后錐體細(xì)胞排列整齊結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞無(wú)明顯腫脹以及數(shù)量增加。這表明抑制STAT3會(huì)改善海馬神經(jīng)結(jié)構(gòu)受損。另外圖7D顯示，氯硝柳胺給藥7 d對(duì)小鼠的心、肝、肺、脾、腎的正常組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響，說(shuō)明其安全性較好。

圖7 抑制STAT3對(duì)改善小鼠腦結(jié)構(gòu)的作用及毒性Fig 7 Effect of STAT3 inhibition on improving brain structure and biocompatibility in mice

4 討論

現(xiàn)代社會(huì)，隨著人口老齡化的增加以及人們生活水平的提高，AD發(fā)病率日益升高[2]。由于認(rèn)知功能障礙發(fā)生的生理機(jī)制復(fù)雜，尋求多靶點(diǎn)治療方案具有相當(dāng)重要的意義。既往研究著眼于SP和Tau蛋白過(guò)度磷酸化兩大假說(shuō)，但接連面臨的難關(guān)驅(qū)使人們尋求更新的治療靶點(diǎn)[16]。神經(jīng)炎癥被證明在AD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到重要作用，同時(shí)有研究表明STAT3通路的激活顯著加劇膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥[17]。這提示以STAT3通路為靶點(diǎn)的藥物可能對(duì)AD有改善作用。STAT3通路的重要作用在于其影響膠質(zhì)細(xì)胞分裂及活化的能力，小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度激活和星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增生都會(huì)加劇顱內(nèi)神經(jīng)炎癥，使得疾病進(jìn)一步惡化[18]。STAT3的主要激活過(guò)程是胞外信號(hào)刺激受體使得偶聯(lián)的JAKs磷酸化，激活的JAKs招募游離的非活性STAT3并使其磷酸化，磷酸化后的STAT3經(jīng)二聚化后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核發(fā)揮作用[19]。抑制STAT3磷酸化能緩解神經(jīng)炎癥，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用，這在神經(jīng)疾病研究領(lǐng)域是一個(gè)有希望的方向，但報(bào)道尚少見(jiàn)[20]。

本實(shí)驗(yàn)選取的工具藥氯硝柳胺是臨床上常用于治療腸道寄生蟲(chóng)病的小分子化學(xué)藥物，近年來(lái)研究表明其具有相當(dāng)?shù)陌踩?、良好的血腦屏障穿透能力以及非糖蛋白P底物的特性，且具有突出的抗炎能力，這讓氯硝柳胺在帕金森病[21]、肌萎縮側(cè)索硬化[20]、腦缺血[14]等中樞神經(jīng)疾病領(lǐng)域展現(xiàn)出不俗的治療潛力[22]，但在AD中鮮有應(yīng)用。此外有報(bào)道氯硝柳胺是通過(guò)抑制STAT3來(lái)控制膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度激活，延緩神經(jīng)炎癥的發(fā)生，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)[20]。因此，本文采用雙側(cè)海馬立體定位注射Aβ1-42建立AD模型小鼠，給予STAT3抑制劑氯硝柳胺，探討STAT3在認(rèn)知障礙發(fā)生發(fā)展中的作用。

首先，在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，可以觀察到抑制STAT3能提高AD小鼠中央?yún)^(qū)停留時(shí)間，這符合正常小鼠探索空曠地帶的天性，表明小鼠的焦慮癥狀和空間探索能力都有所改善；在新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中，觀察到抑制STAT3能讓AD小鼠對(duì)新物體的探索次數(shù)增加，這提示小鼠的識(shí)別能力和記憶能力都有所恢復(fù)；在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，抑制STAT3能降低訓(xùn)練期AD小鼠的逃避潛伏期，提高測(cè)試期AD小鼠的目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿臺(tái)次數(shù)，這說(shuō)明小鼠空間記憶能力的改善。通過(guò)動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)初步證明了抑制STAT3能改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

AD的發(fā)生發(fā)展主要累及腦組織中的海馬及皮層區(qū)域，形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)和Aβ斑塊，造成神經(jīng)元損傷，突觸丟失和功能下降，進(jìn)而引起認(rèn)知記憶障礙[23]。PSD95是一種支架蛋白，該蛋白的表達(dá)水平可以用來(lái)衡量突觸的數(shù)量以及功能[24]。通過(guò)對(duì)各組小鼠皮層及海馬區(qū)組織的分析檢測(cè)我們發(fā)現(xiàn)抑制STAT3能降低Aβ1-42和P-Tau的表達(dá)水平，提高PSD95的表達(dá)水平，這初步證明了抑制STAT3能從蛋白分子層面降低AD小鼠的病理標(biāo)志物，改善突觸功能。

與神經(jīng)炎癥密切相關(guān)的多種細(xì)胞參與了AD的發(fā)展，包括小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和一些外周炎癥細(xì)胞，IL-1β和TNF-α是由這些細(xì)胞分泌的炎癥因子[25]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，STAT3信號(hào)通路與神經(jīng)疾病病理狀態(tài)下膠質(zhì)細(xì)胞的激活和分裂密切相關(guān)，是影響膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)神經(jīng)炎癥的關(guān)鍵因素[26]。因此我們進(jìn)一步利用Western blot對(duì)各組小鼠皮層及海馬組織中IL-1β、TNF-α進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果表明，抑制STAT3能使這兩種炎癥指標(biāo)下調(diào)，這表明抑制STAT3能減輕AD小鼠海馬和皮層的神經(jīng)炎癥。

AD患者腦組織由于長(zhǎng)期處于Aβ斑塊等的刺激，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)物質(zhì)ROS在AD發(fā)病過(guò)程中會(huì)顯著增多并因此激活抗氧化系統(tǒng)[27]。內(nèi)源性抗氧化物是抗氧化系統(tǒng)重要的一環(huán)，其中SOD是其中重要的酶類抗氧化物；MDA是體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，其含量能反映體內(nèi)氧化應(yīng)激水平；GSH是重要的抗氧化劑，其隨著年齡增加出現(xiàn)全身性的表達(dá)下調(diào)，在AD中該變化更為顯著[27]。在臨床治療中，血液指標(biāo)的變化也可以作為AD病癥發(fā)展程度的參考依據(jù)[28]。因此我們利用試劑盒對(duì)各組小鼠血清進(jìn)行了檢測(cè)分析。結(jié)果表明，抑制STAT3能降低MDA的表達(dá)，并且提高SOD和GSH的表達(dá)，這提示抑制STAT3能減輕AD小鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)合組織切片結(jié)果證明，抑制STAT3蛋白的磷酸化，可使STAT3蛋白激活受阻，減緩神經(jīng)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，最終改善AD小鼠的認(rèn)知障礙，但是深入的機(jī)制還需要后續(xù)進(jìn)一步的探索以及驗(yàn)證。目前關(guān)于通過(guò)抑制JAK-STAT3通路從而延緩AD病情進(jìn)展的研究較少，并且臨床上也沒(méi)有類似的藥物。本研究表明STAT3有可能成為藥物開(kāi)發(fā)的新靶點(diǎn)，并為AD的藥物研發(fā)以及在臨床上的應(yīng)用提供新的思路。